CN117085009B

CN117085009B - 卡格列净对急性缺血性卒中的治疗作用

Info

Publication number: CN117085009B
Application number: CN202311360328.XA
Authority: CN
Inventors: 刘健; 郑昭旭; 袁芳; 师忠芳; 杨新健; 陈乐瑜
Original assignee: Beijing Tiantan Hospital
Current assignee: Beijing Tiantan Hospital
Priority date: 2023-10-20
Filing date: 2023-10-20
Publication date: 2024-01-30
Anticipated expiration: 2043-10-20
Also published as: CN117085009A

Abstract

本公开提供了卡格列净对急性缺血性卒中的治疗作用，具体为卡格列净在制备用于治疗缺血性卒中、特别是急性大血管闭塞性卒中的药物或组合物中的应用。本公开发现了卡格列净具有通过抑制SGLT‑1和增加ADP/ATP比例激活AMPK，增强神经细胞抗凋亡能力的作用，从而能够用于治疗缺血性卒中。本公开还提供了一种用于治疗缺血性卒中的药物或组合物。

Description

卡格列净对急性缺血性卒中的治疗作用

技术领域

本公开属于生物医学领域，具体涉及卡格列净对急性缺血性卒中的治疗作用。

背景技术

缺血性卒中约占全部卒中类型的80%，有着高死亡率和高致残率，其主要病因是大脑动脉堵塞。急性缺血性卒中是最常见的卒中类型，其治疗窗口期窄，主要的治疗策略为改善脑血循环，例如采用静脉溶栓、血管内治疗、抗血小板、抗凝、降纤、扩容、神经保护等方法。目前，溶栓治疗和血管内机械取栓治疗都对急性缺血性卒中有效。然而，由于以上治疗的适应症较为苛刻，所以不是所有患者都可以从中获益。因此，找到新型且高效的治疗措施迫在眉睫。缺血性卒中有不同的亚型，急性大血管闭塞是引起急性缺血性卒中的常见原因。急性大血管闭塞性卒中是指继发于颈内动脉、大脑中动脉、椎动脉、基底动脉等前后循环大动脉闭塞的缺血性卒中，主要原因包括心源性栓塞、动脉粥样硬化性狭窄和其他原因等。临床上，可以采取控制高血压、减少糖代谢和脂代谢异常等方式对卒中进行预防，但效果不明显。

钠-葡萄糖协同转运蛋白-1/2（SGLT-1/2）是人体内通过钠离子梯度差供能来摄取葡萄糖的重要转运体。SGLT-2抑制剂是以SGLT-2受体为靶点的新型降糖药，也是临床一线用药。这类药物可以选择性抑制肾脏近端小管的SGLT-2受体，阻止肾脏对葡萄糖的重吸收，增强肾脏对葡萄糖的排泄能力，起到改善高血糖的作用。卡格列净、恩格列净、达格列净和厄格列净均是目前广泛应用的SGLT-2抑制剂，并且能够透过血脑屏障。有临床试验证据一致表明这一类抑制剂能够在控制血糖的同时，显著改善心肾结局。但是目前对于卡格列净用于缺血性卒中（尤其是急性缺血性卒中）的治疗未见报道。

发明内容

本公开要解决的技术问题在于提供卡格列净在制备用于治疗缺血性卒中的药物中的应用，以及一种治疗缺血性卒中的方法，尤其是治疗急性缺血性卒中。

为了实现上述目的，本公开提出了如下技术方案：

在本公开的一方面，提供卡格列净在制备用于治疗缺血性卒中的药物中的应用。

在本公开的一实施方式中，所述卡格列净的有效浓度为5~20μM，优选为7.8~10μM，更优选为10μM。

在本公开的一实施方式中，所述药物中还含有重组组织型纤溶酶原激活剂、依达拉奉、胞二磷胆碱、丁基苯肽、普鲁卡因、肝素、氯吡格雷、磺胺类药物、他汀类药物、尿激酶、阿司匹林、氯吡格雷、甲钴胺或谷维素中的一种或多种。其中，所述重组组织型纤溶酶原激活剂包括阿替普酶、替耐普酶、尿激酶或去氨普酶的一种或多种。

在本公开的一实施方式中，所述药物中还含有药学上可接受的载体或辅料。其中，所述辅料包括稳定剂，所述稳定剂选自乳糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、凝胶、纤维素、糖浆、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、滑石粉、硬脂酸镁、磷酸钙、硅酸钙、微晶纤维素、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟基苯甲酸丙酯、矿物油或植物油中的一种或多种。

在本公开的一实施方式中，所述药物的剂型包括注射剂、口服液体剂、悬浮液、乳化液、浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、气雾剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、微囊、微球、纳米粒或脂质体中的一种或多种。其中，所述注射剂包括无菌或灭菌的溶液、水针剂、油针剂或粉针剂。所述口服液体剂型包括溶液剂、糖浆剂、乳剂或混悬剂。所述片剂包括普通压制片、糖衣片、泡腾片、咀嚼片、多层片、植入片、缓释片或控释片。

在本公开的一实施方式中，所述药物的给药方式包括口服和/或静脉递送。

在本公开的一实施方式中，所述缺血性卒中包括急性大血管闭塞性卒中。

在本公开的一实施方式中，所述药物或组合物能够通过卡格列净抑制SGLT-1活性来激活AMPK，或者，通过卡格列净提高细胞ADP/ATP比值来激活AMPK，或者，所述药物或组合物能够通过卡格列净在抑制SGLT-1活性的同时，提高细胞ADP/ATP比值来协同激活AMPK，进而降低神经细胞凋亡水平，实现治疗或预防缺血性卒中。

本公开的又一方面，提供一种治疗缺血性卒中的方法。所述方法包括，在足够长以实现疾病的症状减轻的时间内，对缺血性卒中患者或缺血性卒中的高危人群施用包含有效剂量卡格列净的药物。

在本公开的一实施方式中，缺血性卒中包括急性大血管闭塞性卒中。

在本公开的一实施方式中，卡格列净的有效剂量选自5~20μM，优选为7.8~10μM，更优选为10μM。

在本公开的一实施方式中，上述药物的释放方式包括立即释放、控制释放和持续释放。

在本公开的一实施方式中，所述组合物能达到缺血灶显著减小、神经元损伤显著减轻的治疗效果。

本公开的有益技术效果：本公开通过联合体内MCAO造模与体外OGD/R造模模拟急性大血管闭塞性卒中的病理生理过程，建立了由分子水平-细胞-组织-器官的丰富立体的研究体系，采用多种检测手段对卡格列净能够有效缓解的适应症进行了研究，首次准确证实了卡格列净对缺血性卒中，特别是急性缺血性卒中的治疗作用。从而为卡格列净这一新型降糖药物转用于缺血性卒中的治疗及后续临床药物的开发提供了充分的实验依据。

附图说明

图1为卡格列净治疗可减轻大脑中动脉栓塞大鼠脑缺血再灌注损伤。

图2为卡格列净治疗可降低大鼠MCAO后的细胞死亡。

图3为卡格列净抑制SGLT1在脑缺血的神经元中的表达。

图4为MCAO大鼠脑SGLT1和SGLT2免疫荧光染色。

图5为卡格列净可在HT-22细胞中抑制OGD/R损伤并抑制SGLT1。

图6为卡格列净通过在OGD/R处理后HT-22细胞中抑制SGLT1，减少细胞凋亡并激活AMPK。

图7为卡格列净通过激活HT-22细胞的AMPK来减少OGD/R处理后的细胞凋亡。

具体实施方式

I．定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的医学、分子生物学、细胞生物学、细胞与组织培养、生物化学、微生物学、化学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。

如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。

如本文使用的和除非另作说明，术语“包含”，“包括”，“具有”，“含有”，包括其语法上的等同形式，通常应当理解为开放式且非限制性的，例如，不排除其他未列举的要素或步骤。

术语“SGLT-1/2”（Sodium-dependent glucose transporters 1/2，钠-葡萄糖协同转运蛋白）是人体内通过钠离子梯度差供能来摄取葡萄糖的重要转运体。SGLT-2抑制剂是以SGLT2受体为靶点的新型降糖药，也是临床一线用药。这类药物可以选择性抑制肾脏近端小管的SGLT2受体，阻止肾脏对葡萄糖的重吸收，增强肾脏对葡萄糖的排泄能力，起到改善高血糖的作用。

术语“卡格列净”（Canagliflozin， Cana）是一种降血糖药，主要用于治疗2型糖尿病，是一种SGLT-2抑制剂。

术语“缺血性卒中”又称缺血性脑中风，是指各种脑血管病变所致脑部血液供应障碍，导致局部脑组织缺血、缺氧性坏死，而迅速出现相应神经功能缺损的一类临床综合征，其主要病因是大脑动脉堵塞。缺血性卒中约占全部卒中类型的80%，有着高死亡率和高致残率。缺血性卒中的主要症状为局灶性神经功能缺损，如偏瘫、感觉障碍、失语、共济失调等，也可有头痛、呕吐、昏迷等。缺血性卒中有不同的亚型，急性大血管闭塞是引起急性缺血性卒中的常见原因。

术语“急性大血管闭合性卒中”是指继发于颈内动脉、大脑中动脉、椎动脉、基底动脉等前后循环大动脉闭塞的缺血性卒中，主要原因包括心源性栓塞、动脉粥样硬化性狭窄和其他原因等。

术语“细胞凋亡”（apoptosis）又称“程序性细胞死亡”（Programmed cell death）是一种特殊的细胞死亡，是细胞在特定基因的调控下的一种有序化死亡过程。

术语“AMPK”为AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase），是生物能量代谢调节的关键分子，是研究糖尿病及其他代谢相关疾病的核心。它表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括细胞压力、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质，AMP/ATP比例的升高能也激活AMPK。遗传学和药理学研究表明，AMPK是机体保持葡萄糖平衡所必需的。

术语“有效剂量”指的是足以获得所需的治疗和/或预防效果，例如引起治疗与缺血性卒中关联的病症的量。给药至对象的组合物的量将取决于疾病的类型和严重性以及个体的性质，比如平常健康情况、年龄、性别、体重、民族、局灶神经缺损程度和对药物的耐受力等。所述量还取决于疾病的程度、严重性和类型，以及专业人员(如医师)制定的治疗方案。专业的技术人员将能够根据这些因素和其他因素来确定合适的剂量。所述含有卡格列净的药物还可结合一种或多种其他的治疗化合物、生物药或治疗性分子(如多肽)来给药。例如在本文描述的方法中，卡格列净可以和重组组织型纤溶酶原激活剂、依达拉奉、胞二磷胆碱、丁基苯肽、普鲁卡因、肝素或氯吡格雷等药物联合施用。

术语“药学上可接受的”意指被管理部门例如CFDA(中国)、EMEA(欧洲)和/或FDA(US)和/或任意其它国家管理部门批准用于动物、优选人的。

术语“大脑中动脉栓塞模型”（Middle Cerebral Artery Occlusion， MCAO）是指一种国际上广泛认可的脑缺血模型，其发病机理与人类缺血性脑卒中表现相似，对于制作模拟人脑缺血模型对脑缺血发病机制及药物筛选有重要意义。该模型的经典方法为线栓法：分离暴露颈部血管，从颈外动脉（external carotid artery，ECA）或颈总动脉（commoncarotid artery，CCA）分叉处插入尼龙线，进入颈内动脉（internal carotid artery，ICA），阻断大脑中动脉（Middle Cerebral Artery，MCA）起始端及其所有侧支血液供应，导致大脑中动脉区局灶缺血。

术语“氧糖剥夺/复氧模型”（Oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD/R）是指通过剥夺细胞的营养及氧气供给模拟人体缺血再灌注损伤过程，是目前较为理想的体外实验模型。海马对缺氧的耐受力较差，因此选择海马神经元细胞建立稳定的氧糖剥夺/复氧模型，对于缺血型脑卒中的研究具有重要意义。

术语“HT-22细胞系”是指小鼠HT4细胞系的一种亚克隆，具有海马神经元的特性，是一种永生化的小鼠海马神经元细胞。

II．具体实施方式

在本公开的一方面，提供了卡格列净在制备用于治疗缺血性卒中的药物中的应用。其中，所述缺血性卒中包括但不限于急性大血管闭塞性卒中、心源性脑卒中、小动脉闭塞性脑卒中，以及其它原因（如血管炎、血液病、脑血管畸形、结缔组织病、夹层动脉瘤等）导致的缺血性脑卒中和不明原因的缺血性脑卒中，尤其对于急性大血管闭塞性卒中具有明显的治疗作用。

在本公开的一实施方式中，所述卡格列净的有效浓度为5~20μM，包括但不限于5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM或20μM，优选为7.8~10μM，更优选为10μM。

在本公开的一实施方式中，所述药物还含有以下治疗缺血性卒中的有效组分中的一种或多种：重组组织型纤溶酶原激活剂、依达拉奉、胞二磷胆碱、丁基苯肽、普鲁卡因、肝素、氯吡格雷、磺胺类药物、他汀类药物、尿激酶、阿司匹林、氯吡格雷、甲钴胺和/或谷维素。其中，所述重组组织型纤溶酶原激活剂包括阿替普酶、替耐普酶、尿激酶或去氨普酶的一种或多种。可以理解的是，本领域技术人员或医生能够根据实际用药情况，在合理复配用药原则指导下，在现有的其他具有治疗缺血性卒中的有效组分中选择一种或多种组分，用于辅助或者协同本公开所述的卡格列净组合用药，所述组合用药方式可以是形成同一组合物，也可以是多种组分独立共同给药。

在本公开的一实施方式中，所述药物中还含有药学上可接受的载体或辅料。其中，载体包括微囊、微球、纳米粒或脂质体中的一种或多种。其中，所述辅料包括稳定剂，所述稳定剂选自乳糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、凝胶、纤维素、糖浆、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、滑石粉、硬脂酸镁、磷酸钙、硅酸钙、微晶纤维素、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、丙基羟基苯甲酸丙酯、矿物油或植物油中的一种或多种。

在本公开的一实施方式中，所述药物的剂型包括注射剂、口服液体剂、悬浮液、乳化液、浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、栓剂、气雾剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂中的一种或多种。其中，所述注射剂包括无菌或灭菌的溶液、水针剂、油针剂或粉针剂。所述口服液体剂型包括溶液剂、糖浆剂、乳剂或混悬剂。所述片剂包括普通压制片、糖衣片、泡腾片、咀嚼片、多层片、植入片、缓释片或控释片。

在本公开的一实施方式中，所述药物通过卡格列净降低神经细胞凋亡水平治疗缺血性卒中。经证实的，所述药物降低神经细胞凋亡水平的途径包括但不限于通过卡格列净激活AMPK。经进一步证实的，所述药物激活AMPK的途径包括但不限于单独通过卡格列净抑制SGLT-1，或者，单独通过卡格列净提高细胞ADP/ATP比值，或者，通过卡格列净实现同时抑制SGLT-1和提高细胞ADP/ATP比值来协同激活AMPK。上述所述证实方法包括，在大鼠MCAO模型和小鼠HT-22细胞系OGD/R模型中，通过免疫荧光实验、基因敲除实验、卡格列净与AMPK抑制剂化合物C联合处理实验等证明了卡格列净通过抑制SGLT-1和/或提高细胞ADP/ATP比值激活AMPK，降低神经细胞凋亡水平，从而通过神经保护策略实现治疗缺血性卒中。除此之外，本领域技术人员能够采用其他本领域常用的实验方法来验证本公开所主张的含有卡格列净的药物或者组合物对缺血性卒中发挥药效的分子机制或代谢途径，可以理解的是，由于无法穷举尽调的原因，所述含有卡格列净的药物治疗缺血性卒中还可以通过其他与本公开所述机制相似的、相关的或等同的通路或方式实现，应当合理认为，此类技术方案被涵盖于本公开的保护范围内。

在本公开的一实施方式中，上述药物的施用方式包括口服和/或静脉递送。

本领域技术人员可以理解的是，本公开的实施方式还包括其他施用卡格列净治疗或预防缺血性卒中的方法。

实施例

实施例1：验证卡格列净（Cana）在大鼠MCAO模型和小鼠海马神经元（HT-22细胞系）氧糖剥夺OGD/R模型中对急性大血管闭合性卒中的治疗作用

（一）实验过程

（1）实验动物选择及分组

7~8周龄SPF级Sprague Dawley雄性大鼠(240~270 g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司。按实验需求分为3组：

①A组 Sham组（假手术组）：只将颈总动脉分离出来，不行大脑中动脉栓塞，假手术2小时后，灌胃对应体积的溶剂（10% DMSO和90%玉米油）；

②B组vehicle： MCAO组，大脑中动脉栓塞2小时后，灌胃对应体积的溶剂；

③C组tMCAO模型： MCAO +Cana组，大脑中动脉栓塞2小时后，按Cana（MedChemExpress，上海，溶于10% DMSO和90%玉米油）10mg/kg的剂量灌胃给药。

MCAO模型制作方法：使用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，取颈部正中切口，分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。结扎颈外动脉远端，颈内动脉近侧活结结扎，动脉夹夹闭颈内动脉远侧与颈总动脉。在颈外动脉残端剪小口，线栓经颈总动脉分叉部插入颈内动脉，阻塞大脑中动脉的开口。阻断血流2h后，拔出线栓进行再灌注。假手术组仅分离血管，结扎颈外动脉，不插线栓（动物实验流程如图1中的A所示）。

（2）神经损伤评估办法

24小时后，研究人员按照Longa评分和改良的Garcia评分进行评估。其中，Longa评分标准：无神经功能缺陷（0分），瘫痪侧前爪不能完全伸展（1分），行走时向瘫痪侧转圈（2分），行走时向瘫痪侧倾倒（3分），不能自动行走，存在意识丧失现象（4分）。改良Garcia评分从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、攀爬运动、身体双侧触觉、双侧胡须碰触反应6个方面评估大鼠神经功能损伤的程度。分值为3～18分，数值越大，神经功能损伤越轻，18分为正常，具体评分标准如表1。

表1 改良Garcia评分标准

（3）缺血灶的测量

评估完成后处死大鼠，取出大脑，切取2mm冠状位切片，在37℃恒温箱中用0.5% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC， Sigma，美国)染色20 min，缺血灶TTC染色不显色，然后用ImageJ软件测量其面积：(对侧面积-同侧未缺血面积)/对侧面积×100%。

（4）大脑液体成分分析（干-湿法）

在未进行心脏灌注前，迅速收集脑组织，称量后记录湿重，然后在105℃风干箱中，风干24h，再次称量记录为干重。大脑液体成分百分比为：(湿重-干重)/湿重×100%.

（5）组织病理学检查

苏木精-伊红染色法(HE)和尼氏染色（Nissl）法来确定神经损伤。将脑组织用4%多聚甲醛固定，然后浸入石蜡中，切成5μm切片。接着用二甲苯和梯度乙醇-蒸馏水脱蜡，之后将切片进行HE染色和尼氏（Nissl）染色。所述HE染色步骤为：将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液（上海碧云天生物技术有限公司，C0105S）中染色10分钟，而后经酸水及氨水分色，流水冲洗1小时后，依次浸入70％和90％酒精中脱水各10分钟。再加入酒精伊红染色液（上海碧云天生物技术有限公司，C0105S）染色2~3分钟，染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。所述尼氏染色的步骤为：将组织切片加入尼氏染液（上海碧云天生物技术有限公司，C0117）5 min，水洗，使用1%的冰醋酸分化，而后自来水洗终止反应，再将切片置于烤箱烤干，最后将切片浸入干净的二甲苯中透明 5 min，采用中性树胶透明封片。形态学及病理学改变在显微镜（Olympus，日本）下观察。大脑皮质中的尼氏小体用ImageJ来定量。

（6）氧糖剥夺/复氧模型（OGD/R）和卡格列净治疗

OGD/R模型用HT-22小鼠海马神经元（中乔新舟生物技术公司，上海）模拟大血管闭塞性卒中及再灌注。HT-22细胞在Dulbecco’s modified Eagle medium培养基（DMEM，Gibco，美国）中培养，内含10%牛胎血清（FBS，Sigma，美国），培养环境为温度37°C湿度95%的空气和5%CO₂。对于诱导OGD模型，HT-22细胞在脱氧无糖培养基（Gibco，USA）中培养，并置于低氧孵化箱（95%N₂和5%CO₂)中6 h。之后这些细胞转移至常规含糖DMEM培养基中用不同浓度的卡格列净溶液或者AMPK抑制剂-化合物C（CC，10μM，MedChem Express，上海）培育24h。培育完成后，将HT-22细胞收集用来后续研究。

（7）细胞转染

含有SGLT1靶点(siSGLT1)的小干扰RNA和阴性对照小干扰RNA（NC siRNA）由武汉金开瑞生物工程有限公司设计。用脂质体载体2000（Invitrogen， MA，美国）将siSGLT1或者NC siRNA转染进入HT-22细胞，48h后进行OGD/R治疗。

（8）细胞活性评估

细胞活性采用3-(4，5-二甲基噻唑-2-Yl)-2，5-二苯基四唑溴化物（MTT）试验评估。将5×10³细胞置于96孔平板上，24 h后进行OGD/R。OGD/R治疗后，在每个孔中都添加MTT溶液（北京索莱宝科技有限公司），并培育细胞4 h。随后移除表面液体，并替换为100µlDMSO。用酶标仪（Tecan，瑞士）测量490nm波长下的吸光率。

（9）乳酸脱氢酶（LDH）试验

OGD/R处理后，使用乳酸脱氢酶细胞毒性试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）检测释放出的LDH，并用酶标仪（Tecan，瑞士）测量490 nm波长下的吸光率。

（10）ADP/ATP比率

OGD/R处理后，HT-22细胞中的ADP和ATP水平通过商业试剂盒检测（MAK135，Sigma，美国）。

（11）脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）

使用TUNEL试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司，C1089），按照说明书记载的实验方法检测细胞凋亡情况，并用ImageJ软件计数TUNEL阳性细胞。

（12）Western Blot分析

采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离皮层半暗带和HT-22细胞的蛋白质样品，并将其转移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白（BSA）在室温下阻断膜2小时，然后用抗AMPK的一抗（1:1000， 5832， CST）、抗p-AMPK的一抗（1:1000， Ab133448， Abcam）、抗cleaved caspase-3的一抗（1:50， 9661， CST）、抗SGLT1的一抗（1:1000， 7-1417，Millipore）和抗β-actin（1:1000， 81115-1-RR， Proteintech）的一抗在4°C下孵育过夜。第二天，用二抗孵育膜。利用增强化学发光技术（Biosharp，中国）检测目标蛋白，并利用ImageJ对波段强度信号进行定量分析。

（13）免疫荧光

室温下，将脱蜡脑组织切片在0.1M PBS、5%FBS、和0.3%Triton X-100溶液中浸泡1h。在4℃温度下，将切片依次在NeuN抗体（1:200， ab177487， Abcam）、GFAP抗体（1:200，3670， CST）、SGLT1抗体（1:200， 07-1417， Millipore）或SGLT2（1:200， ab85626， Abcam）抗体中孵化一夜。随后，室温下，样本继续在Alexa Fluor 488-双抗（1:200稀释，用于SGLT1和SGLT2， Millipore）或Alexa Fluor 594-双抗（1:200稀释，用于NeuN和GFAP，Millipore）中孵化2 h。最后用DAPI（4'，6-二脒基-2苯基吲哚）浸染10 min。在显微镜（Olympus，日本）下观察切片。

HT-22细胞：在4℃温度下，将OGD/R治疗后的细胞浸于抗SGLT1抗体中（07-1417，Millipore）孵化一夜。其余步骤同前。

（二）实验结果

（1）卡格列净减轻大鼠的大脑缺血-再灌注损伤

TTC染色试验结果显示MCAO组大脑缺血灶较Sham组大脑缺血灶增加(P＜ 0.0001，图1中的B和 C，其中B为2，3，5-三苯四唑氯（TTC）染色切片的代表性图像，C为梗死体积定量分析结果，实验动物数量n=5)。接受卡格列净治疗后，缺血灶显著减小(P＜ 0.001)。再灌注24h后Longa评分和改良的Garcia评分（n=10）用于评估神经损伤，结果显示，与MCAO模型组对比，卡格列净给药后两项评分明显改善(P＜ 0.05，如图1中的D和E所示)。同时，MCAO造模后大脑脑水肿程度明显加重，而卡格列净治疗能够减轻这一变化(P＜0.01，如图1中的F所示，n=5)。以上结果说明卡格列净能够改善大鼠大脑中动脉栓塞引起的缺血再灌注损伤。

（2）卡格列净减轻MCAO大鼠神经元损伤

HE染色和尼氏染色用于评估各组大鼠的神经元损伤。与Sham组相比，MCAO组HE染色显示大脑皮质有明显的神经元损害，表现为神经元坏死、网状变性以及神经元分布紊乱（如图2中的A所示，比例尺=50μm，n=5）。尼氏染色显示MCAO组大脑皮层尼氏小体减少（P＜0.01，如图2中的A和B所示，n=5）。以上这些病理学异常表现在接受卡格列净治疗后改善（P＜0.05），表明卡格列净减轻大鼠大脑中动脉栓塞引起的神经元损伤。

（3）卡格列净抑制大鼠MCAO诱导的凋亡发生

TUNEL试验和casepase-3表达水平检测用来明确卡格列净对MCAO大鼠细胞凋亡的作用。如图2中的C~F所示，图2中的C中TUNEL为凋亡标记物，图中染色结果为红光，DAPI为细胞核标记物，图中染色结果为蓝光，MERGE为融合的图像，以共定位凋亡标记物。E和F显示的为大鼠右半球casepase-3的代表性免疫印迹，并进行相应的定量分析结果，n=3，*P＜0.05；**p＜0.01，***p＜0.001。结果显示，MCAO造模后TUNEL阳性细胞数量和casepase-3表达水平明显升高，这一变化能够被卡格列净逆转（P＜0.05 和 P＜0.01）。以上结果显示卡格列净能够抑制大鼠大脑中动脉栓塞引起的细胞凋亡。

（4）卡格列净抑制SGLT1在脑缺血的神经元中的表达

为了明确卡格列净神经保护作用的潜在机制，用免疫荧光来检测MCAO大鼠24h后SGLT1和SGLT2在大脑皮质和海马中的表达水平，结果如图3和图4所示。其中，图3的A和C分别为皮质和海马中SGLT1（绿色）、NeuN（红色）的免疫荧光双标染色，比例尺=50μm，n=5。图3的B和D为皮质和海马中SGLT1阳性细胞的百分比，n=5。图3的E和F分别为皮质和海马中SGLT1（绿色）、GFAP（红色）的双免疫荧光双标染色，比例尺=50μm（n=5），***P＜0.001，****P＜0.0001。图4为MCAO大鼠脑SGLT1和SGLT2免疫荧光染色结果。其中A为MCAO大鼠脑SGLT1（绿色）免疫荧光染色结果，比例尺=1000μm。B为MCAO大鼠脑SGLT2（绿色）免疫荧光染色结果，比例尺=1000μm，可以看出，在皮质和海马中几乎检测不到SGLT2的表达，在正中隆起室管膜细胞中检测到SGLT2。由此可见，免疫荧光双染色通过NeuN（神经元标记物）和GFAP（星形细胞标记物）证实SGLT1与NeuN共位表达，而与GFAP染色不共定位，这说明大鼠大脑中动脉栓塞后SGLT1在神经元中的表达增强。而图3中的A~D显示卡格列净能够明显逆转SGLT1在神经元中的表达增高（P＜0.0001 和 P＜0.001）。另外，另一方面，SGLT2在三组中几乎没有在该区域表达（图4中的B）。以上结果说明卡格列通过抑制SGLT1来缓解大鼠大脑中动脉栓塞引起的神经损伤。

（5）卡格列净抑制HT-22细胞中OGD/R损伤

在HT-22细胞中构建OGD/R模型来探究卡格列净在体外的神经保护作用。采用MTT和LDH试验评估细胞活性和细胞毒性。MTT试验显示OGD/R 24h后细胞活性较对照组明显降低(P＜0.0001，如图5的A)。在5~20μM浓度范围下，卡格列净呈剂量依赖性地改善OGD/R后的细胞活性。同时卡格列净能够有效抑制OGD/R造模后LDH的释放(如图5中的B所示)，在5~20μM浓度范围下也具有剂量依赖性。综合细胞活性和LDH释放试验结果，卡格列净的有效剂量（人体内血浆浓度峰值）应当控制在7.8~10μM。本公开选择10μM这一浓度用作后续实验。

（6）卡格列净抑制SGLT1在HT-22细胞中的表达

利用免疫荧光染色来研究体外SGLT1的表达水平，结果如图5中的C和D所示。与对照组相比，OGD/R后SGLT1在HT-22细胞中的表达水平显著增加（P＜0.01，图5中的C和D），卡格列净治疗后其表达水平明显降低（P＜0.01）。图5为卡格列净可在HT-22细胞中抑制OGD/R损伤并抑制SGLT1的实验结果。其中A为MTT法检测细胞活性（n=3）。B为HT-22细胞LDH释放（n=3）。C为OGD/R后SGLT1(绿色)/DAPI(蓝色)共定位的代表性免疫荧光图像。D为SGLT1免疫荧光强度定量分析（n=3）。**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。

（7）卡格列净通过抑制SGLT1来发挥抗凋亡作用

为明确卡格列净神经保护作用是否依赖于SGLT1的抑制，用siRNA敲除HT-22细胞中SGLT1的表达（P＜0.0001，图6中的A和B所示，已经成功敲除了SGLT1）。而后采用TUNEL试验和casepase-3表达水平来检测细胞凋亡，结果如图6中的C~F所示，可以看出，卡格列净能够显著降低OGD/R后TUNEL阳性细胞的数量及casepase-3的表达水平（P＜0.01 和 P＜0.05）。然而，卡格列净不能在SGLT1敲除后的HT-22细胞中发挥抗凋亡作用（P=0.6540 和 P=0.5506）。上述结果说明卡格列净通过抑制SGLT1来发挥抗凋亡作用。

（8）卡格列净通过抑制SGLT1和增加ADP/ATP比值来激活AMPK

SGLT1调节葡萄糖的摄取，而葡萄糖是神经元细胞唯一的能量来源。假设卡格列净能够通过抑制SGLT1影响细胞内能量代谢。AMPK是调节能量代谢最重要的分子，所以本实施例检测了AMPK表达水平。而ADP/ATP比值是调节AMPK活性的最常见因素，因此，也在HT-22细胞中检测其水平。结果如图6中的G~H所示，OGD/R后，HT-22细胞中活化的磷酸化AMPK表达水平以及ADP/ATP比值明显升高（P＜0.001 和 P＜0.0001，图6中的G和H）。卡格列净治疗后，AMPK磷酸化水平、ADP/ATP比值较OGD/R组进一步升高（P＜0.05 和 P＜0.001）。然而，卡格列净不能在SGLT1敲除后的HT-22细胞中发挥这种作用（P=0.4101 和 P=0.3242，图6中的G~H）。以上结果表明卡格列净通过抑制SGLT1和增加ADP/ATP比值来激活AMPK。

图6为卡格列净通过在OGD/R处理后HT-22细胞中抑制SGLT1，减少细胞凋亡并激活AMPK的实验结果。其中A和B显示的为SGLT1的免疫印迹和定量分析。C为HT-22细胞的TUNEL染色，标尺=50μm。D为TUNEL阳性细胞百分比（n=3）。E~G为casepase-3、p-AMPK、t-AMPK的代表性免疫印迹和定量分析结果。H为HT-22细胞ADP/ATP比值（n=3）。*P＜0.05，**P ＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。Ns:无统计学意义。

（9）卡格列净通过激活AMPK发挥抗凋亡作用

为验证卡格列净抗凋亡作用是否受AMPK激活的影响，采用卡格列净和化合物C（AMPK激活过程的变构调节剂）联合处理OGD/R后的HT-22细胞。结果如图7所示，卡格列净能够显著降低OGD/R后TUNEL阳性细胞的数量及活性半胱氨酸蛋白酶-3的表达水平（P＜0.01和 P＜0.05），然而化合物C可以抑制卡格列净的抗凋亡作用（P=0.3349 和 P=0.7335）。上述结果显示卡格列净通过激活AMPK发挥抗凋亡作用。

图7显示的为卡格列净通过激活HT-22细胞的AMPK来减少OGD/R处理后的细胞凋亡的实验结果。其中A为HT-22细胞的TUNEL染色结果。B~D分别为TUNEL阳性细胞百分比（n=3）、免疫印迹和定量分析结果（n=3）。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001。Ns:无统计学意义。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本公开进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各实施例技术方案的范围。

Claims

1.卡格列净在制备用于减小缺血性卒中的梗死体积的药物中的应用，所述缺血性卒中为急性大血管闭塞性卒中；

所述药物的剂型选自口服液体剂、浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、微囊、微球、纳米粒或脂质体中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述卡格列净的有效浓度为5~20μM。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述卡格列净的有效浓度为7.8~10μM。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有另一种治疗缺血性卒中的活性成分或与其他治疗缺血性卒中的药物联用。

5.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的载体或辅料。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物通过卡格列净降低神经细胞凋亡水平治疗缺血性卒中。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物通过卡格列净激活AMPK降低神经细胞凋亡水平。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物通过卡格列净抑制SGLT-1和/或提高细胞ADP/ATP比值激活AMPK。