CN117050015A - 单体化合物dta及在制备抑制替莫唑胺敏感型胶质瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单体化合物DTA及在制备抑制替莫唑胺敏感型胶质瘤药物中的应用；通过胶质瘤原代细胞模型证明，本产品单体化合物Demethylenedelcoine A(DTA)，能够产生比临床一线化疗药物替莫唑胺与卡莫司汀更好的抗化疗抵抗型胶质瘤效果。因此，在针对替莫唑胺化疗抵抗，以及放疗失败的复发性胶质瘤的临床治疗中，可能具有着潜在治疗优势，因而具有潜在的药物开发价值。
Description
技术领域
本发明涉及替莫唑胺敏感型胶质瘤治疗技术领域，更具体的说是涉及单体化合物DTA及在制备抑制替莫唑胺敏感型胶质瘤药物中的应用。
背景技术
胶质瘤是成年人最为常见的原发性颅内肿瘤，约占颅脑肿瘤的30％-50％，复发率居颅内肿瘤首位。肿瘤多呈浸润性生长，手术不易全切，目前仍无确切有效的治疗手段。目前临床主要采取手术联合放、化疗的治疗方式，但是患者预后极差，无法有效延长患者预后生存期。
化学治疗是胶质瘤治疗的主要手段之一，目前临床主要使用烷化剂替莫唑胺，开展针对胶质瘤患者的化疗。
但是，胶质瘤细胞容易对化疗药物产生抗药性(耐受性)，严重制约了化疗效果，降低了治疗的有效性。因此，逆转胶质瘤细胞化疗耐药性，对于胶质瘤的治疗有重要意义。大量研究证明，许多化疗药物是通过引起肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，而胶质瘤细胞的异质性和其分子变异，造成对凋亡的规避和阻碍，在很大程度上降低了抗肿瘤药物对细胞的杀伤能力。因此，针对能够逆转胶质瘤细凋亡受阻，即诱使肿瘤细胞凋亡的先导化合物的筛选、研究和开发，是改善现有的胶质瘤临床药物治疗的重要途径。
因此，如何提供一种诱导肿瘤细胞凋亡的化合物，并将其应用于逆转胶质瘤细胞凋亡的受阻中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种单体化合物DTA，并将其应用于抑制替莫唑胺敏感型胶质瘤中。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种单体化合物DTA，所述化合物的结构式如式I所示：
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的单体化合物DTA的制备方法，包括下述过程：
(1)选取翠雀花全草，恒温干燥后粉碎，并过20-40目筛，得到原料；
(2)向原料中加入甲醇，冷浸提取5次，每次冷浸24h，提取液经减压浓缩后，混悬于蒸馏水中，并采用正丁醇进行萃取，经减压浓缩后得到正丁醇萃取物。
(3)将正丁醇萃取物:硅胶＝1:1-2进行拌样，挥干溶剂后，以30g硅胶干法上柱，先用氯仿:甲醇＝10:1进行洗脱，再经过Sephedex LH-20氯仿:甲醇＝2:1洗脱后，再经反相硅胶水:甲醇＝3-1:1-4洗脱，收集水:甲醇＝1:1洗脱液，减压浓缩得到化合物DTA。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护权利要求1所示的单体化合物DTA在制备抑制替莫唑胺敏感型胶质瘤药物中的应用。
优选地，所述单体化合物DTA抑制化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤原代细胞的增殖。
优选地，所述单体化合物DTA抑制替莫唑化疗抵抗型胶质瘤原代类器官的生长速率。
优选地，所述单体化合物DTA促进替莫唑化疗抵抗型胶质瘤原代细胞凋亡。
优选地，所述单体化合物DTA对抑制替莫唑化疗抵抗型胶质瘤在体内的增殖。
优选地，单体化合物DTA的使用浓度为10-20μM。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明从毛莨科植物毛梗翠雀花(Delphinium honanense)的全草中分离得到的单体化合物Demethyle nedelcoine A(DTA)，通过基于替莫唑胺敏感型和耐受型胶质母细胞瘤的原代类器官组织和细胞模型活性筛选实验发现，与替莫唑胺敏感型胶质瘤类器官组织和细胞相比，DTA能够对替莫唑耐受型胶质瘤的原代类器官组织和细胞产生相同的生长抑制和促凋亡作用，此外，体内实验进一步证明了DTA的DMSO溶解液，具有显著的抑制替莫唑胺耐受型胶质瘤细胞系皮下成瘤的效果。
通过胶质瘤原代细胞模型证明，本产品单体化合物Demethylenedelcoine A(DTA)，能够产生比临床一线化疗药物替莫唑胺与卡莫司汀更好的抗化疗抵抗型胶质瘤效果。因此，在针对替莫唑胺化疗抵抗，以及放疗失败的复发性胶质瘤的临床治疗中，可能具有着潜在治疗优势，因而具有潜在的药物开发价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的TMZ与DTA对化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤原代细胞的抑制作用图；
图2附图为DTA对TMZ化疗抵抗型胶质瘤原代类器官的抑制作用图；
图3附图为DTA对TMZ化疗抵抗型胶质瘤原代细胞的促凋亡作用图；
图4附图为DTA对TMZ化疗抵抗型胶质瘤的体内抑制效果图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中所采用的化疗敏感型细胞U251、化疗抵抗型细胞T98G细胞及试剂均为市售。
实施例1验证TMZ与DTA对化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤细胞活性的影响，具体步骤如下：
(1)分别将U251细胞和T98G细胞于含有10％胎牛血清和100U/mL青霉素/链霉素的培养基，37℃，5％CO2的条件培养。
(2)分别将U251细胞和T98G细胞以5×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在标准培养条件下孵育24h，
(3)向培养板各孔中分别加入不同浓度的TMZ和DTA培养箱中孵育48小时后，将10μL/孔CCK-8试剂加入96孔板中，并在37℃下孵育1h。
(4)使用多功能酶标仪在450nm处检测光密度(OD)值。
结果如图1所示，随着TMZ和DTA的浓度升高，对胶质瘤细胞增殖的抑制作用越强；但替莫唑胺对化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤细胞的半抑制浓度分别为30.46μM、213.2μM；而采用DTA对化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤细胞的半抑制浓度分别为11.12μM、13.72μM，可见，相较于TMZ，本发明中的化合物DTA对化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤细胞均有显著的抑制作用。
实施例2验证DTA对TMZ化疗抵抗型胶质瘤原代类器官的影响，具体方法如下所示：
选取1mm3大小的病人源胶质瘤组织，将其剪碎并悬浮在含有Gluta Max(1X)、NEAA(1X)、N2(1X)、B27(1X)、2-mercaptoethanol(1X)以及2.5μg/ml胰岛素的DMEM/F12和Neurobasal(体积比＝1:1)的混合培养基内，置于37℃培养箱、5％CO2条件下培养生长两个月，获得胶质瘤类器官，然后添加DTA(浓度为14μM)治疗1、9、18天，以生理盐水作为对照，比较两组间类器官的增长情况，具体结果如图2所示。
由图2可知，对照组的胶质瘤类器官随着治疗时间的延长，胶质瘤类器官增长率显著提高；而采用本发明化合物DTA治疗后，胶质瘤类器官对着时间的延长并未出现增长情况，可有效抑制器官的生长。
实施例3验证DTA对TMZ化疗抵抗型胶质瘤细胞凋亡的影响，具体方法如下所示：
(1)取对数生长期的化疗抵抗型胶质瘤细胞T98G，以1.5×105个/ml接种于6孔培养板；
(2)铺板后24h待细胞完全贴壁后，分别加入不同浓度DTA(5μM、15μM、20μM)，同时设溶剂对照组，将细胞继续培养48h；
(3)48h后收获细胞，预冷PBS洗涤2次，用1×Binding Buffer制备成1×106个/mL的细胞悬液，取100μL于流式管中，按试剂盒说明书加入5uL7-AAD和5uLPE染色，轻柔的涡旋细胞，室温避光孵育15min，再200uL1×Binding Buffer于管中，1h内进行流式细胞检测。
由图3可知，DTA(5μM、15μM、20μM)处理引起胶质瘤细胞凋亡百分比呈浓度依赖性增加，5μM DTA就引起TMZ化疗抵抗型胶质瘤细胞凋亡百分比增加。该结果说明DTA可以诱导TMZ化疗抵抗型胶质瘤细胞凋亡。
实施例4验证DTA对TMZ化疗抵抗型胶质瘤的体内抑制影响
将胶质瘤细胞T98G用10％1640培养液培养，收集细胞制成悬液，台盼蓝染色计数细胞存活率>95％，置4℃冰箱保存待接种。选取健康Wistar大鼠雌雄各半，共24只，并将其随机分成三组(每组8只)，即对照组(2ml生理盐水)、10μM DTA组和20μM DTA组，于右股皮下接种100μl含2×106个胶质瘤细胞T98G的细胞悬液，后置于恒温25℃无菌净化屏障系统内饲养。接种7天后，每日腹腔注射药物，连续处理7d，观察各组大鼠肿瘤生长状况，并于接种后14日处死大鼠，取出肿瘤，分别测定各组别大鼠肿瘤的重量。
由图4可知，与对照组相比，接种10μM DTA组和20μM DTA组的肿瘤重量明显减轻，且差异达到显著。由此可说明，本发明中的化合物DTA可以显著抑制肿瘤的生长，从而降低肿瘤的重量。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种单体化合物DTA，其特征在于，所述化合物的结构式如式I所示：
2.权利要求1所述的单体化合物DTA的制备方法，其特征在于，包括下述过程：以毛莨科植物毛梗翠雀花为原料，进行单体化合物DTA的提取。
(1)选取翠雀花全草，恒温干燥后粉碎，并过20-40目筛，得到原料；
(2)向原料中加入甲醇，冷浸提取5次，每次冷浸24h，提取液经减压浓缩后，混悬于蒸馏水中，并采用正丁醇进行萃取，经减压浓缩后得到正丁醇萃取物。
(3)将正丁醇萃取物:硅胶＝1:1-2进行拌样，挥干溶剂后，以30g硅胶干法上柱，先用氯仿:甲醇＝10:1进行洗脱，再经过Sephedex LH-20氯仿:甲醇＝2:1洗脱后，再经反相硅胶水:甲醇＝3-1:1-4洗脱，收集水:甲醇＝1:1洗脱液，减压浓缩得到化合物DTA。
3.权利要求1所示的单体化合物DTA在制备抑制替莫唑胺敏感型胶质瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单体化合物DTA抑制化疗敏感与化疗抵抗型胶质瘤原代细胞的增殖。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单体化合物DTA抑制替莫唑化疗抵抗型胶质瘤原代类器官的生长速率。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单体化合物DTA促进替莫唑化疗抵抗型胶质瘤原代细胞凋亡。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述单体化合物DTA对抑制替莫唑化疗抵抗型胶质瘤在体内的增殖。
8.根据权利要求3-8任一所述的应用，其特征在于，单体化合物DTA的使用浓度为10-20μM。
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