CN117045662A - β-内酰胺酶抑制剂的新抗菌用途 - Google Patents

β-内酰胺酶抑制剂的新抗菌用途 Download PDF

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高聪
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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种β‑内酰胺酶抑制剂的新抗菌用途、该β‑内酰胺酶抑制剂与美罗培南联合抗菌的用途、以及该β‑内酰胺酶抑制剂与美罗培南的药物组合物用于治疗细菌感染的技术方案。

Description

β-内酰胺酶抑制剂的新抗菌用途
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种β-内酰胺酶抑制剂的新抗菌用途、该β-内酰胺酶抑制与美罗培南联合抗菌的用途、以及该药物组合物用于治疗细菌感染的技术方案。
背景技术
β-内酰胺类抗生素使用至今已有70多年，是临床上治疗各种感染的主力品种。但是，随着这类药物的大量使用和滥用，细菌耐药性也在快速增加。过去的20年间，内科医生面临的境况越来越糟，那就是无论是在社区还是医院，细菌性感染的发病率和死亡率都在迅速攀升。临床上耐受抗生素能力强且亟需新治疗药物的致病菌株主要有两种：一种是多重耐药菌(multidrug-resistant strains，MDR)，是指细菌对常用抗菌药物主要分类的3类或以上耐药；另一种是广泛耐药菌(extremely drug-resistant strains，XDR)，是指细菌对常用抗菌药物几乎全部耐药。院内感染30-50％是ESKAPE导致的。ESKAPE包括屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)及肠杆菌属(Enterobacter species)等6类致病菌。这六类菌涵盖了大多数的MDR和XDR菌株，极大地限制了医生对于治疗方案的选择。
细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药的机制有几种，最主要的是细菌能产生使β-内酰胺环水解开裂的酶，从而导致抗生素失去抗菌活性。细菌还可以选择性改变抗生素的作用靶标，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有多重耐药性就与产生新的PBP2a、使PBPs合成增加、与药物亲和力下降有关。β-内酰胺酶可与某些耐酶β-内酰胺类抗生素迅速结合，使药物停留在胞质膜外间隙中，不能达到作用靶位发挥抗菌作用。另外，G-菌的外膜对某些β-内酰胺类抗生素不易透过，产生非特异性低水平耐药。还有些细菌的胞质膜上存在主动外排系统，细菌由此主动外排药物。因此，将β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂联合使用是临床上最有效的方法。细菌可以产生多种类型的β-内酰胺酶，按照其氨基酸和核苷酸序列可以分为A、B、C、D四类。A、C和D类酶以丝氨酸残基为活性位点来催化水解，B类酶以依赖金属离子的活性中心发挥作用。
第一个广为人知的高活性β-内酰胺酶抑制剂是克拉维酸钾，迄今为止，它与阿莫西林的组合在市场上仍然畅销。市场上另外两个重要的β-内酰胺酶抑制剂是舒巴坦和他唑巴坦。这三个药物的共同之处是结构中都有高活性的β-内酰胺环，是抑制剂的活性位点。虽然这三个药物在市场销售情况火热，但是其本身的抗菌谱很窄。它们只对A和D类β-内酰胺酶有作用效果，而对C类酶和A类中极为重要的KPC酶则完全无效。
2015年2月，FDA批准了一种新的β-内酰胺酶抑制剂，名叫阿维巴坦(NXL-104)。该药物的结构中含有一个新型的二氮杂二环，具有比上述三个老一代的β-内酰胺酶抑制剂更广的抗菌谱。但是，阿维巴坦对A类具有较好的抑制活性，对C类酶抑制活性相对较弱。
WO2017206947公开了一类新的二氮杂二环类β-内酰胺酶抑制剂。该类化合物，特别是化合物1，具有很好的协同抗菌作用。试验数据表明，该化合物1相对于阿维巴坦对C类β-内酰胺酶具有更高的抑制效果，同时其对产NDM-1碳青霉烯酶细菌的抑制作用也明显优于阿维巴坦。
发明内容
本发明第一方面提供化合物1或其药学上可接受的盐在制备用于治疗产金属酶大肠埃希菌感染的药物的用途；所述化合物1具有如下的化学结构：
本发明第二方面提供化合物1用于与美罗培南联合治疗碳青霉烯耐药肠杆菌的用途；其中，所述碳青霉烯耐药肠杆菌优选为产金属酶大肠埃希菌、产KPC酶大肠埃希菌。优选地，所述用途，其特征在于，给予患者先后或者同时输注化合物1、美罗培南。更优选地，所述用途，其特征在于，化合物1与美罗培南的质量比为1:1-1:4，优选1:1.5-1:4，更优选1:2。在本发明的一个技术方案中，所述用途，其特征在于，单次给予患者输注化合物1以500mg-1000mg的剂量给药、美罗培南以1500mg-2000mg的剂量给药，输注时间为2或3小时，一天3次给药；或者单次给予患者输注化合物1以500mg剂量、美罗培南以1000mg剂量给药，输注时间为2或3小时，一天3次给药；优选地，所述用途单次给予患者输注1000mg化合物1和2000mg美罗培南，输注时间为2或3小时，一天3次给药。
本发明第三方面提供一种药物组合物，其包含化合物1或其药学上可接受的盐、以及美罗培南；优选地，所述药物组合物中化合物1与美罗培南的质量比为1:1-1:4，优选1:1.5-1:4，更优选1:2；更优选地，所述组合物含有500mg-1000mg化合物1、1500mg-2000mg美罗培南；或者所述组合物含有500mg化合物1以及1000mg美罗培南；优选地，所述组合物含有1000mg化合物1和2000mg美罗培南。
本发明第四方面提供本发明第三方面所述药物组合物在制备用于治疗碳青霉烯耐药肠杆菌感染的药物的用途。优选地，所述碳青霉烯耐药肠杆菌为产金属酶的大肠埃希菌、产KPC酶大肠埃希菌。优选地，所述用途，其特征在于，给予患者输注本发明第三方面所述的药物组合物，输注时间2或3小时，一天3次给药。
本发明第五方面提供一种治疗碳青霉烯耐药肠杆菌感染的患者的方法，其特征在于，单次先后或同时给予患者输注500mg-1000mg化合物1、1500mg-2000mg美罗培南，输注时间为2或3小时，一天3次；或者单次先后或同时给予患者输注500mg化合物1以及1000mg美罗培南，输注时间2或3小时，一天3次给药；优选1000mg化合物1和2000mg美罗培南，输注时间2或3小时，一天3次给药。
本发明的有益效果：本发明提供了化合物1具有抑制产金属酶大肠埃希菌的活性和性质，同时也提供了式(I)所示化合物与美罗培南联合用于抑制产金属酶大肠埃希菌的用途和药物组合物。同时，本发明提供了化合物1与美罗培南联合使用的特定途径和用途，使其能够有效抑制和治疗碳青霉烯耐药肠杆菌感染，降低耐药风险。
本发明采用下述缩略词：aq代表水；HATU代表O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐；EDC代表N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐；m-CPBA代表3-氯过氧苯甲酸；eq代表当量、等量；CDI代表羰基二咪唑；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DIAD代表偶氮二羧酸二异丙酯；DMF代表N，N-二甲基甲酰胺；DMSO代表二甲亚砜；EtOAc代表乙酸乙酯；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；CBz代表苄氧羰基，是一种胺保护基团；BOC代表叔丁基羰基是一种胺保护基团；HOAc代表乙酸；NaCNBH3代表氰基硼氢化钠；r.t.代表室温；O/N代表过夜；THF代表四氢呋喃；Boc2O代表二-叔丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二异丙基乙基胺；SOCl2代表氯化亚砜；CS2代表二硫化碳；TsOH代表对甲苯磺酸；NFSI代表N-氟-N-(苯磺酰基)苯磺酰胺；NCS代表1-氯吡咯烷-2,5-二酮；n-Bu4NF代表氟化四丁基铵；iPrOH代表2-丙醇；mp代表熔点；LDA代表二异丙基胺基锂。所述KPC酶是指肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯酶；所述NDM酶是指新德里金属酶。
附图说明
图1化合物1的PK/PD的Emax模型拟合图；
图2美罗培南(MEM)的达标概率；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明有任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的，也属于本发明的保护范围。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。本发明化合物经手工或者软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
本发明所述的化合物1可以参考WO2017206947或者WO2019105479制备得到，也可按照如下制备例的步骤可得到。
制备例1:化合物1的制备
步骤一：
将原料1-A(50克，26.62毫摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(8.69克，53.24毫摩尔)和三乙胺(6.73克，66.55毫摩尔)溶于100毫升N,N-二甲基甲酰胺中，加热到50℃，搅拌16小时。反应液冷却到室温，搅拌下倒入100毫升冰水中，抽滤，固体用10毫升冷水洗涤三次，干燥得化合物1-B(9.3克，收率97％)。
步骤二：
将化合物1-B(6.0克，17.03毫摩尔)悬浮于400毫升二氯甲烷和150毫升甲醇中，向其中加入85％水合肼(1.71克，34.06毫摩尔，1.66毫升)。反应液在25℃下搅拌18小时，过滤，滤饼用50毫升乙酸乙酯洗涤，滤液浓缩至干，剩余物用40毫升石油醚/乙酸乙酯(3:1)打浆，过滤，重复打浆两次，滤液合并浓缩得化合物1-C(980毫克，收率62％)。
步骤三：
将化合物1-C(980毫克，10.64毫摩尔)溶于50毫升二氯甲烷中，冷却到-10℃，用注射器加入三乙胺(1.08克,10.64毫摩尔,1.47毫升)，然后滴入二碳酸二叔丁酯(2.32克,10.64毫摩尔)的30毫升二氯甲烷溶液。反应液缓慢升到室温(25℃)，搅拌20小时。浓缩，剩余物经硅胶柱纯化(乙酸乙酯/石油醚混合液，梯度30％～50％)得化合物1-D(700毫克,收率34％)。
步骤四：
将化合物1-D(300毫克,1.56毫摩尔)，(2S,5R)-6-苄氧基-7-氧-1,6-二氮杂二环[3.2.1]辛-2-羧酸(431.23毫克,1.56毫摩尔)(合成方法参考专利WO2012172368A1)，EDCI(388.77毫克,2.03毫摩尔),HOBt(274.02毫克,2.03毫摩尔)和二异丙基乙胺(201.62毫克,1.56毫摩尔,272.46微升)依次加入20毫升二氯甲烷中。反应液于室温(25℃)下搅拌20小时后加入30毫升二氯甲烷稀释，用15毫升水洗两次，15毫升盐水洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液浓缩至干，粗品经硅胶柱纯化(乙酸乙酯/石油醚混合液，梯度30％～50％)得化合物1-E(262毫克，收率67％)。
步骤五：
化合物1-E(760.00毫克,1.69毫摩尔)溶解在二氯甲烷(7.00毫升)中，20℃下加入三氟乙酸(3.08克,27.01毫摩尔,2.00毫升)并搅拌3小时，将反应混合物浓缩，用乙酸乙酯(50毫升)稀释并用饱和碳酸氢钠(50毫升)洗涤，再用饱和食盐水(50毫升)洗涤一次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩得到化合物1-F(410.00毫克,收率65.68％)。
步骤六：
化合物1-F(200.00毫克,570.83微摩尔)和(E)-叔丁基(叔丁氧基羰基)氨基(亚甲基)氨基甲酸酯(177.16毫克,570.83微摩尔)溶解在乙腈(2毫升)中并在20℃搅拌16小时，反应完毕浓缩，将剩余物进行硅胶柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝0～2/1梯度洗脱)得到化合物1-G(300.00毫克,收率86.91％)。
步骤七：
化合物1-G(300.00毫克,506.21微摩尔)溶解在异丙醇(3.00毫升)/水(3.00毫升)中，加入湿钯炭(50.00毫克,10％)，混合物在氢气氛围下于18-28℃搅拌2小时，过滤，得化合物1-H的异丙醇/水滤液，直接用于下一步反应。
步骤八：
在化合物1-H(250.00毫克,497.49微摩尔)的异丙醇(3.00毫升)/水(3.00毫升)中加入三氧化硫三甲胺配合物(69.24毫克,497.49微摩尔)和三乙胺(10.07毫克,99.50微摩尔,13.79微升)，将此混合物在18-28℃下搅拌16小时。反应完毕用乙酸乙酯/石油醚(2/1,6毫升，两次)洗涤，收集水相并加入四丁基硫酸氢胺(168.43毫克,496.07微摩尔)在室温下搅拌0.5小时，然后用乙酸乙酯(15毫升，两次)萃取，萃取液用饱和食盐水(10毫升)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得化合物1-I(400.00毫克,475.71微摩尔,收率95.89％)。
步骤九：
化合物1-I(200.00毫克,242.71微摩尔)溶解在无水二氯甲烷(2.00毫升)中，氮气氛围保护下冷却到0℃并加入三氟乙酸(1.54克,13.51毫摩尔,1.00毫升)搅拌2小时，再在25℃搅拌4小时，然后在空气中浓缩，剩余物用乙腈(2毫升)打浆三次得粗品用高效液相色谱分离得到化合物1(35.00毫克,收率18.91％)。1H NMR(400MHz,D2O)δ4.15(s,1H),4.10-4.08(m,2H),4.03-3.99(m,3H),3.26(d,J＝12Hz,1H),3.09(d,J＝12Hz,1H),2.13-1.99(m,2H),1.94-1.74(m,2H)；LCMS(ESI)m/z:383.1[M+H]+。
生物活性试验
1、对产金属酶大肠埃希菌的抑制活性试验
1.1、试验菌株
大肠埃希菌20-W2-18、ATCC–BAA-2452，由复旦大学附属华山医院抗生素研究所微生物组提供。
1.2、试验药物
化合物1按照制备例1获得，美罗培南(日本Sumitomo Dainippon Pharma公司；批号：2329C，2407C，2408C)。
1.3、最低抑菌浓度测定
根据Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)标准，采用微量肉汤稀释法测定美罗培南单药、化合物1单药以及两药联合(美罗培南：化合物1分别为1:1、2:1和4:1以及化合物1固定浓度为4μg/mL)的最低抑菌浓度((Minimal inhibitoryconcentration,MIC)。取50μL含5×105CFU/ml细菌的肉汤混合50μL药液于96孔板中，药液浓度自测试测试范围上限浓度呈2倍梯度向下稀释，或化合物1固定4μg/mL。18～24h内肉眼读取MIC值，其最低浓度结果见表1。具体的药物测试浓度范围为：(1)美罗培南：测试浓度范围为0.06–64μg/mL；(2)化合物1：测试浓度范围为0.125-64μg/mL；(3)美罗培南-化合物1(1:1)：测试浓度范围为0.06/0.06μg/mL-64/64μg/mL；(4)美罗培南-化合物1(2:1)：测试浓度范围为0.06/0.03μg/mL-64/32μg/mL；(5)美罗培南-化合物1(4:1)测试浓度范围为0.06/0.015μg/mL-64/16μg/mL；(6)美罗培南-化合物1(4μg/mL)：测试浓度范围为0.06/4-64/4μg/mL，化合物1浓度固定为4μg/mL。
表1本实验所用菌株最低抑菌浓度(mg/L)
表1试验数据表明，化合物1对产金属酶的大肠埃希菌展现出较好的抑制活性，而对产KPC酶的大肠埃希菌的抑制作用偏弱。化合物1与美罗培南的联合能够有效抑制产KPC酶大肠埃希菌，另外，化合物1与美罗培南的联合能够使产KPC酶大肠埃希菌的MIC均显著降低，化合物1固定4μg/mL时最为显著。
2、化合物1-美罗培南联合给药方案优化试验
2.1临床分离的碳青霉烯耐药肠杆菌药敏试验
为了解化合物1联合氨曲南或美罗培南在体外对近期主要产碳青霉烯酶临床分离菌的抗菌活性，测定了该药对近年来常见临床分离菌的最低抑菌浓度(MIC)，并与同类药及相关抗菌药物进行比较。
(1)受试药
化合物1：齐鲁制药有限公司提供；
阿维巴坦：齐鲁制药有限公司提供；
头孢他啶：齐鲁制药有限公司提供；
瑞来巴坦：齐鲁制药有限公司提供；
氨曲南：购自中国食品药品检定研究院；
环丙沙星：购自中国食品药品检定研究院；
美罗培南：购自中国食品药品检定研究院；
亚胺培南：默沙东制药有限公司生产；
阿米卡星：购自中国食品药品检定研究院；
多黏菌素B：购自中国食品药品检定研究院；
替加环素：惠氏制药有限公司生产。
(2)受试菌
收集2017年-2020年上海、北京、广东、浙江、安徽、云南、甘肃、新疆等22省市和自治区27家医院的临床分离株共290株肠杆菌目细菌，包括大肠埃希菌(含产KPC或NDM型碳青霉烯酶菌株)、肺炎克雷伯菌(含产KPC、NDM或OXA型碳青霉烯酶菌株)、阴沟肠杆菌(含产NDM型金属酶菌株)和其他肠杆菌目细菌(包括产气肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌和黏质沙雷菌等)，以及产KPC、NDM、OXA或VIM型碳青霉烯酶等的标准菌株24株。
(3)药物敏感性试验方法
采用2020年版CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)文件推荐的肉汤微量稀释法测定抗菌药物对290株临床受试菌株及24株标准菌株的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。
1)抗菌药溶液配制
氨曲南以氢氧化钠助溶用纯净水稀释；美罗培南用纯净水溶解并稀释；化合物1以0.85％生理盐水溶解并稀释。氨曲南或美罗培南分别与化合物1以1:1、2:1、4:1及化合物1固定浓度4mg/L的比例进行联合。其他抗菌药物按2020年版CLSI文件推荐方法进行溶解和稀释。
2)抗菌药物测试浓度
①化合物1和氨曲南单药：测试浓度范围为0.125-64mg/L；
②美罗培南：测试浓度范围为0.06-64mg/L；
③氨曲南-化合物1(4mg/L)：测试浓度范围为0.06/4-64/4mg/L，化合物1浓度固定为4mg/L；
④美罗培南-化合物1(4mg/L)：测试浓度范围为0.06/4-64/4mg/L，化合物1浓度固定为4mg/L；
⑤氨曲南-化合物1(1:1)：测试浓度范围为0.06/0.06mg/L-64/64mg/L；
⑥美罗培南-化合物1(1:1)：测试浓度范围为0.06/0.06mg/L-64/64mg/L；
⑦氨曲南-化合物1(2:1)：测试浓度范围为0.06/0.03mg/L-64/32mg/L；
⑧美罗培南-化合物1(2:1)：测试浓度范围为0.06/0.03mg/L-64/32mg/L；
⑨氨曲南-化合物1(4:1)：测试浓度范围为0.06/0.015mg/L-64/16mg/L；
⑩美罗培南-化合物1(4:1)测试浓度范围为0.06/0.015mg/L-64/16mg/L；
替加环素和多黏菌素E：测试浓度范围为0.125mg/L-16mg/L；
头孢他啶-阿维巴坦(4mg/L)、氨曲南-阿维巴坦(4mg/L)和亚胺培南/瑞来巴坦(4mg/L)：测试浓度范围为0.125/4mg/L-64/4mg/L；
环丙沙星和阿米卡星：测试浓度范围为：0.125mg/L-64mg/L。
3)培养基：
①阳离子调节肉汤：美国BD公司产品，批号：9015952；
②哥伦比亚血琼脂：温州康泰生物科技有限公司产品，批号：TH07179、T10312P、
TL0501P等；
③营养琼脂：英国OXIOD公司产品，批号：2851395。
4)接种菌量：受试菌菌液以0.5麦氏浊度管比浊后，稀释100倍，最终接种菌量为5×105CFU/mL。
5)培养条件：空气环境，35℃±2℃培养16-20小时。
6)结果阅读与判断：参照2018年版CLSI M07-A11(Methods for DilutionAntimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically；Approved Standard-Eleventh Edition)推荐的要求阅读药敏结果。抗菌药物的折点标准参照2020年版CLSI文件推荐标准；受试药氨曲南-化合物1的各种配比的联合均参照氨曲南的折点标准；受试药美罗培南-化合物1的各种配比的联合均参照美罗培南的折点标准；氨曲南-阿维巴坦对肠杆菌目细菌参照氨曲南的折点标准；亚胺培南/瑞来巴坦对肠杆菌目细菌参照亚胺培南的折点标准；替加环素参照美国FDA标准。
7)质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603，铜绿假单胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705等。
8)数据统计和药敏试验结果的判断：采用WHONET5.6软件，统计参数包括MIC范围、MIC50、MIC90及敏感率和耐药率。
(4)药敏测试结果
表2-表4的药敏试验结果显示，除对大肠埃希菌(包括产KPC或NDM型碳青霉烯酶菌株)的MIC90为4mg/L外，化合物1单药对其他受试革兰阴性菌的MIC90均≥32mg/L，提示单药对上述菌株基本无抗菌活性。化合物1与美罗培南以1:1的浓度联用后，对碳青霉烯耐药的大肠埃希菌(产KPC及NDM酶)和碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌(产KPC、OXA及NDM酶)的MIC90均低于4mg/L。
表2.美罗培南-化合物1等抗菌药对大肠埃希菌的体外抗菌活性
表3.美罗培南-化合物1等抗菌药对肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性
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表4.美罗培南-化合物1等抗菌药对肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的体外抗菌活性
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2.2动物PK/PD试验数据
为确定化合物1与美罗培南、氨曲南联合给药在小鼠CRE耐药模型中的PK/PD指数和靶值，采用ICR小鼠大腿肌肉CRE感染模型进行了试验。
(1)实验材料
1)受试药物
化合物1，批号：B0219F01，规格：0.25g/瓶，齐鲁制药有限公司生产。
美罗培南，批号：2416C，规格：0.5g/瓶，佳友制药(苏州)有限公司分装。
2)实验菌株
肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，产KPC-2酶；
临床分离肺炎克雷伯菌17-R1-16，产KPC-2；CTX-M-14酶；
临床分离肺炎克雷伯菌20-W2-70，产OXA-48酶。
3)实验动物
ICR小鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，体重25～30g，6-7周龄，雌性。
4)培养基及试剂
TSA，批号：9252365，购自BD公司。
TSB，批号：8297709，购自BD公司。
0.9％氯化钠注射液，批号M20041002A，四川科伦药业股份有限公司生产。
环磷酰胺，批号：19111925，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。
(2)实验方法
1)试验分组，具体见下如下表5。
表5化合物1与美罗培南联用的体内药效学试验动物分组
2)腹腔注射环磷酰胺形成免疫抑制小鼠
将环磷酰胺用0.9％氯化钠注射液配置成15mg/ml药液，于第1天和第4天腹腔注射所有动物，给药体积0.1ml/10g.bw，给药剂量150mg/kg，形成免疫抑制小鼠。
3)小鼠大腿肌肉感染模型制备
菌种复苏：从-80℃冰箱中取肺炎克雷伯菌18-W45-56，复苏至TSA平板，35±2℃培养过夜。
摇菌过夜：分别从平板上挑取单克隆于3ml TSB中，37℃220rpm摇菌过夜。
扩大培养：分别取过夜菌液稀释16倍测OD600，取原菌液接种至20ml TSB中(250ml锥形瓶)，37℃220rpm摇菌至对数生长期(0.4～0.8OD，约2～3h)。
离心洗涤：收集对数生长期菌液至离心管中，3860rpm室温离心10min，弃上清，加入2mL 0.9％氯化钠注射液重悬(约5OD/ml)，分别调整菌液至0.4OD/mL(约4×107CFU/mL)。
大腿肌肉接种菌液：接种前2h将小鼠两侧大腿被毛用剃毛器剃掉，肌肉注射前用75％酒精喷注射部位消毒，脱脂棉擦干，给各组小鼠两侧大腿肌肉注射菌液，50μl/侧，共100μl/只。
接种菌液计数：取注射后余下菌液，用0.9％氯化钠注射液(NS)进行10倍稀释，至合适的稀释度，取相邻的合适稀释度各50μl，用螺旋涂布仪涂TSA板，35±2℃培养过夜，计数菌落数(CFU)。
3)给药
于接种菌液后2h按照表6中的剂量开始腹腔注射受试药物，给药体积均为0.04ml/10g，每2小时给一次，共12次。
4)小鼠大腿肌肉组织细菌计数
于接种后2小时脱颈椎处死2h模型组小鼠，接种后26小时脱颈椎处死26h模型组小鼠并取小鼠大腿肌肉组织进行细菌计数。具体取样及计数方法如下：
75％乙醇喷小鼠皮肤消毒，无菌操作取感染部位肌肉组织，放入灭菌组织匀浆管中，称重，加入适量0.9％氯化钠注射液，匀浆器匀浆，参数为6.0m/s、40s，停顿5min后，再匀浆两次。
将同一只动物的双侧大腿组织匀浆液转移到1支15ml离心管中，分别用0.9％氯化钠注射液洗匀浆管3遍，最后定容至10ml。
将定容后的匀浆液进行10倍稀释，至合适的稀释度，取相邻的合适稀释度各50μl，用螺旋涂布仪涂TSA板，35±2℃培养过夜，计数菌落数(CFU)。
5)数据处理
绘制肌肉组织log10(CFU)散点图，计算log10(CFU)的均值和标准差，若接种后26h模型组的菌落数较2h模型组增长1-2个log10，表明感染模型成功，如出现菌落数较2h模型组下降2个log10的剂量组，则可用于计算PK/PD参数。
(3)试验结果
于肌肉注射接种肺炎克雷伯菌后2h开始腹腔注射化合物1与美罗培南的不同配比联用药液，给药体积0.04ml/10g，每隔2h给药1次，连续12次。接种后26h处死动物，无菌小鼠大腿肌肉组织，用生理盐水(NS)浸泡，组织匀浆，适当稀释后取50μl均匀涂布于TSA平板上，37℃孵箱中孵育过夜，计数菌落数，按稀释比例换算成每毫升的CFU，再将荷菌量以10为底作对数值用于PKPD分析。采用Emax模型对获得PKPD数据进行拟合，结果发现化合物1的PK/PD指数为％fT>1mg/L，PK/PD靶值为％fT>1mg/L＝64％。具体参见图1和表6。
表6化合物1的PK/PD指数及靶值
2.3化合物1及美罗培南的群体药代动力学分析
根据化合物1单次给药(给药剂量50-3000mg/人)、多次给药(500)及化合物1-美罗培南多次给药的PK数据分别建立了化合物1及美罗培南的群体药代动力学模型。化合物1的人群体药代动力学模型参数及变异范围(二房室模型)见表7，美罗培南的人群体药代动力学模型参数及变异范围(二房室模型)见表8。
表7化合物1的人群体药代动力学模型参数及变异范围(二房室模型)
PK参数 估算值 RSE％
CL 10.4 1.6
V1 8.73 2.2
V2 6.10 2.9
Q 6.91 4.9
λ -0.200 18.9
表8美罗培南的人群体药代动力学模型参数及变异范围(二房室模型)
PK参数 估算值 RSE％
CL 14.8 2.2
V1 10.5 2.8
V2 4.67 6.3
Q 5.96 11.2
2.4 PTA(达标概率)分析数据
根据化合物1及美罗培南群体药代参数及变异范围，采用蒙特卡洛模拟方法，按正态分布模拟1000次得到化合物1及美罗培南在人体的药时曲线及变异范围。根据化合物1PK/PD靶值(由小鼠获得的，％fT＞1mg/L：64，1-log降低)和美罗培南的PK/PD靶值(文献报道值，％fT＞MIC：50)，结合蒙特卡洛模拟的群体药时曲线及变异范围，计算的化合物1以一定给药方案和给药剂量在人体的PTA及美罗培南的覆盖的MIC值(化合物1∶美罗培南＝1∶1时测得的MIC值)简述如下：
(1)化合物1的达标概率
化合物1的给药频率为每8h给药一次，每次静脉输注给药2h，具体给药剂量下的暴露水平如下：
1)化合物1以500mg的剂量按上述给药方式给药后的PTA为90.5％；
2)化合物1以1000mg的剂量按上述给药方式给药后的PTA为98.3％；
(2)美罗培南的达标概率
美罗培南的给药频率为每8h给药一次，每次静脉输注给药2小时或3小时。根据美罗培南的PK/PD指数和靶值，评估了具体给药剂量下的美罗培南的暴露水平覆盖化合物1:美罗培南浓度比为1:1时测得的MIC值的情况。在具体评估中，根据建立的美罗培南群体药代动力学模型，以美罗培南以某一给定剂量给予人体后血药浓度在某一MIC值以上的时间比例大于美罗培南的PKPD靶值的概率为PTA，PTA大于90％即认为可覆盖这一MIC值。美罗培南的达标概率参见图2。
1)美罗培南以1000mg的剂量，静脉输注2h，按上述给药频率可覆盖1μg/mL及以下的的MIC值，即PTA大于90％；
2)美罗培南以2000mg的剂量，静脉输注2h，按上述给药频率可覆盖2μg/mL及以下的的MIC值，即PTA大于90％；
3)美罗培南以1500mg的剂量，静脉输注2h，按上述给药频率可覆盖2μg/mL及以下的的MIC值，即PTA大于90％；
4)美罗培南以2000mg的剂量，静脉输注3h，按上述给药频率可覆盖4μg/mL及以下的的MIC值，即PTA大于90％；
5)美罗培南以1500mg的剂量，静脉输注2h，按上述给药频率可覆盖4μg/mL及以下的的MIC值，即PTA大于90％。
根据药敏试验研究结果，化合物1:美罗培南浓度比为1:1时对碳青霉烯耐药的KPC阳性大肠埃希菌的MIC90为1μg/mL，对NDM阳性大肠埃希菌的MIC90为4μg/mL，对KPC阳性的肺炎克雷伯菌的MIC90为2μg/mL，对NDM阳性肺炎克雷伯菌的MIC90为4μg/mL，对OXA阳性肺炎克雷伯菌的MIC90为4μg/mL。PK/PD分析显示，化合物1以500mg剂量、美罗培南以1000mg剂量组合输注2h可达90％ PTA。化合物1以500mg-1000mg的剂量给药，美罗培南以1500mg-2000mg的剂量给药，静脉输注2小时或3小时，在临床上可对KPC阳性大肠埃希菌、NDM阳性大肠埃希菌、KPC阳性的肺炎克雷伯菌、NDM阳性肺炎克雷伯菌和OXA阳性肺炎克雷伯菌导致的感染有效。而化合物1与美罗培南可以1:4(例如500mg:2000mg)至1:1.5(例如1000mg:1500mg)之间的比例进行组合；例如化合物1与美罗培南可以1:2(例如500mg：1000mg)的比例进行组合，或者化合物1与美罗培南可以1000mg化合物1、2000mg美罗培南进行组合。这些特定比例的组合既可用于治疗前述细菌感染，也可按照上述比例制备成前述用途的药物组合物。

Claims (10)

1.化合物1或其药学上可接受的盐在制备用于治疗产金属酶大肠埃希菌感染的药物的用途；所述化合物1具有如下的化学结构：
2.权利要求1所述化合物1用于与美罗培南联合治疗碳青霉烯耐药肠杆菌感染的用途；优选地，所述碳青霉烯耐药肠杆菌为产金属酶大肠埃希菌、产KPC酶大肠埃希菌、碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌。
3.根据权利要求2所述用途，其特征在于，给予患者先后或者同时输注化合物1、美罗培南。
4.根据权利要求3所述用途，其特征在于，化合物1与美罗培南的质量比为1:1-1:4，优选1:1.5-1:4，更优选1:2。
5.根据权利要求2-4任一项所述用途，其特征在于，单次给予患者输注化合物1以500mg-1000mg的剂量给药、美罗培南以1500mg-2000mg的剂量给药，输注时间为2或3小时，一天3次给药；或者单次给予患者输注化合物1以500mg剂量、美罗培南以1000mg剂量给药，输注时间为2小时或3小时，一天3次给药；优选地，单次给予患者输注1000mg化合物1和2000mg美罗培南，输注时间为2或3小时，一天3次给药。
6.一种药物组合物，其包含权利要求1所述化合物1或其药学上可接受的盐、以及美罗培南；其中，化合物1与美罗培南的质量比为1:1-1:4，优选1:1.5-1:4，更优选1:2。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物含有500mg-1000mg化合物1、1500mg-2000mg美罗培南；或者所述组合物含有500mg化合物1以及1000mg美罗培南；优选地，所述组合物含有1000mg的化合物1和2000mg的美罗培南。
8.权利要求6-7任一项所述药物组合物在制备用于治疗碳青霉烯耐药肠杆菌感染的药物的用途；优先地，所述碳青霉烯耐药肠杆菌为产金属酶大肠埃希菌、产KPC酶大肠埃希菌、碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，给予患者输注权利要求6-7任一项所述的药物组合物，输注时间2或3小时，一天3次给药。
10.一种治疗碳青霉烯耐药肠杆菌感染的患者的方法，其特征在于，单次先后或同时给予患者输注500mg-1000mg权利要求1所述的化合物1、1500mg-2000mg美罗培南，输注时间为2或3小时，一天3次；或者单次先后或同时给予患者输注500mg权利要求1所述的化合物1以及1000mg美罗培南，输注时间2或3小时，一天3次给药；优选1000mg权利要求1所述的化合物1和2000mg美罗培南，输注时间2或3小时，一天3次给药。
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