CN117051101A - 检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物，包括31对特异性引物，如SEQ ID NO.1～62所示。本发明还公开了包含该引物的试剂盒。本发明还公开了一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的检测方法：(1)取待检测样品，进行基因组DNA提取；(2)利用检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物或试剂盒进行PCR扩增；(3)对PCR产物进行纯化，制备文库；然后进行二代测序。本发明实现了对26种治疗心脑血管疾病相关的31种多态性基因位点同时进行检测，具有灵敏度高、成本低、操作简单、检测通量高等特点，可以快速精准的对心脑血管疾病个体化用药基因多态性进行检测。

Description

检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物及试剂盒，以及检测方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
心脑血管系统疾病主要包括高血压、动脉粥样硬化、冠心病、脑卒中等，是严重威胁人类健康和导致死亡的重要原因。虽然临床上心脑血管药物品种繁多，但药物治疗的总体有效率不足60％。个体基因差异性使心脑血管疾病患者相关治疗药物的疗效及不良反应存在个体差异。研究发现，心脑血管治疗药物在体内代谢、作用靶点等相关基因的遗传变异，使药物疗效产生个体差异，甚至出现药物不良反应。
个体化用药基因检测是针对与药物反应相关的基因密码进行解读，即通过检测与药物代谢、疗效和毒性相关的基因多态性位点，解析个体的药物代谢速率，评估药物的合适剂量，避免实际诊疗中反复试药调整，延误最佳治疗时机，同时也可规避引发毒性反应的药物，达到安全、有效用药的目的。例如：氯吡格雷是一种抗血小板药物，广泛用于急性冠脉综合征、缺血性脑血栓、闭塞性脉管炎和动脉硬化及血栓栓塞引起的并发症。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。氯吡格雷主要经CYP2C19代谢活化后发挥抗血小板效应。美国FDA和美国心脏病学会建议，对于CYP2C19慢代谢基因型患者需考虑改变治疗方案。因此，检测患者CYP2C19基因型可能是确定氯吡格雷个体化用药策略的重要手段之一。
利用基因检测技术，对患者开展与药物疗效相关的基因多态性检测，可以为临床选择合适的药物种类及药物剂量提供遗传证据，能极大地提高心血管药物使用的安全有效性。
常用于基因多态性检测的方法包括实时荧光PCR法、荧光原位杂交法、Sanger测序法、基因芯片法、高通量测序法、核酸质谱以及新兴的分子POCT检测技术平台等。不同的技术方法都具有各自的缺点，存在低频突变检测灵敏度低、操作流程复杂、成本高等问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物、试剂盒及检测方法。本发明基于二代测序技术，具有灵敏度高、成本低、操作简单、通量高等特点，可以一次性检测26个药物相关基因的31个多态性位点。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物，包括31对特异性引物，具体如表1所示，如SEQ ID NO.1～62所示。
表1检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物
其中，各引物的序列中包含用于二代测序的通用接头序列，序列如下(方向5’-3’)：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNN(I7)ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；以及CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNN(I5)GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。包含用于数据拆分时的index序列，序列中N表示AGCT任意碱基，I7及I5分别为8个碱基长度的index DNA序列，用于特异性识别不同样本的数据。
所述检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物在制备检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒中的应用。
一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒，包括上述检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物，以及PCR反应所必须的试剂。
进一步地，所述试剂盒是由以下组分组成的：Multiplex DNA Polymerase，10μL；Multiplex Buffer，6μL；混合引物，5μL；基因组DNA(模板)，50ng；余量为去离子水；共30μL。
所述混合引物即为上述检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物，其中，31对引物对的摩尔比为S1：S2：S3：S4：S5：S6：S7：S8：S9：S10：S11：S12：S13：S14：S15：S16：S17：S18：S19：S20：S21：S22：S23：S24：S25：S26：S27：S28：S29：S30：S31＝1.3：1.5：1.5：1.5：1.4：1.0：2.2：1.7：1.6：1.5：1.3：2.0：1.0：1.0：1.0：1.0：0.8：1.0：1.7：1.0；1.7：1.3：1.0：1.1：1.1：1.0：1.2：1.3：1.0：1.0：1.4。各编号表示扩增相应基因的引物对，编号S1～S31所对应的基因及检测位点如下所示：
CYP2C19(rs4244285，rs4986893，rs12248560)、CYP2C9(rs1799853，rs1057910)、VKORC1(rs9934438，rs9923231)、ALDH2(rs671)、SLCO1B1(rs4149056)、ABCB1(rs1045642)、ADD1(rs4961)、ADRA1A(rs1048101)、ADRB1(rs1801253)、ADRB2(rs1042713)、AGTR1(rs5186)、APOE(rs7412)、CES1(rs71647871)、CHIA(rs3818822)、CYP2D6(rs3892097，rs16947，rs1058164，rs1065852，rs28371725)、CYP4F2(rs2108622)、LTC4S(rs730012)、MTHFR(rs1801133)、NOS1AP(rs10919035)、PON1(rs662)、SLC14A2(rs1123617，rs3745009)、UGT1A1(rs4148323)。
所述检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物、检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒在心脑血管疾病个体化用药基因检测中的应用。
一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的检测方法，包括以下步骤：
(1)取待检测样品，进行基因组DNA提取；
所述待检测样品为患者的干血斑、全血(EDTA抗凝)或口腔拭子；
(2)利用上述检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物组合或试剂盒进行PCR扩增；
进一步地，所述PCR扩增的反应条件为：
预变性：95℃，3分钟30秒；
18个扩增循环：变性：98℃，20秒；退火+延伸：60℃，4min；
延伸：72℃，5分钟。
(3)对PCR产物进行纯化，制备文库；然后进行二代测序；测序结束后，利用生物信息学法，根据每个样本的index序列进行数据拆分，拆分数据与基因组序列进行比对，得到每个位点基因分型结果。
进一步地，对PCR产物进行纯化，制备文库的具体操作如下：
1)向PCR产物中加入0.9×室温平衡后的磁珠，用移液器轻缓吸打混匀；
2)室温静置孵育5min，将PCR管转移至磁力架上静置2min；
3)移除上清，加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液，室温静置30s；
4)重复步骤3)一次，用10μL量程的移液器吸尽残液；
5)加24μL去离子水重悬磁珠，室温静置2min；
6)将PCR管置于磁力架上3min，取上清至新的PCR管中，检测浓度。
本发明基于CPIC、PharmGKB、FDA等数据库现有基因多态性对药物疗效及不良反应风险影响的相关研究，选取心脑血管疾病药物相关基因，运用二代测序技术(NGS)进行个体化药物基因检测，可高效完成大量目标区域的高深度检测，且在保证检测准确性的同时，还可一次性对大量样本进行处理。
本发明的检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物、试剂盒及检测方法，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明一个反应体系可实现对26种心脑血管疾病药物相关的31种多态性基因位点同时检测，一次检测可多个样本同时检测，体现了通量高，成本低的优势。本发明检测流程形成实验室标准操作规程，实现了检测和结果的科学性、准确性。
(2)本发明提供的检测方法能够对多种类型样本进行检测，包括干血斑、全血(EDTA抗凝)以及口腔拭子。
(3)本发明具有灵敏度高、成本低、操作简单、通量高等特点，利用二代测序方法可以快速精准的对心脑血管疾病药物基因多态性进行检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1检测试剂的制备
(一)药物和检测基因位点的选择
针对临床上心脑血管疾病常用药物使用存在个体差异的情况，根据国际权威药物基因组数据库，选取与治疗心脑血管疾病相关26种药物涉及的31个基因位点，规范开展药物代谢酶与药物作用靶点基因检测。26种药物分别是：氯吡格雷、华法林、阿司匹林、普罗帕酮、地高辛、硝酸甘油、胺碘酮、阿托伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、硝苯地平、厄贝沙坦、坎地沙坦、氯沙坦、美托洛尔、布新洛尔、普萘洛尔、卡维地洛、呋塞米、托拉塞米、布美他尼、螺内酯、吲达帕胺。药物和检测位点的相关性分析如表2所示。
表2药物和检测位点的相关性
31个基因位点依次命名编号为S1～S31，具体详细如表3所示。
表3 PCR混合引物中各位点详情
(二)检测靶点扩增引物设计
利用UCSC公布的31个位点序列信息，设计多重PCR扩增引物，经过多轮实验优化，筛选的扩增引物如表1所示。
所述用于二代测序的芯片接头序列，如下：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNN(I7)ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；以及CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNN(I5)GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(方向5’-3’)。
所述扩增引物中包含用于数据拆分时的index序列，序列中N表示AGCT任意碱基，I7及I5分别为8个碱基长度的index DNA序列，用于特异性识别不同样本的数据。
所述引物体系中各引物对摩尔比为：
S1：S2：S3：S4：S5：S6：S7：S8：S9：S10：S11：S12：S13：S14：S15：S16：S17：S18：S19：S20：S21：S22：S23：S24：S25：S26：S27：S28：S29：S30：S31＝1.3：1.5：1.5：1.5：1.4：1.0：2.2：1.7：1.6：1.5：1.3：2.0：1.0：1.0：1.0：1.0：0.8：1.0：1.7：1.0；1.7：1.3：1.0：1.1：1.1：1.0：1.2：1.3：1.0：1.0：1.4。
(三)测序文库构建
(1)采用多重PCR一步法进行测序文库的制备。引物混合体系中的各引物对的用量如表4所示。
表4引物混合体系
(2)将待测样本的DNA和按表4预混好的引物混合液一起加入到多重PCR反应液中，进行多重PCR扩增。本发明中多重PCR扩增反应采用艾吉泰康生物科技(北京)有限公司生产的Multiplex PCRAssay Kit Ver.2试剂盒进行扩增。多重PCR反应液的配制如表5所示。
表5 PCR反应液
组分 加入量(μl)
Multiplex Buffer 6
Primer pool 5
Multiplex DNA Polymerase 10
gDNA x
去离子水 9-x
(3)PCR的扩增条件如下：
预变性：95℃，3分钟30秒；
18个扩增循环：变性：98℃，20秒；退火+延伸：60℃，4min；
延伸：72℃，5分钟。
(4)扩增终产物利用KAPA HyperPure Beads进行纯化，最终完成测序文库的制备。
(四)二代测序及结果分析
测序平台为Illumina NextSeq 550Dx高通量测序仪，对定量后的文库进行测序；测序结束后，利用生物信息学方法，根据每个样本的index序列进行数据拆分，拆分数据与基因组序列进行比对，得到每个位点基因分型结果。
实施例2心脑血管疾病常用药物基因检测
按照实施例1方案，本实施例收集2例患者口腔拭子样本，分别编号为A1和A2，进行心脑血管疾病常用药物基因检测，并通过一代测序(Sanger法)验证检测结果的准确性。
(一)样本处理
样本基因组DNA的提取使用商业化试剂盒，本发明采用天根生化科技(北京)有限公司生产的Hi-Swab DNA Kit。将取样后的拭子转移至2mL离心管中，加入500μL缓冲液GHA。加入20μL Proteinase K，涡旋10s混匀，65℃放置30min，每隔10min涡旋混匀数次；取出350μL上述溶液，加入500μL缓冲液GBS(使用前请先检查是否已加入异丙醇)，充分颠倒混匀，室温放置5min；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB2中(吸附柱CB2放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液；向吸附柱CB2中加入500μL去蛋白液RD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中；重复上述操作步骤一次；向吸附柱CB2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB2放入收集管中；重复上述操作步骤一次；12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CB2置于室温放置2min，将吸附柱CB2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。取1μL检测DNA液体的浓度，提取的DNA 2～8℃暂存备用，长期保存需保存于-20℃。
(二)PCR反应
按照实施例1中的PCR反应液配制反应体系，2例样本各取50ng DNA加入到配制好的反应体系中，并进行多重PCR扩增。
(三)产物测序前纯化
本实验采用VAHTSDNA Clean Beads进行测序前纯化，步骤如下：
1)向PCR产物中加入0.9×室温平衡后的磁珠，用移液器轻缓吸打混匀；
2)室温静置孵育5min，将PCR管转移至磁力架上静置2min；
3)移除上清，加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液，室温静置30s；
4)重复步骤3)一次，用10μL量程的移液器吸尽残液；
5)加24μL去离子水重悬磁珠，室温静置2min；
6)将PCR管置于磁力架上3min，取上清至新的PCR管中，检测浓度。
(四)测序结果
测序结束后，下机数据经过生物信息学方法分析，输出检测位点的基因分型。本实施例中A1和A2检测结果与一代测序验证结果完全一致，检测结果见表6。
表6检测结果
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物，其特征在于：包括31对特异性引物，具体如表1所示，如SEQ ID NO.1～62所示；
表1
2.权利要求1所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物在制备检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒中的应用。
3.一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物，以及PCR反应所必须的试剂。
4.根据权利要求3所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒，其特征在于，是由以下组分组成的：Multiplex DNA Polymerase，10μL；Multiplex Buffer，6μL；混合引物，5μL；基因组DNA，50ng；余量为去离子水；共30μL。
5.根据权利要求4所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒，其特征在于，所述混合引物中，31对引物对的摩尔比为S1：S2：S3：S4：S5：S6：S7：S8：S9：S10：S11：S12：S13：S14：S15：S16：S17：S18：S19：S20：S21：S22：S23：S24：S25：S26：S27：S28：S29：S30：S31＝1.3：1.5：1.5：1.5：1.4：1.0：2.2：1.7：1.6：1.5：1.3：2.0：1.0：1.0：1.0：1.0：0.8：1.0：1.7：1.0；1.7：1.3：1.0：1.1：1.1：1.0：1.2：1.3：1.0：1.0：1.4。
6.权利要求1所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物或权利要求2～5中任一项所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的试剂盒在心脑血管疾病个体化用药基因检测中的应用。
7.一种检测心脑血管疾病个体化用药基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待检测样品，进行基因组DNA提取；
(2)利用权利要求1所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的引物组合或权利要求2～5中任一项所述的试剂盒进行PCR扩增；
(3)对PCR产物进行纯化，制备文库；然后进行二代测序；测序结束后，利用生物信息学法，根据每个样本的index序列进行数据拆分，拆分数据与基因组序列进行比对，得到每个位点基因分型结果。
8.根据权利要求7所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的检测方法，其特征在于：所述待检测样品为患者的干血斑、全血或口腔拭子。
9.根据权利要求7所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应条件为：
预变性：95℃，3分钟30秒；
18个扩增循环：变性：98℃，20秒；退火+延伸：60℃，4min；
延伸：72℃，5分钟。
10.根据权利要求7所述的检测心脑血管疾病个体化用药基因的检测方法，其特征在于：对PCR产物进行纯化，制备文库的具体操作如下：
1)向PCR产物中加入0.9×室温平衡后的磁珠，用移液器轻缓吸打混匀；
2)室温静置孵育5min，将PCR管转移至磁力架上静置2min；
3)移除上清，加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液，室温静置30s；
4)重复步骤3)一次，用10μL量程的移液器吸尽残液；
5)加24μL去离子水重悬磁珠，室温静置2min；
6)将PCR管置于磁力架上3min，取上清至新的PCR管中，检测浓度。
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