CN117050900A - 一株产γ-聚谷氨酸的球形赖氨酸芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株产γ-聚谷氨酸的球形赖氨酸芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及γ‑聚谷氨酸生产制备技术领域，具体涉及一株产γ‑聚谷氨酸的球形赖氨酸芽孢杆菌及其应用。该菌株为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD‑LS‑156，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023775。该菌株为首次发现的具有发酵生产γ‑聚谷氨酸能力的赖氨酸芽孢杆菌，具有嗜盐特性，可不依赖有机氮源存活，且其发酵后获得的γ‑聚谷氨酸分子量在600～900kDa之间，无需进一步的水解工艺，即可满足化妆品行业对γ‑聚谷氨酸的需求。
Description
技术领域
本发明涉及γ-聚谷氨酸生产制备技术领域，具体涉及一株产γ-聚谷氨酸的球形赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种具有广泛应用前景的生物高分子材料，分子中含有大量游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子之间形成氢键，因此保水性能极好，同时又具有生物可降解性、吸附性、可食用性、生物相容性、无毒性以及非免疫原性等特点，从而作为保水剂、保肥剂、絮凝剂、食品添加剂、药物载体等广泛应用于食品、化学、医药、工业、农业等领域，尤其在化妆品行业具有重要应用价值。在化妆品和个人护理产品中，γ-聚谷氨酸可以增加产品的稠度和粘度，提高产品的质地和质感，同时还具有很好的保湿性能，缓解皮肤干燥、皱纹等问题；在食品行业中，γ-聚谷氨酸可以用作视频添加剂，增加蛋白质、酶的稳定性，延长食品的保质期等。
γ-聚谷氨酸的聚合度是产品性能非常重要的指标，大量研究证明，700～800kDa的γ-聚谷氨酸在护肤品领域和食品领域效果最佳，过高或者过低聚合物的产品市场接受度不高，而γ-聚谷氨酸的聚合度于发酵菌株的生产能力息息相关。目前报道的菌株生产的γ-聚谷氨酸通常超过1000kDa，甚至达到2000kDa水平，需要发酵后水解才能得到理想的聚合度水平。这样不仅工艺繁琐，而且提高了生产成本，因此，能够使用无机氮源定向发酵生产700～800kDa聚合物的γ-聚谷氨酸的微生物具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一在于保护一株产γ-聚谷氨酸的球形赖氨酸芽孢杆菌，该菌株为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2023775。
该菌株为首次报道的能够发酵生产γ-聚谷氨酸的赖氨酸芽孢杆菌，具有嗜盐特性，可不依赖有机氮源存活，且其发酵后获得的γ-聚谷氨酸分子量在600～900kDa之间，无需进一步的水解工艺，即可满足化妆品行业对γ-聚谷氨酸的需求。
本发明的目的之二在于保护一种利用上述菌株制备γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
将活化后的菌接种于液体LB培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养12～24h获得一级种子液；
将一级种子液按2～5％的接种量接种于二级培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养12～24h获得二级种子液；
将二级种子液按2～10％的接种量接种于含有谷氨酸钠的发酵培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养24～72h获得发酵液；
将发酵液分离纯化即得γ-聚谷氨酸。
作为一种优选的实施方式，分离纯化的方法为：
将发酵液稀释后利用陶瓷膜除去菌体，再利用有机超滤膜除去分子量小于20kDa的小分子聚合物、杂质与色素，浓缩并收集γ-聚谷氨酸水溶液；
利用无水乙醇沉淀γ-聚谷氨酸浓缩液，收集沉淀并洗涤至无水残留，减压真空干燥即得γ-聚谷氨酸。
作为一种优选的实施方式，陶瓷膜的规格为：孔径0.25～0.45um；
超滤膜的规格为：100kDa～300kDa有机超滤膜。
作为一种优选的实施方式，二级培养基包括糖蜜20～50g/L、柠檬酸钠20～50g/L、尿素5～20g/L、氯化钠20～100g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L。
作为一种优选的实施方式，发酵培养基包括糖蜜20～50g/L，柠檬酸钠20～50g/L，尿素5～20g/L，氯化钠20～100g/L，谷氨酸钠10～50g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L。
与现有技术相比，本发明至少具有以下技术效果：
(1)本发明所要求保护的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156为首次发现的具有发酵生产γ-聚谷氨酸能力的球形赖氨酸芽孢杆菌，且其发酵制备得到的γ-聚谷氨酸分子量在600～900kDa，以700～800kDa分子量含量最高，无需酸水解等工艺，制备得到的产品能够直接符合化妆品行业的需求；
(2)该菌株具有嗜盐特性，在2～8％的NaCl中产量较高，在4～6％d NaCl中产量最优，γ-聚谷氨酸的产量可达1.8～2.2％；
(3)该菌株可不依赖有机氮源存活，原料成本低，适合产业化应用。
附图说明
图1为实施例3中制备得到的γ-聚谷氨酸的液相色谱图；
图2为868kDa分子量的标准品的液相色谱图；
图3为市场中采购的γ-聚谷氨酸样品的液相色谱图；
图4为实施例4中制备得到的γ-聚谷氨酸的液相色谱图。
球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156，分类命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)，于2023年5月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2023775，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1菌株的筛选
(1)菌体的富集：将收集的酱油发酵沼渣样品(来自于巧媳妇食品集团)加入到纯水中搅拌均匀，并取适量接种到LB液体培养基中，30℃、220rpm，培养24h；
(2)初筛：将菌液稀释涂布到LB固体培养基(培养基中添加适量的谷氨酸钠)，30℃、220rpm，培养24h；
(3)分离纯化：从平板上选取生长速度快、菌落大且有粘液的菌落，进一步在平板上纯化；
(4)复筛：将分离纯化的菌种接种至LB液体培养基(培养基中添加5％NaCl及4％的谷氨酸钠)，选取能在该培养基中快速生长，且能使发酵液变粘稠的菌株，并检测发酵液中的聚谷氨酸含量，得到一株耐盐且产γ-聚谷氨酸性能较好的菌株。
该菌株在LB平板培养基上的形态学特征为：菌落呈乳白色，表面光滑有粘性，边缘不规整，中央隆起或者凹陷，菌落直径2～4mm。
其生理生化特征为：革兰氏阳性，细胞壁具有较厚的肽聚糖层，能够抵抗晶体染色过程中的脱色，呈现革兰氏阳性染色反应；在不利的环境条件下能形成耐热、耐干燥、耐化学消毒的芽孢；可完全利用无机盐作为营养物质生长；好氧菌，最适生长温度28～30℃；为嗜盐菌，在含盐时有更好的发酵性能，最高可在质量浓度10％的氯化钠中生长；谷氨酸依赖型菌株，可在有谷氨酸时产生聚谷氨酸。
利用16sRNA进行鉴定，通过Gene Bank比对，最终确定为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)。
该菌株命名为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156，并于2023年5月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2023775，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例2发酵生产γ-聚谷氨酸的方法
利用本发明的球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156在高盐培养基中发酵生产γ-聚谷氨酸，具体方法如下：
(1)菌体活化：将球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156斜面从4℃冰箱中取出，在25～35℃培养箱中活化2～8h；
(2)一级种子液：将活化好的菌株接种至灭菌好的液体LB培养基中，在25～35℃、120～220rpm条件下培养12～24h；
(3)二级种子液：将获得的一级种子液按照体积比2～5％的接种量接种至二级培养基中，在25～35℃、120～220rpm条件下培养12～24h，其中二级培养基的成分为糖蜜20～50g/L，柠檬酸钠20～50g/L，尿素5～20g/L，氯化钠20～100g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L；
(4)发酵液：将获得的二级种子液按照体积比2～10％的接种量接种至发酵培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养24～72h，其中发酵培养基的成分为糖蜜20～50g/L，柠檬酸钠20～50g/L，尿素5～20g/L，氯化钠20～100g/L，谷氨酸钠10～50g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L。
实施例3γ-聚谷氨酸的纯化、精制与聚合度确定
γ-聚谷氨酸的纯化、精制与聚合度确定方法如下：
(1)利用不同级别的微米级陶瓷膜分离实施例2中发酵后获得的产品中的γ-聚谷氨酸和菌体，将发酵产物稀释2～8倍，截留水不溶的菌体，使γ-聚谷氨酸和小分子化合物透过陶瓷膜，收集γ-聚谷氨酸水溶液；
(2)利用超滤膜分离(1)中γ-聚谷氨酸和20kDa小分子化合物与色素，截留γ-聚谷氨酸，使小分子化合物与色素透过超滤膜，浓缩并反复用水顶洗彻底除去盐及色素，收集γ-聚谷氨酸水溶液；
(3)利用2～4倍无水乙醇沉淀(2)中γ-聚谷氨酸浓缩液，再用大量无水乙醇洗涤沉淀直至无水残留，最后用减压真空干燥沉淀，得到γ-聚谷氨酸；
(4)将(3)中产品通过凝胶色谱(HPLC)法检测产品的聚合度，结果如图1～3所示，其中图1为上述制备得到的γ-聚谷氨酸的液相色谱图，图2为868kDa分子量的标准品的液相色谱图，图3为市场中采购的γ-聚谷氨酸样品的液相色谱图。
由图1可知，本发明中的菌种在高盐环境中发酵制备得到的γ-聚谷氨酸产物聚合度为600～900kDa，以700～800kDa产物含量最高，与市售γ-聚谷氨酸聚合度相近。
实施例4
本实施例提供一种发酵生产γ-聚谷氨酸，具体方法如下：
(1)种子液的制备：
一级种子液：将活化好的菌株球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)LD-LS-156接种至灭菌好的液体LB培养基中，在30℃、220rpm条件下培养24h；
二级种子液：将获得的一级种子液按照体积比5％的接种量接种至二级培养基中，在30℃、220rpm条件下培养16h，其中二级培养基的成分为糖蜜30g/L，柠檬酸钠20g/L，尿素10g/L，氯化钠50g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.3g/L；
(2)发酵培养：将获得的二级种子液按照体积比5％的接种量接种至发酵培养基中，30℃、220rpm条件下培养72h，其中发酵培养基的成分为糖蜜30g/L，柠檬酸钠20g/L，尿素10g/L，氯化钠50g/L，谷氨酸钠40g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.3g/L；
(3)利用孔径0.45um的陶瓷膜分离菌体，利用200kDa有机超滤膜分离发酵后获得的产品中的γ-聚谷氨酸。将发酵产物稀释4倍，截留水不溶的菌体，使γ-聚谷氨酸和小分子化合物透过陶瓷膜，收集γ-聚谷氨酸水溶液；利用超滤膜分离γ-聚谷氨酸和小于200kDa小分子化合物、盐与色素，截留γ-聚谷氨酸，使小分子化合物、盐与色素透过超滤膜，浓缩并反复用水顶洗彻底除去盐及色素，收集γ-聚谷氨酸水溶液；
(4)利用4倍无水乙醇沉淀γ-聚谷氨酸浓缩液，再用大量无水乙醇洗涤沉淀直至无水残留，最后用减压真空干燥沉淀，得γ-聚谷氨酸。
γ-聚谷氨酸的产量为2.2％，将得到的γ-聚谷氨酸通过凝胶色谱(HPLC)法检测产品的聚合度，结果如图4所示。
通过以上实施例可知，本发明所要求保护的形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillussphaericus)LD-LS-156能够以谷氨酸为底物发酵生产获得γ-聚谷氨酸，并且合成的γ-聚谷氨酸分子量在600～900kDa，以700～800kDa含量最高，这一分子量范围正好完全符合化妆品行业对γ-聚谷氨酸的要求。
该球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156还具有嗜盐特性，这意味着在高盐条件下，该菌株仍能保持较高的生产效率，有助于提高生产过程的稳定性，此外，高盐条件下生产γ-聚谷氨酸可以减少微生物污染的风险，降低生产过程中的消毒和杀菌成本。
该球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156可以不依赖有机氮源存活，且能发酵生产γ-聚谷氨酸，这一特性有助于降低原料成本，使得球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156在产业化应用方面具有更高的优势，在生产过程中，无需添加昂贵的无机氮源，可以节省原料成本，降低整体生产费用，此外，这一特性还有助于利用含有高盐的生物废弃物为原料发酵生产γ-聚谷氨酸，减轻对环境的负担，减少资源浪费，符合绿色生产的理念。
进一步研究表明，该菌株在2～8％的NaCl中产量较高，在4～6％d NaCl中产量最优，γ-聚谷氨酸的产量可达1.8～2.2％，其中在5％的NaCl中产量最优，γ-聚谷氨酸的产量可以达到2.2％左右。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一株产γ-聚谷氨酸的球形赖氨酸芽孢杆菌，该菌株为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)LD-LS-156，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023775。
2.一种利用权利要求1所述的球形赖氨酸芽孢杆菌制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将活化后的菌接种于液体LB培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养12～24h获得一级种子液；
将一级种子液按2～5％的接种量接种于二级培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养12～24h获得二级种子液；
将二级种子液按2～10％的接种量接种于含有谷氨酸钠的发酵培养基中，25～35℃、120～220rpm条件下培养24～72h获得发酵液；
将发酵液分离纯化即得γ-聚谷氨酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，分离纯化的方法为：
将发酵液稀释后利用陶瓷膜除去菌体，再利用有机超滤膜除去小分子聚合物、杂质与色素，浓缩并收集γ-聚谷氨酸水溶液；
利用无水乙醇沉淀γ-聚谷氨酸浓缩液，收集沉淀并洗涤至无水残留，减压真空干燥即得γ-聚谷氨酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，二级培养基包括糖蜜20～50g/L、柠檬酸钠20～50g/L、尿素5～20g/L、氯化钠20～100g/L、磷酸二氢钾0.5～3g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养基包括糖蜜20～50g/L，柠檬酸钠20～50g/L，尿素5～20g/L，氯化钠20～100g/L，谷氨酸钠10～50g/L，磷酸二氢钾0.5～3g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L。
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