CN115058503A - 一种barcode微滴的单细胞测序方法 - Google Patents

一种barcode微滴的单细胞测序方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115058503A
CN115058503A CN202210729616.7A CN202210729616A CN115058503A CN 115058503 A CN115058503 A CN 115058503A CN 202210729616 A CN202210729616 A CN 202210729616A CN 115058503 A CN115058503 A CN 115058503A
Authority
CN
China
Prior art keywords
barcode
sequencing
library
microdroplets
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210729616.7A
Other languages
English (en)
Inventor
方志远
陈国强
罗微
周丹
邓裕华
杜岗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Gencoding Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Gencoding Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Gencoding Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Gencoding Technology Co ltd
Priority to CN202210729616.7A priority Critical patent/CN115058503A/zh
Publication of CN115058503A publication Critical patent/CN115058503A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于单细胞测序方法的技术领域，具体涉及一种barcode微滴的单细胞测序方法，其为基于纳米和微米尺寸的barcode微滴用于单细胞及亚细胞结构的单细胞测序，适合于全长mRNA测序及随机引物法mRNA测序。

Description

一种barcode微滴的单细胞测序方法
技术领域
本发明属于单细胞测序方法的技术领域，具体涉及一种barcode微滴的单细胞测序方法。
背景技术
10X技术是基于液滴捕获的原理，通过液滴包裹单个磁珠和1个细胞，磁珠和细胞发生反应：细胞裂解后释放mRNA，磁珠上的引物尾巴可以做到与mRNA的特异性结合，从而实现捕获的目的。同时通过磁珠引物本身所带有的cell barcode序列和UMI序列，可以对不同细胞的不同转录本做标记区分。因为磁珠上的引物片段携带mRNA序列信息，在它的基础上通过反转录或复制的方式扩增，所有的转录信息便带上了cell barcode、UMI。
BD技术是基于微孔捕获的原理，在微孔中，一个细胞与一个barcode标记的磁珠匹配；细胞裂解，mRNA被磁珠上的barcode序列捕获；然后将捕获了mRNA的磁珠进行回收，并完成cDNA合成、建库和测序；最后通过数据分析，根据barcode序列来区分不同细胞的mRNA序列。
10X技术采用的是液滴捕获的原理，能集单细胞分选、扩增、建库于一体，单细胞的捕获效率可高达65％，并且单个液滴捕获到多个细胞的概率极低，但是使用10x测序只能获得3’端的转录本信息，5’端的信息是丢失的；10X测序对样本的质量要求很高，对于单个样本的细胞起始量要达到105-106个，活细胞数目需要在80％以上。
BD技术是基于微孔捕获的原理，在微孔中利用分子标签对单细胞中的每个转录本进行特异性分子的标记，能实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量，同时每个细胞也会被标记上特异性细胞标签，使得高通量平行建库成为可能。BD测序有着自身特有的单细胞分离技术，单次实验可制备100-10000个单细胞文库。用户可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因上，方便于大幅度降低后续的测序成本。BD技术可以实现多样本混合捕获，微孔板的孔数可高达22万个；具备成像系统，可观察细胞相关信息。但是与10X相比，BD技术存在建库周期长，成本价格高，通量低等缺点。
10X和BD技术不适用于微孔板芯片测序在血小板、外泌体、细菌、病毒或支原体等更微小微滴的单细胞测序。
目前单细胞测序耗材主要被10X和BD垄断，然而两者均基于barcode编码的磁珠体系，磁珠的最大缺陷是单个磁珠上结合的barcode数量有限，为达到有效的测序深度，其体积至少做到30um(barcode上限为106次/磁珠)，而在微孔板芯片测序血小板、外泌体、细菌、病毒、原体和线粒体等体积更小的细胞和细胞器时，相应的磁珠和微孔会更小，而该体积的微球所能偶联的barcode并不能支撑测序所需的深度，因此需要开发体积更小，但是能装载足够多barcode的微滴进行单细胞测序。
因此，开发一种适用于更微小微滴的单细胞测序的方法尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种barcode微滴的单细胞测序方法。
本发明的技术内容如下：
本发明提供了一种barcode微滴的单细胞测序方法，包括如下步骤：
1)barcode微滴制备及特征
1.1)建立barcode微滴
将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库，利用微流控芯片系统分离微滴，包括barcode库1、barcode库2、barcode库3，...，以此类推；
所述barcode库1包括100个细分，为barcode1-1，barcode1-2，...，barcode1-100)；
所述barcode1-1制备出10n个液滴(n＞1)，每个液滴含有不低于106根barcode1-1，同理制备100个细分barcode“1-n”的液滴库(barcode1-1-barcode1-100)，并混合成为液滴库barcode库1，含有10n+2个液滴；
同理，制备其他barcode“N-n”液滴库N，如barcode库2，barcode库3等；
barcode微滴建库的数目取决于检测所需的库容，但大于2，原则是所有库的库容的组合满足测序细胞数量，如测序细胞数为105，则barcode1库×barcode2库×barcode“n”库≥105；
如常规最低检测需求为106，则barcode库1×barcode库2×barcode库3×barcode库n≥106，所以如果只有2个库，则每个微滴库不低于103的库容，即barcode1-1到barcode1-1000和barcode2-1到barcode2-1000。
1.2)微滴制备分离时分别从混合库1以及其后的数个库中取1个液滴，将取出的多个液滴与扩增mix混合形成一个扩增液滴，按照图1进行扩增；
扩增后对产物进行破乳，收集cDNA并进行建库，进行测序和分析；
2)对全长mRNA以及引物mRNA进行建库测序；
步骤2)所述全长mRNA的建库测序包括如下步骤：
将包含多个片段的Barcode用于标记细胞，以及一个与Barcode连接的UMI来标记转录本；
所述Barcode为2～6段的序列组成，优选2-3段，分别为上游Barcode、中间Barcode和下游Barcode；
所述上游Barcode的3’端为3-5个G，用于RACE反转录，5’端为adapter序列，用于连接测序接头；
上游Barcode的序列为：5'-adapter+jjjjjj+GGG-3’；
以3个Barcode为例，所述中间Barcode的3’端为polyT序列，用于mRNA的反转录，5’端为linker；
中间Barcode的序列为：3'-polyT+jjjjjj+linker-5’；
所述下游Barcode3’端为anti-linker，与上一个中间Barcode的linker互补，中间为cell label序列，5’端为UMI序列；
下游Barcode的序列为：5'-nnnnnnnnnnnnnn+jjjjjj+anti-linker-3’。
所述序列中，j为细胞标记核酸序列cell label，n为UMI；
所述UMI由4～10个核苷酸随机排列组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，因此可以计数不同的UMI，最终实现mRNA的计数；
所述Barcode由多个随机碱基构成，其组合方式为4n，根据测序深度决定其序列的长短(即为n)，多个Barcode的组合编码一个细胞，以3个Barcode为例，组合数为4n×4n×4n(Barcode1×Barcode2×Barcode3)，其组合数一般不低于106以满足最低单细胞测序深度需求；
3)利用转座酶法或者随机引物法扩增cDNA得到双链DNA文库，并采用Illumina高通量测序系统进行测序。
本发明的有益效果如下：
本发明的barcode微滴的单细胞测序方法，基于纳米和微米尺寸的barcode微滴用于单细胞及亚细胞结构的单细胞测序，适合于全长mRNA测序及随机引物法mRNA测序。
附图说明
图1为本发明所述的mRNA捕获原理图；
图2为本发明对barcode液滴库的建立示意图；
图3为本发明对单细胞扩增液滴的获取示意图；
图4为实施例1采用转座酶法文库构建基本原理的示意图；
图5为实施例2采用随机引物法文库构建原理的示意图；
图6为实施例2中双barcode建库模式的示意图；
图7为实施例2中双库的混合的示意图；
图8为实施例2中库与细胞混合的示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。
若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1
一种barcode微滴的单细胞测序方法
1)barcode微滴制备及特征
1.1)建立barcode微滴
将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库，利用微流控芯片系统分离微滴，包括barcode库1、barcode库2、barcode库3等，以此类推；
所述barcode库1包括100个细分(barcode1-1，barcode1-2，....，barcode1-100)；
所述barcode1-1制备出104个液滴，每个液滴含有不低于106根barcode1-1，同理制备100个细分barcode1的液滴库(barcode1-barcode100)，并混合成为液滴库barcode库1，含有106个液滴；
同理，制备其他barcode液滴库，如barcode库2，barcode库3等，如图2所示；
1.2)微滴制备分离时分别从混合库1、2、3中取1个液滴，形成一个扩增液滴，如图3所示，然后对扩增液滴按照图1进行扩增；
最后对产物进行乙醇破乳沉淀DNA，清洗后收集cDNA并进行建库，进行测序和分析；
2)对全长mRNA进行建库测序；
将包含多个片段的Barcode用于标记细胞，以及一个与Barcode连接的UMI来标记转录本；
所述Barcode为3段的序列组成，分别为上游Barcode、中间Barcode和下游Barcode；
所述上游Barcode的3’端为3个G，用于RACE反转录，5’端为adapter序列，用于连接测序接头；
上游Barcode的序列为：5'-adapter+jjjjjj+GGG-3’；
所述中间Barcode的3’端为polyT序列，用于mRNA的反转录，5’端为linker；
中间Barcode的序列为：3'-polyT+jjjjjj+linker-5’；
所述下游Barcode3’端为anti-linker，与上一个中间Barcode的linker互补，中间为cell label序列，5’端为UMI序列；
下游Barcode的序列为：5'-nnnnnnnnnnnnnn+jjjjjj+anti-linker-3’。
所述序列中，j为cell label，n为UMI；
所述UMI由4～10个核苷酸随机排列组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，因此可以计数不同的UMI，最终实现mRNA的计数；
所述Barcode由多个随机碱基构成，其组合方式为4n，根据测序深度决定其序列的长短(即为n)，多个Barcode的组合编码一个细胞，组合数为4n×4n×4n(Barcode1×Barcode2×Barcode3)，其组合数一般不低于106以满足最低单细胞测序深度需求；
3)利用转座酶法扩增cDNA得到双链DNA文库，如图4所示，并采用Illumina高通量测序系统进行测序。
实施例2
一种barcode微滴的单细胞测序方法(图6-8)
1)barcode微滴制备及特征
1.1)建立barcode微滴
将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库，利用微流控芯片系统分离微滴，包括barcode库1、barcode库2；
所述barcode库1包括100个细分(barcode1-1，barcode1-2，....，barcode1-1000)；
所述barcode1-1制备出10n个液滴(n≥3)，每个液滴含有不低于106根barcode1-1，同理制备1000个细分barcode1的液滴库(barcode1-barcode1000)，并混合成为液滴库barcode库1，含有10n+3个液滴；
同理，制备barcode2液滴库，如图2所示；
1.2)微滴制备分离时分别从混合库1、2中取1个液滴，形成一个扩增液滴，按照图1进行扩增；
最后对产物进行破乳，收集cDNA并进行建库，进行测序和分析；
2)对全长mRNA以及引物mRNA进行建库测序；
步骤2)所述全长mRNA的建库测序包括如下步骤：
将包含多个片段的Barcode用于标记细胞，以及一个与Barcode连接的UMI来标记转录本；
所述Barcode为2段，分别为上游Barcode(Barcode1)和下游Barcode(Barcode2)；
所述上游Barcode的3’端为3个G，用于RACE反转录，5’端为adapter序列，用于连接测序接头；
上游Barcode的序列为：5'-adapter+jjjjjj+GGG-3’；
所述下游Barcode3’端为polyA序列，用于mRNA的捕获和反转录，中间为celllabel序列，5’端为UMI序列；
下游Barcode的序列为：5'-nnnnnnnnnnnnnn+jjjjjj+AAAAAAA-3’。
所述序列中，j为cell lable，n为UMI；
所述UMI由4～10个核苷酸随机排列组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，因此可以计数不同的UMI，最终实现mRNA的计数；
所述Barcode由多个随机碱基构成，其组合方式为4n，根据测序深度决定其序列的长短(即为n)，多个Barcode的组合编码一个细胞，组合数为4n×4n(Barcode1×Barcode2)，其组合数一般不低于106以满足最低单细胞测序深度需求；
3)利用随机引物法扩增cDNA得到双链DNA文库，如图5所示，并采用Illumina高通量测序系统进行测序。

Claims (9)

1.一种barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)barcode微滴制备及特征
1.1)建立barcode微滴
将barcode微滴分为多个大的液滴库进行建库，利用微流控芯片系统分离微滴，包括barcode库1、barcode库2、barcode库3，…，以此类推；
1.2)微滴制备分离时分别从混合库1以及其后的n个库中分别取1个液滴，n≥1，将取出的多个液滴与扩增mix混合形成一个扩增液滴；
扩增后最后对产物进行破乳，收集cDNA并进行建库，进行测序和分析；
2)对全长mRNA以及引物mRNA进行建库测序：将包含多个片段的Barcode用于标记细胞，以及一个与Barcode连接的UMI来标记转录本；
3)利用转座酶法或者随机引物法扩增cDNA得到双链DNA文库，并采用Illumina高通量测序系统进行测序。
2.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，步骤1)所述barcode库1包括100个细分，为barcode1-1，barcode1-2，....，barcode1-100；
所述barcode1-1制备出10n个液滴，其中n＞1，每个液滴含有不低于106根barcode1-1，同理制备100个细分barcode“1-n”的液滴库barcode1-1-barcode1-100，并混合成为液滴库barcode库1，含有10n+2个液滴；
同理，制备其他barcode“N-n”液滴库N。
3.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，步骤2)所述Barcode为2～6段的序列组成。
4.根据权利要求3所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，所述Barcode为多段的序列组成，分别为上游Barcode以及下游，若为多端Barcode，则中间Barcode含有linker序列，该通过linker序列经过PCR将附近的Barcode进行连接，以3段为例，分别为上游Barcode、中间Barcode和下游Barcode。
5.根据权利要求4所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，所述上游Barcode的3’端为3-5个G，用于RACE反转录，5’端为adapter序列，用于连接测序接头；
上游Barcode的序列为：5'-adapter+jjjjjj+GGG-3’；
所述j为细胞标记核酸序列cell lable。
6.根据权利要求4所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，以3个Barcode为例，所述中间Barcode的3’端为polyT序列，用于mRNA的反转录，5’端为linker；
中间Barcode的序列为：3'-polyT+jjjjjj+linker-5’；
所述j为cell lable。
7.根据权利要求4所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，所述下游Barcode3’端为anti-linker，与上一个中间Barcode的linker互补，中间为cell lable，5’端为UMI序列；
下游Barcode的序列为：5'-nnnnnnnnnnnnnn++jjjjjj+anti-linker-3’；所述n为UMI。
8.根据权利要求7所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，所述UMI由4～10个核苷酸随机排列组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，因此可以计数不同的UMI，最终实现mRNA的计数。
9.根据权利要求1所述的barcode微滴的单细胞测序方法，其特征在于，步骤2)所述Barcode由多个随机碱基构成，其组合方式为4n，根据测序深度决定其序列的长短n，多个Barcode的组合编码一个细胞，以3个Barcode为例，组合数为Barcode1×Barcode2×Barcode3＝4n×4n×4n，其组合数一般不低于106以满足最低单细胞测序深度需求。
CN202210729616.7A 2022-06-24 2022-06-24 一种barcode微滴的单细胞测序方法 Pending CN115058503A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210729616.7A CN115058503A (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一种barcode微滴的单细胞测序方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210729616.7A CN115058503A (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一种barcode微滴的单细胞测序方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115058503A true CN115058503A (zh) 2022-09-16

Family

ID=83203011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210729616.7A Pending CN115058503A (zh) 2022-06-24 2022-06-24 一种barcode微滴的单细胞测序方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115058503A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116072217A (zh) * 2022-11-02 2023-05-05 杭州联川基因诊断技术有限公司 一种单细胞转录组数据可用性处理方法、介质及设备
CN117089599A (zh) * 2023-10-20 2023-11-21 青岛百创智能制造技术有限公司 一种长编码序列微珠及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116072217A (zh) * 2022-11-02 2023-05-05 杭州联川基因诊断技术有限公司 一种单细胞转录组数据可用性处理方法、介质及设备
CN117089599A (zh) * 2023-10-20 2023-11-21 青岛百创智能制造技术有限公司 一种长编码序列微珠及其制备方法
CN117089599B (zh) * 2023-10-20 2024-02-13 青岛百创智能制造技术有限公司 一种长编码序列微珠及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115058503A (zh) 一种barcode微滴的单细胞测序方法
Zhang et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-seq systems
Lu et al. Spatially resolved epigenomic profiling of single cells in complex tissues
CN107873054B (zh) 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备
JP2019528762A5 (zh)
US20180126383A1 (en) Microorganism nucleic acid purification from host samples
CN113604545B (zh) 一种超高通量单细胞染色质转座酶可及性测序方法
CN111808854B (zh) 带有分子条码的平衡接头及快速构建转录组文库的方法
WO2021147069A1 (zh) 基于液滴微流控的单细胞测序及应用
CN116656832A (zh) 一种淡水鱼类线粒体12s通用宏条形码扩增引物及其应用方法
CN105524920A (zh) 用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法
CN112585279A (zh) 一种rna建库方法及试剂盒
JP2013513373A (ja) Ｒｎａ分析方法
CN114875118B (zh) 确定细胞谱系的方法、试剂盒和装置
CN113026112A (zh) 用于构建人单细胞bcr测序文库的试剂盒及其应用
CN113026111A (zh) 用于构建人单细胞tcr测序文库的试剂盒及其应用
CN102409044A (zh) 用于数字基因表达谱的标签及其使用方法
Shin et al. Multiplexed single-cell RNA-seq via transient barcoding for drug screening
US6403316B1 (en) Isolation of cDNA encoding for secreted or membranal proteins
Achanta et al. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol
Dhar et al. Research highlights: microfluidic-enabled single-cell epigenetics
Lorkowski et al. High-throughput analysis of mRNA expression: microarrays are not the whole story
Lee et al. A beginner's guide to single-cell transcriptomics
US20220389411A1 (en) Method and system for integrating morphological characteristics and gene expression of single-cell
Maracaja-Coutinho et al. Transcriptomics at the Single Cell Level and Human Diseases: Opportunities and Challenges in Data Processing and Analysis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination