CN117051171A - 用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明探针利用RNAscope原位杂交的方法，实现了对HEV RNA的快速检测，使用本发明探针HEV‑ORF2‑DIG可对组织样本中戊型肝炎病毒进行高效、准确的检测，且具有灵敏度高、特异性强、适应范围广、操作简便、检测结果准确可靠、检测时间短等优点，适合临床肝脏组织及多种样品的HEV快速检测。

Description

用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，是一种用于检测临床HEV患者组织切片中戊型肝炎病毒的探针，可应用于临床样本及多种组织中戊型肝炎病毒的检测。
背景技术
在1980年代，戊型肝炎病毒首次被认为是导致不明原因急性肝炎流行的原因。至今，戊型肝炎病毒已成为全球范围内急性病毒性肝炎常见的原因之一。
戊型肝炎病毒(HEV)是一种准包膜的单股正链RNA病毒。HEV主要分为8种基因型，其中基因1-4型为人类感染毒株。研究表明HEV基因1型和2型仅感染人类，而基因3型和基因4型可以人畜共患。一般通过食用未煮熟的猪肉和野猪肉感染。并且猪源的HEV可以在BALB/c小鼠体内复制。大多数HEV感染的患者是无症状、自限性的。在一般人群中的死亡率约为0.2％-1％。然而，在妊娠期间，HEV感染可呈暴发性病程，导致暴发性肝衰竭、早产、自然流产和死胎。来自不同发展中国家的研究表明，妊娠期间HEV感染的发生率很高，很大一部分孕妇进展为暴发性肝炎，死亡率高达30％。戊型肝炎病毒肝炎可引起肝脏症状以及多种肝外表现，多种研究证明，胰腺炎、神经系统症状、血液系统疾病以及肾小球肾炎都与HEV感染有关。此外，HEV可以在胎盘、胎膜和脐带中复制，导致胎盘发生严重的组织病理性损伤和炎症反应，并将病毒从母体垂直传播给胎儿。
目前，戊型肝炎病毒(HEV)的感染通常是通过血清学进行流行病学的诊断。尽管检测HEV抗体有助于了解HEV血清阳性率以及现时和既往感染，但一些研究表明，在筛查供体血液制品HEV持续性感染方面缺乏敏感性。IgM在HEV感染早期阶段无法进行检测，只有在感染后2-4周才能短暂检测出，然而这时血液和粪便中的病毒载量已经开始下降。利用动物模型还发现，在HEV持续性感染的恒河猴中并未检测到IgM，因此往往造成感染者的漏诊。虽然在感染后1-6个月在血清中可以检测到HEV IgG抗体，但此时患者已经排毒结束，没有临床诊断价值。因此，仅依靠抗体检测会导致HEV急性感染的患者漏诊，从而错过最佳的治疗时间，并造成环境及密接人群感染。
HEV RNA检测是用来确认血液和器官移植患者中HEV感染的主要方法。HEV RNA检测是目前确认HEV感染的金标准。HEV RNA检测主要包括:常规PCR、实时荧光定量PCR、多重PCR和巢式PCR。然而，在进行HEV RNA检测实验时，我们需要对其gDNA进行提取，提取过程不仅繁琐，而且gDNA在提取过程中会发生不同程度的降解和损失。常规PCR在操作过程中容易污染，只能进行定性分析，而且敏感性较低，在扩增时会存在非特异性扩增，当非特异性扩增的条带和目的条带大小一样时无法进行区分。实时荧光定量PCR尽管在灵敏性上有了大幅度提高，并且可以进行定量分析，但是依然存在各种问题，比如：目的基因发生突变导致漏检、低浓度模板检测结果无法确定、使用标准曲线进行定量检测时误差较大。多重PCR相对于常规PCR具有灵敏性高、特异性强的优点，但是避免不了其易受污染、扩增引物的选择复杂以及实验条件的难以控制等缺点。由于巢式PCR经历过两轮扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性，增加了检测的灵敏性，又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。但是正是由于巢式PCR检测过程的特点，从而增加了每次实验的复杂性，也使得每次实验的时间成本在不断增加。
尽管这些HEV检测方式在随着科技的进步在不断的改善，但是没有应用范围广、操作简便、灵敏度高、特异性强的检测试剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测HEV患者组织切片中戊型肝炎病毒的探针HEV-ORF2-DIG，本发明利用可在组织或细胞中原位检测单一分子RNA的原位杂交技术RNAscope，可实现对HEV患者组织切片中HEV RNA的快速检测；该方法具有特异性强、灵敏度高、适应范围广、操作简便、检测时间短、检测结果准确可靠以及实验结果可视化等优点，有效解决现有检测技术中灵敏度低、漏诊或误诊、单一引物组检测范围窄、假阳性率高的问题，本发明适用于临床以及多种组织样品的针对HEV的快速检测，将其作为金标准，并以血清学抗体检测、RT-qPCR法、血清HEV RNA检测为辅助手段，对HEV感染实现快速准确确诊，有利于临床使用和推广。
本发明用于检测HEV患者组织切片戊型肝炎病毒探针HEV-ORF2-DIG的核酸序列如下：
GGCGTATTAGTGTAGGAATTCACAGGCGACCCATGAATGCAGAGCATAACAAGGCCGGAGGTAGCCTCTTCCTCAGCGACGCC。
本发明目的通过以下方法实现：
1、探针设计
从NCBI上下载不同基因型的HEV RNA全长序列，通过比对选取HEV ORF2上一段83bp的保守序列，并在5’端加上地高辛标记，由擎科生物公司合成探针HEV-ORF2-DIG；
2、样本取材
将感染HEV和未感染HEV的BALB/c小鼠采用颈椎脱臼处死法处死，将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠的整个胸部和腹部，修剪去除腹部毛发，75％酒精擦拭腹部进行消毒；剪开腹膜，暴露腹腔，取出小鼠肝脏和胎盘，置于无菌培养皿中，生理盐水冲洗；
3、组织脱水包埋切片
用4％多聚甲醛固定取出的肝脏和胎盘样品，在室温下固定16-32小时，常规脱水机脱水处理，然后利用石蜡包埋机和切片机制成石蜡切片；
(所述待测样品为空白对照组(MOCK，未感染HEV)和HEV感染不同天数的SPF级BALB/c小鼠的肝组织和胎盘组织)；
4、RNAscope原位杂交检测
使用HEV-ORF2-DIG探针，采用RNAscope原位杂交方法检测空白对照组(MOCK,未感染HEV)和HEV感染不同天数的SPF级BALB/c小鼠肝脏和胎盘组织切片中的HEV；
结果显示HEV-ORF2-DIG探针能特异性检测到感染不同天数的BALB/c小鼠肝脏组织和胎盘组织中HEV RNA的存在。
本发明优点和技术效果如下：(1)灵敏度高；(2)特异性识别HEV RNA；(3)适用于多种组织的石蜡切片；(4)操作简便，检测时间短；(5)检测结果准确可靠。
本发明探针HEV-ORF2-DIG通过利用RNAscope原位杂交的方法，实现了对HEV RNA的快速检测，使用本发明探针HEV-ORF2-DIG可对感染不同天数的组织样本中戊型肝炎病毒进行高效、准确的检测，且具有灵敏度高、特异性强、适应范围广、操作简便、检测结果准确可靠、检测时间短等优点，解决了灵敏度低、漏诊或误诊的问题，适合临床肝脏组织及多种样品的HEV快速检测，其对于临床戊肝早期筛查，指导临床用药，以及为传染源调查工作奠定基础。
附图说明
图1是未怀孕雌鼠感染HEV不同时间点血液中HEV RNA拷贝数；
图2是怀孕雌鼠感染HEV不同时间点血液中HEV RNA拷贝数；
图3是本发明探针对未怀孕雌鼠感染HEV不同时间点肝脏中的HEV检测结果；
图4是本发明探针对怀孕雌鼠感染HEV不同时间点胎盘中的HEV检测结果。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例1：感染戊型肝炎病毒小鼠的制备
1、病毒悬液的制备
(1)将感染HEV基因4型的阳性猪粪便与DEPC-PBS溶液按质量体积比(g:mL)为1:9的比例混合，制成10％的DEPC-PBS粪便悬液，剧烈震荡，使粪便乳化；
(2)将混合均匀的样本放入低温高速离心机中4℃、12000g下离心10min；
(3)取离心上清液，加入1％双抗(400U/mL青霉素和1000U/mL链霉素)，4℃低温孵育2h；
(4)孵育后的上清在无菌环境中分别经0.45μm、0.22μm滤器过滤除去杂菌获得病毒悬液，并置于15mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用；
2、实验动物的分组、感染和样本收集
(1)实验动物
SPF级BALB/c小鼠(雌性小鼠：36只，体重18-22g，6-8周龄；雄性小鼠：18只，体重20-24g，10-12周龄)，昆明医科大学实验动物中心购入，于昆明理工大学实验动物中心饲养。所有实验动物自购入日起，均于动物实验中心适应两周后方可开始实验；
(2)实验动物分组与接种HEV病毒
BALB/c雌性小鼠共36只，分成两份，一份18只，其中一份雌鼠分成6组，每组3只，一组为空白对照组(MOCK，未感染HEV)，另5组分别为通过尾静脉注射HEV感染1dpi、5dpi、28dpi、85dpi、126dpi，未受孕；
另一份18只雌鼠也同样分成6组，每组3只，一组作为空白对照组(MOCK)，尾静脉注射200μL PBS，每天1次，注射3天；另5组通过尾静脉注射200μL HEV病毒悬液，每天1次，攻毒3天；3天处理完成后，空白对照组(MOCK)、5组HEV感染的雌鼠分别与18只健康的成年雄鼠以1:1比例进行正常交配；通过每天观察雌鼠阴道栓的情况，来判断其是否交配。将交配的第一天称为胎盘感染HEV的第0.5天，5组分别为胎盘感染HEV 3.5dpi、5.5dpi、7.5dpi、14.5dpi和15.5dpi。
实施例2：小鼠肝、胎盘组织中HEV的检测
1、取样
(1)小鼠血液收集
称量空白对照组(MOCK)、HEV感染不同时间点的小鼠体重，根据0.01mL/g的比例，腹腔注射麻醉小鼠，用碘伏进行眼周消毒，采用眼眶静脉丛采血法，收集400μL血液于抗凝管中，收集完成后，于抗凝管标签纸上写好标记，存放于-80℃；
(2)小鼠肝脏取样
将空白对照组(MOCK)、感染HEV 1dpi、5dpi、28dpi、85dpi、126dpi未怀孕的BALB/c小鼠采用颈椎脱臼处死法处死，将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠的整个胸部和腹部，修剪去除腹部毛发，75％酒精擦拭腹部进行消毒。剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露出肝门，剪除肝脏周围的结缔组织和血管，剪断肝门管道系统，完整取出小鼠肝脏，置于无菌培养皿中，生理盐水冲洗。用剪刀将左、右叶肝脏剪开，左叶肝脏放在4％的多聚甲醛中固定，右叶肝脏进行称重记录，放在无菌冻存管中于液氮中保存备用；
(3)小鼠胎盘取样
将空白对照组怀孕雌鼠(MOCK)、感染HEV 3.5dpi、5.5dpi、7.5dpi、14.5dpi、15.5dpi的怀孕BALB/c雌鼠采用颈椎脱臼处死法处死，将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠的整个胸部和腹部，修剪去除腹部毛发，75％酒精擦拭腹部进行消毒。剪开腹膜，暴露腹腔，显露子宫，取下子宫，将其放在已经消毒的冰盒上进行以下操作：用剪刀剪开子宫壁，然后将胎膜剥离，分离出胎儿，取出胎盘，放置于无菌培养皿中，生理盐水冲洗后立即放在4％的多聚甲醛中固定。
2、肝脏组织和胎盘组织固定、脱水、包埋和切片
(1)固定样本：将步骤1中取出的空白对照组(MOCK)、感染HEV不同天数的BALB/c小鼠的肝脏和胎盘分别放置于5mL的EP管，加入4mL 4％的多聚甲醛室温固定16-31小时，并在EP管上做好标记；
(2)组织冲洗：用镊子从EP管中取出已经固定好的小鼠肝脏和胎盘组织，放入组织包埋盒中，用2B铅笔在组织包埋盒上写上对应的标记；之后用自来水冲洗已经装入组织样本的包埋盒4-6小时；
(3)组织脱水、透明、浸蜡：将冲洗好的组织(带有包埋盒)排列整齐的放入赛默飞ExcelsiorAS自动组织脱水机中，程序为：
(4)组织包埋：待自动脱水机程序运行结束后，取出组织，立即用组织包埋机对组织进行包埋；
(5)组织室温冷却：将包埋好的组织蜡块放于-20℃冰箱2h，随后室温过夜风干保存或进行切片；
(6)组织切片：使用组织切片机以10μm修片使组织暴露出来，随后将切片厚度更改为4-5μm进行组织切片；
(7)石蜡组织切片的伸展和黏附：将步骤(5)中所获得的石蜡切片置于45-50℃的水浴中，使得切片充分的伸展，随后使用黏附级载玻片进行黏附；
(8)烘片：将切片所得的所有组织的石蜡切片放在56℃的烘箱中，烘干2-6h后置于37℃的温箱中进行过夜干燥。
3、检测血液样本中HEV病毒拷贝
3.1小鼠全血样本中总RNA提取
具体的实验操作参考AXYGEN公司AxyPrep血RNA小量制备试剂盒的操作说明；
3.2 cDNA的合成
3.2.1去除残留基因组DNA
Total RNA 50ng-1μg
5×gDNAdigester Mix 3μL
RNase-free H2O 加至14.5μL
在RNase free离心管中配制以上混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min；
3.2.2逆转录，将步骤3.2.1中的反应液14.5μL、4×HifairⅢSuperMix plus 5μL、HEV-2 0.5μL混合；25℃，5min；55℃，15min；85℃，5min，获得逆转录产物cDNA，用于qPCR反应，剩余cDNA分装后置于-80℃保存，其中引物HEV-2序列为CCTA(G)TCC(T)TGCTGA(C)GCATTCT；
3.3Real-Time PCR检测小鼠全血样本中HEV RNA拷贝量
以步骤3.2中所获得的cDNA为模板，通过qPCR检测全血样本中HEV RNA拷贝数，反应体系如下：
Real-Time PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性15s、60℃退火45s，循环39次；获得并整理CT值，计算HEV RNA拷贝数。
通过对空白对照组(MOCK)、感染HEV 1dpi、5dpi、28dpi、85dpi、126dpi的BALB/c雌性小鼠、感染HEV 3.5dpi、5.5dpi、7.5dpi、14.5dpi、15.5dpi的怀孕BALB/c雌鼠全血进行实时荧光定量PCR检测，计算出HEV RNA在感染组中的拷贝数，结果如图1、2所示；感染不同时间的小鼠血液中检测到的HEV RNA拷贝数均大于1×103，结果显示HEV成功感染BALB/c小鼠并复制。
实施例3：RNAscope原位杂交方法检测组织切片中的HEV
(1)烤片：将实施例2步骤2制得的组织切片放在载玻片架中，置于60℃的鼓风干燥箱中1h；
(2)脱蜡：烤片步骤完成后，将置于载玻片架上的组织切片放入TO型生物制片透明剂Ⅰ中，在37℃的温箱中放置10min，之后再将其放入TO型生物制片透明剂Ⅱ中，37℃的温箱中放置10min，透明液脱蜡结束后，立即将组织切片放入无水乙醇Ⅰ缸中，时间为1min，期间通过不断地上下移动载玻片架达到涮洗组织切片的作用，之后放入无水乙醇Ⅱ缸中，时间为1min，同无水乙醇Ⅰ缸的操作涮洗组织切片；
(3)干燥：待组织切片涮洗结束后，将组织载玻片放于保湿盒中室温风干至完全干燥，在干燥期间可用吸水纸擦试玻片背面和组织之外的乙醇；
(4)双氧水处理：在干燥后的载玻片上滴加RNAscope双氧水至完全覆盖载玻片上的组织，室温下孵育10min，双氧水孵育结束后，将组织载玻片重新置于载玻片架中，之后将其放在纯水中涮洗，每次3-5下，重复1次；
(5)HEV RNA靶标修复：将10×RNAscope靶标修复液稀释为1×RNAscope靶标修复液，配置300mL，之后将装有300mL的1×RNAscope靶标修复液的烧杯放入微波炉中，用高火将其加热至沸腾状态，后将载玻片非常缓慢地浸没至靶标修复液中，用扎有孔的保鲜膜封住烧杯口，放入微波炉中，转为小火加热15min；
(6)画疏水圈：小火加热完成后，取出组织载玻片立刻用纯水冷却，过程中要上下移动玻片架涮洗载玻片3-5次，纯水涮洗后，再放入无水乙醇中上下涮洗3-5次，取出组织载玻片放置于湿盒中，使用ImmedgeTM疏水笔圈定组织，室温下完全干燥；
(7)待组织切片完全干燥后，滴加RNAscope蛋白酶plus，完全覆盖组织，便将装有组织切片的湿盒放入杂交炉中，40℃孵育30min，孵育结束后置于蒸馏水中，上下涮洗3-5次，重复2次；
(8)HEV-ORF2-DIG、阴性和阳性探针孵育
加入探针HEV-ORF2-DIG、阳性探针(PPIB如SEQ ID NO:2所示)前，先将探针HEV-ORF2-DIG、阳性探针在40℃金属浴中预热10min，然后将探针滴加到组织上，使其完全覆盖切片上的组织，而阴性对照的探针选用PBS代替；滴加探针后将组织切片置于杂交炉中40℃孵育2h，孵育结束后将HEV-ORF2-DIG探针回收，组织切片使用1×RNAscope清洗缓冲液室温摇床摇洗2min，重复1次；
(9)提前将ACD品牌的RNAscope 2.5HDDetection Regent-BROWN(lot：2017397)试剂盒中的Amp 1-6平衡至室温，确保杂交炉40℃，之后步骤不可使组织切片变干燥；
(10)将洗涤好的组织切片滴加Amp 1，每个组织切片滴加量为40μL，放于杂交炉中，40℃孵育30min，孵育完成后用1×清洗缓冲液摇床摇洗2min，重复1次；
(11)将洗涤好的组织切片滴加Amp 2，每个组织切片滴加量为40μL，放于杂交炉中，40℃孵育30min，孵育完成后用1×清洗缓冲液摇床摇洗2min，重复1次；
(12)将洗涤好的组织切片滴加Amp 3，每个组织切片滴加量为40μL，放于杂交炉中，40℃孵育30min，孵育完成后用1×清洗缓冲液摇床摇洗2min，重复1次
(13)将洗涤好的组织切片滴加Amp 4，每个组织切片滴加量为40μL，放于杂交炉中，40℃孵育30min，孵育完成后用1×清洗缓冲液摇床摇洗2min，重复1次
(14)将洗涤好的组织切片滴加Amp 5，每个组织切片滴加量为40μL，放于暗盒中于室温孵育1h，孵育完成后用1×清洗缓冲液摇床摇洗2min，重复1次；
(15)将洗涤好的组织切片滴加Amp 6，每个组织切片滴加量为40μL，放于暗盒中于室温孵育1h，孵育完成后用1×清洗缓冲液摇床摇洗2min，重复1次；
(16)DAB染色：待Apm1-6孵育完成后，将DAB-A、DAB-B按照1：1的比例配制工作液，每个切片约50μL，按照切片的个数配置适量体积的DAB染液，然后将其滴加到组织上使其完全覆盖组织，室温下孵育10min，染色结束后使用蒸馏水清洗3-5次；
(17)复染：将组织切片置于苏木精中室温避光孵育15min，染色结束后使用蒸馏水清洗载玻片，清洗至蒸馏水至无色状态后，将组织切片放入0.02％氨水中进行8s反蓝，后用干净的蒸馏水清洗3-5次；
(18)脱水：将染完核的组织切片放于70％乙醇室温孵育2min，再分别放入无水乙醇Ⅰ缸和无水乙醇Ⅱ缸中室温孵育2min；
(19)组织透明：将脱水后的组织切片放入TO型生物制片透明剂Ⅰ和TO型生物制片透明剂Ⅱ中，置于37℃温箱中分别孵育10min；
(20)将透明后的组织切片用吸水纸擦去组织周围多余的透明液后，1mL枪头蘸取中性树脂滴一滴于组织中央，用载玻片进行封片；
(21)显微镜观察，并拍摄图片；
结果见图3、4所示，结果显示阴性对照、空白对照(MOCK)的肝脏、胎盘组织切片均未发现HEV RNA阳性颗粒，在感染HEV不同时间点的BALB/c小鼠肝脏组织有明显的特异性HEV阳性颗粒，在感染HEV不同时间点的BALB/c小鼠胎盘组织中有明显的特异性HEV阳性颗粒；
结果说明采用本发明HEV探针HEV-ORF2-DIG能对感染不同天数的组织样本中戊型肝炎病毒进行检测，且检测诊断灵敏度高、特异性好、避免了假阳性结果的出现，提高了检测结果的准确率，本发明方法能够用于大规模样品的精准检测。

Claims (2)

1.一种用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.权利要求1所述的用于检测组织切片中戊型肝炎病毒的探针在制备检测组织切片中戊型肝炎病毒试剂盒中的应用。
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