CN117042796A

CN117042796A - 用激活抗原载体治疗癌症的方法

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Publication number: CN117042796A
Application number: CN202180094380.8A
Authority: CN
Inventors: O·罗斯
Original assignee: SQZ Biotechnologies Co
Current assignee: SQZ Biotechnologies Co
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-11-10
Also published as: US20220296691A1; JP2024501023A; EP4271408A1; CA3203356A1; WO2022147443A1

Abstract

本申请提供用于治疗HPV相关癌症的激活抗原载体(AAC)。AAC源自无核细胞，其中已经细胞内递送至少一种抗原和佐剂。在一些实施方案中，将所述AAC与检查点抑制剂如CTLA4拮抗剂和/或PD‑1/PD‑L1激动剂组合施用。

Description

用激活抗原载体治疗癌症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月29日提交的美国临时申请号63/131,506的权益，将该美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

ASCII文本文件序列表的提交

将以下提交的ASCII文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名：750322003540SEQLIST.TXT，记录日期：2021年12月23日，大小：13,033个字节)。

技术领域

本公开文本总体上涉及使用包含HPV抗原和佐剂的激活抗原载体(AAC)治疗患有HPV相关癌症的个体的方法、其剂量和方案。还公开了制造包含至少一种HPV抗原和佐剂的此类AAC及其组合物的方法。

背景技术

乳头瘤病毒是病毒粒子尺寸为直径约55nm的小型无包膜DNA病毒。已完全表征了超过100种HPV基因型，并且推测存在更高的数目。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知病因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且自发清除，但是一种致癌性HPV类型的持续性感染可能发展为癌前期或癌症。其他HPV相关疾病可以包括寻常疣、足底疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头瘤、疣状囊肿、喉乳头瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。

许多已知的人乳头瘤病毒(HPV)类型会引起良性病变，其一个子组是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，HPV类型分为十五种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV26、53和66)，已知它们共同表现为低级和高级宫颈变化和癌症以及其他肛门生殖器癌(诸如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌)以及头颈癌。最近，还描述了高风险型HPV 16和18与乳腺癌的相关性。已知被归类为“低风险型”的十一种HPV类型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)表现为良性低级宫颈变化、生殖器疣和复发性呼吸道乳头瘤病。皮肤HPV类型5、8和92与皮肤癌相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统受到抑制，并且相应地抗肿瘤应答显著受损。参见Suresh和Burtness Am J Hematol Oncol 13(6):20-27(2017)。

可以将免疫疗法大体上分为两种主要干预类型，即被动干预或主动干预。被动方案包括施用预激活和/或工程化细胞(例如，CAR T细胞)、疾病特异性治疗性抗体、和/或细胞因子。主动免疫疗法策略涉及体内刺激免疫系统效应子功能。若干种当前主动方案包括用疾病相关肽、裂解物或同种异体全细胞进行疫苗接种策略；输注作为肿瘤抗原递送的媒介物的自体树突细胞(DC)；以及输注免疫检查点调节剂。参见Papaioannou,Nikos E.等人Annals of translational medicine 4.14(2016)。可以采用过继免疫疗法来调节免疫应答，增强抗肿瘤活性并且实现治疗或预防HPV相关癌症的目的。

通过疾病相关抗原刺激的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4⁺辅助T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力；然而，当前用于诱导内源性T细胞应答的方法面临挑战。本文所述的方法用于有效地产生AAC，所述AAC可以是以高通量方式包含HPV抗原和/或佐剂的无核细胞或无核细胞来源的实体，其可以用于诱导针对HPV抗原的稳健T细胞应答。本文所述的方法还描述了用于使用包含HPV抗原和佐剂的AAC治疗患有HPV相关癌症的个体的方法、治疗、剂量和方案。

本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)均通过引用以其整体并入。专利出版物WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO 2017041050、WO2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO2020/072833、WO 2020/154696、和WO 2020/176789、US20180142198、和US 20180201889通过引用以其整体特此明确并入。

发明内容

在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含激活抗原载体(AAC)的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg，并且其中所述AAC包含细胞内递送的至少一种HPV抗原和佐剂。在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括：向所述个体施用有效量的包含激活抗原载体(AAC)的组合物，其中所述AAC包含细胞内递送的至少一种HPV抗原和佐剂，以及向所述个体施用有效量的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。在一些实施方案中，所述CTLA4的拮抗剂是结合CTLA4的抗体。在一些实施方案中，所述PD-1/PD-L1的拮抗剂是结合PD-1的抗体或结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，将结合CTLA-4的抗体和结合PD-1的抗体施用于所述个体。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，将结合CTLA-4的抗体施用于所述个体，并且将结合PD-L1的抗体施用于所述个体。在一些实施方案中，所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗。

在本发明的一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述AAC包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。

在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。

在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体对于HLA-A*02呈阳性。在一些实施方案中，所述AAC对于所述个体是自体的或同种异体的。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是当前、局部晚期或转移性癌症。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是头颈癌、宫颈癌、肛门癌或食道癌。在一些实施方案中，静脉内施用包含AAC的所述组合物。在一些实施方案中，静脉内、口服或皮下施用所述CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。在一些实施方案中，静脉内施用所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg、约2.5×10⁸个AAC/kg、约5×10⁸个AAC/kg或约7.5×10⁸个AAC/kg。

在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。在一些实施方案中，纳武单抗的有效量为约360mg。在一些实施方案中，阿特利珠单抗的有效量为约1200mg。

在一些实施方案中，在三周周期的第1天递送包含所述AAC的所述组合物。在一些实施方案中，进一步在第一个三周周期的第2天施用包含所述AAC的所述组合物。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个细胞/kg至约1×10⁹个细胞/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个细胞/kg、约2.5×10⁸个细胞/kg、约5.0×10⁸个细胞/kg或约7.5×10⁸个细胞/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个细胞/kg至约1×10⁹个细胞/kg。在一些实施方案中，在所述第一个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个细胞/kg、约2.5×10⁸个细胞/kg、约5.0×10⁸个细胞/kg或约7.5×10⁸个细胞/kg。

在一些实施方案中，每三周周期施用一次所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，每两个三周周期施用一次所述结合CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用所述结合CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用所述结合PD-1的抗体。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是纳武单抗，其中将所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗在两个三周周期的第一个三周周期的第1天以约1mg/kg的剂量施用，并且将所述结合PD-1的抗体在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天以约360mg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述结合PD-L1的抗体在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用。在一些实施方案中，将所述结合PD-L1的抗体以约1200mg的剂量施用。在一些实施方案中，将包含PBMC的组合物施用于所述个体持续至少约三个月、六个月、九个月或一年。

在一些实施方案中，包含AAC的所述组合物包含在冷冻保存介质中的约1×10⁹个AAC至约1×10¹⁰个AAC。在一些实施方案中，包含AAC的所述组合物包含在约10mL冷冻保存介质中的约7×10⁹个PBMC。在一些实施方案中，所述冷冻保存介质是CS2。在一些实施方案中，通过包括以下步骤的方法制备包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的所述AAC：a)使包含输入无核细胞群的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞群与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入无核细胞，从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红细胞。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6的肽和源自HPV E7的肽。

附图说明

图1示出了对于群组1的治疗方案。

图2示出了对于群组2a的治疗方案。

图3示出了对于群组2b的治疗方案。

图4示出了对于群组2c的治疗方案。

图5A和图5B示出了包含HPV抗原的AAC相对于未加工的红细胞的表面磷脂酰丝氨酸水平，并且其是使用FACS通过膜联蛋白V+事件的数目测量的。将细胞在PBS(图5A)或RPMI(图5B)中加工。

图6示出了FAM+事件的百分比(对单线态进行门控)。将AAC-HPV和未加工的RBC用作阴性对照。每组示出的每个点源自单独实验中分析的单独供体的数据，由圆圈表示。对于第三个实验示出的值(对于每个条件的右手侧圆圈)是来自重复样品的数据的平均值。

图7示出了膜联蛋白V+事件的百分比(对单线态进行门控)。将未加工的RBC用作阴性对照。每组示出的每个点源自单独实验中分析的单独供体的数据，由圆圈表示。对于第三个实验示出的值(对于每个条件的右手侧圆圈)是来自重复样品的数据的平均值。

图8示出了来自显示的三名单独供体的AAC-HPV(F-E6、E7)的代表性图像(FAM以绿色显示，并且PB以蓝色显示)。在每个图像下方示出了沿着跨AAC-HPV(F-E6、E7)的长度所画的线显示归一化(针对最小信号和最大信号)FAM(绿色)和PB(蓝色)荧光强度的图。

图9示出了来自显示的三名单独供体的AAC-HPV(F-E6、E7)的代表性图像(FAM以绿色显示，并且PB以蓝色显示)。在每个图像下方示出了沿着跨AAC-HPV(F-E6、E7)的长度所画的线显示归一化(针对最小信号和最大信号)FAM(绿色)和PB(蓝色)荧光强度的图。

图10示出了来自显示的三名单独RBC供体的AAC-HPV(用作FAM荧光的阴性对照)的代表性图像(FAM以绿色显示，并且PB以蓝色显示)。在每个图像下方示出了沿着跨AAC-HPV的长度所画的线显示归一化FAM(绿色)和PB(蓝色)荧光强度的图。A中的显示设置对应于图8中用于AAC-HPV(F-E6、E7)的显示设置。B中的显示设置对应于图9中用于AAC-HPV(E6、F-E7)的显示设置。

图11示出了在37℃(红)和4℃(蓝)下孵育的CD11c+MODC/PKH26标记的AAC-HPV共培养物和在37℃(绿)下孵育的MODC/AAC-HPV共培养物中测量的PKH26荧光(生物重复样品的平均值±平均值的标准差)。出于显示的目的，(没有PKH26标记的)AAC-HPV的条件在x轴上绘制在0.2处。每个图代表独立的实验。每个实验用不同的人血液和MODC供体执行。

图12呈现了示出与仅对照培养基相比，在37℃下与C-培养基或AAC-HPV共培养之后46小时，在MODC上CD80、CD83、CD86和MHC-II表面水平的几何平均荧光强度(MFI)的倍数变化的汇总数据。来自单独MODC供体的数据以不同的圆圈示出。*＝P<0.05；**＝P<0.01。

图13示出了描绘与MODC和培养基对照、SQZ-AAC-HPV或游离E7SLP共培养约24小时之后从E7特异性CD8+ T细胞分泌的IFNγ值的图。每个图对应于与不同批次的SQZ-AAC-HPV的共培养物。将MODC和CD8+ T细胞共培养物与培养基对照、SQZ-AAC-HPV或游离E7肽一起孵育。每个单独数据点(完整圆圈)对应于共培养物样品的单独孔。FP数代表批号。

图14示出了来自2个独立实验的在施用M-AAC-HPV或M-C-培养基之后14-16小时CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)、CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)和F4/80⁺CD11b^lo/-细胞(RPM)的CD86几何MFI的汇总数据。每个图代表单独的实验。与接受M-C-培养基的小鼠相比，接受M-AAC-HPV的小鼠具有更高的CD86几何MFI。*＝P<0.05。

图15示出了来自2个独立实验的在施用M-AAC-HPV或M-C-培养基之后14-16小时CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)、CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)和F4/80⁺CD11b^lo/-(RPM)的CD83几何MFI的汇总数据。与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中，CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)和CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)具有更高的CD83几何MFI。值得注意的是，在一个实验中，CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)的CD83几何MFI具有阴性数据值，并且因此未显示在图上。如Bagwell BS和Park DR等人所提到的，光谱交叉补偿是一个减法过程，其是正确解释多参数流式细胞仪数据所必需的。作为结果，在荧光补偿之后，对于特定染料基本上未染色或呈阴性的细胞群的数据值应或多或少地正态分布在低值周围。因此，由计算的补偿产生的数据集通常(并且适当地)包括分布延伸到零以下的群体。*＝P<0.05。

图16示出了来自2个独立实验的在施用M-AAC-HPV或M-C-培养基之后14-16小时CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)、CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)和F4/80⁺CD11b^lo/-细胞(RPM)的CD40几何MFI的汇总数据。每个图代表单独的实验。与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中，CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)和CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)具有更高的CD40几何MFI。*＝P<0.05。

图17示出了来自2个独立实验的在施用M-AAC-HPV或M-C-培养基之后14-16小时CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)、CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)和F4/80⁺CD11b^lo/-细胞(RPM)的CD80几何MFI的汇总数据。每个图代表单独的实验。与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中，CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)和CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)具有更高的CD80几何MFI。*＝P<0.05。

图18示出了来自2个独立实验的在施用M-AAC-HPV或M-C-培养基之后14-16小时CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)、CD11c^hiMHC-II^hiCD11b⁺细胞(CD11b⁺DC)和F4/80⁺CD11b^lo/-细胞(RPM)的MHC-II几何MFI的汇总数据。每个图代表单独的实验。与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中，CD11c^hiMHC-II^hiCD8⁺细胞(CD8⁺DC)和F4/80⁺CD11b^lo/-细胞(RPM)具有更高的MHC-II几何MFI。NA表示“不适用”。*＝P<0.05。

图19示出了在引发E7特异性CD8⁺ T细胞应答中对抗原(E7SLP)和佐剂(聚I:C)的需求。示出了IFNγ⁺CD8⁺ T细胞的百分比。****＝P<0.0001。

图20示出了m-AAC-HPV剂量对E7特异性CD8⁺ T细胞应答大小的影响。示出了IFNγ⁺CD44⁺CD8⁺ T细胞的百分比。B＝10⁹；M＝10⁶。n.s.＝在统计学上不显著(P≥0.05)；*＝P<0.05；***＝P<0.001；****＝P<0.0001。

图21示出了对于各组在全血中测量的E7-四聚体⁺激活的(CD44^hi)CD8⁺ T细胞的百分比。数据如下呈现：PBS(第0天)-末次给药后8天(研究第8天)；单独初免(第0天)-末次给药后8天(研究第8天)，加强(第2天)-末次给药后8天(研究第10天)；加强(第6天)-末次给药后7天(研究第13天)。**＝P<0.01；***＝P<0.001。

图22示出了对于各组在全血中测量的E7-四聚体⁺激活的(CD44^hi)CD8⁺ T细胞的百分比。数据如下呈现：PBS(第0天)-末次给药后13天(研究第13天)；单独初免(第0天)-末次给药后13天(研究第13天)，加强(第2天)-末次给药后13天(研究第15天)；加强(第6天)-末次给药后14天(研究第21天)。**＝P<0.01；****＝P<0.0001。

图23示出了对于各组在全血中测量的E7-四聚体⁺激活的(CD44^hi)CD8⁺ T细胞的百分比。数据如下呈现：PBS(第0天)-末次给药后21天(研究第21天)；单独初免(第0天)-末次给药后21天(研究第21天)，加强(第2天)-末次给药后21天(研究第23天)。**＝P<0.01。

图24A和图24B示出了在两个实验中，对于每个实验组示出的肿瘤体积(平均值±平均值的标准误差)随时间推移的汇总数据。线在达到组的中位存活期时终止。“M”表示百万；“B”表示十亿。

图25示出了两个不同实验组的存活数据。括号中的数字指示以天计的中位存活期。

图26示出了每个实验组的肿瘤体积(平均值±平均值的标准误差)随时间推移的汇总数据。线在达到组的中位存活期时终止。“B”表示十亿，并且“M”表示百万。n＝10只小鼠/组。

图27示出了实验组的存活数据。括号中的数字指示中位存活期。

图28示出了在(A-B)实验1和(C-D)实验2中，每个实验组的肿瘤体积(平均值±平均值的标准误差)随时间推移的汇总数据。线在达到组的中位存活期时终止。“M”表示百万。n＝10只小鼠/组。

图29示出了两个实验组的存活数据。括号中的数字指示以天计的中位存活期。“M”表示百万。n＝10只小鼠/组。

图30A-图30F示出了CD8+ T细胞的百分比，其显示为占活细胞群的百分比。(图30B、图30E)。E7特异性(四聚体⁺)细胞的百分比显示为占活细胞群的百分比，并且(图30C、图30F)显示为占CD8+ T细胞群的百分比。示出了来自(图30A-图30C)实验1和(图30D-图30F)实验2的数据。示出了M-AAC-HPV治疗组与PBS治疗组相比的统计学显著性(*p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001)。

图31A-图31D示出了分别代表针对100mg肿瘤归一化的CD8⁺ T细胞和E7特异性(四聚体⁺)CD8⁺ T细胞的数目的图。示出了M-AAC-HPV治疗组与PBS治疗组相比的统计学显著性(**p<0.01，***p<0.001)。

图32示出了每个实验组中包括的小鼠的平均肿瘤体积随时间推移的汇总数据。在第14天(实验1)或第13天(实验2)执行M-AAC-HPV免疫，并以虚线指示。示出了直到收获肿瘤时(对于实验2，第26天，或对于实验2，第25天)的数据(平均值±平均值的标准误差)。应注意，选择免疫后第12天的时间点(肿瘤植入后25天或26天)以确保在治疗组中有足够的肿瘤物质可用于加工和分析。

图33示出了如通过Luminex分析所测量的在重复静脉内施用m-AAC-HPV后小鼠中的体内血清细胞因子/趋化因子分析的研究设计。

图34示出了PKH26标记的细胞在全血中的百分比。*＝P<0.05(通过比较PKH26标记的细胞在指示的时间点在M-AAC-HPV中的百分比与在相应时间点在PBS对照中的百分比来计算P值)。

具体实施方式

在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含激活抗原载体(AAC)的组合物，其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂。

在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂；以及施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂(诸如但不限于伊匹单抗)、PD-1的拮抗剂(诸如但不限于纳武单抗)和/或PD-L1的拮抗剂(诸如但不限于阿特利珠单抗)。

在一些方面，本发明提供了用于治疗个体中的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂；以及施用有效量的伊匹单抗、纳武单抗或阿特利珠单抗中的一种或多种，其中所述AAC包含所述至少一种HPV抗原和佐剂，和/或将所述一种或多种免疫检查点抑制剂以三周周期施用，其中AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg，其中伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg，其中纳武单抗的有效量为约360mg/kg，并且其中阿特利珠单抗的有效量为约1200mg。

还提供了包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物，以及制备包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的所述AAC的方法。在一些实施方案中，通过包括以下步骤的方法制备所述AAC：a)使包含输入无核细胞群的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞群与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞，从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。还提供了用于诱导针对HPV抗原的免疫应答或用于治疗HPV相关癌症的组合物。还提供了包含有效量的所述AAC的组合物在制造用于刺激针对HPV抗原的免疫应答或用于治疗HPV相关癌症的药物中的用途。

通用技术

本领域技术人员通常充分理解并且通常使用常规方法来使用本文描述或提及的技术和程序，所述常规方法例如像以下文献中描述的广泛使用的方法：MolecularCloning:A Laboratory Manual(Sambrook等人,第4版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；丛书Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编辑,1988)；Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6版,J.Wiley and Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑,Academic Press,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编辑,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等人,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A PracticalApproach(D.Catty.编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A PracticalApproach(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood AcademicPublishers,1995)；以及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编辑,J.B.Lippincott Company,2011)

定义

出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语也包括复数，并且反之亦然。在下文阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文献发生冲突的情况下，应该以阐述的定义为准。

如本文所用，除非另外指出，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。

如本文所用的术语“包含”、“具有”、“含有”和“包括”以及其他类似形式及其语法等效词旨在在含义上是等效的并且是开放式的，即这些词中的任何一个之后的一个或多个物品并不意味着是此类一个或多个物品的详尽列表，或并不意味着仅限于所列出的一个或多个物品。例如，“包含”组分A、B和C的制品可以由(即，仅含有)组分A、B和C组成，或者可以不仅含有组分A、B和C，而且可以含有一种或多种其他组分。因此，预期并理解“包含”及其类似形式及其语法等效词包括“基本上由……组成”或“由……组成”的实施方案的公开。

在提供值范围的情況下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限值和下限值之间的为下限值的单位的十分之一的每个中间值以及所述的范围内的任何其他所述的或中间值涵盖在本公开文本内，受限于在所述的范围中的任何具体排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除了那些被包括的任一个或两个限值的范围也被包括在本公开文本之内。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。

如本文所用，“无核细胞”是指缺少细胞核的细胞。此类细胞可以包括但不限于血小板、红细胞(RBC)(如红血球和网织红细胞)。网织红细胞是未成熟的(例如，尚未双凹的)红细胞，典型地占人体红细胞的约1％。网织红细胞也是无核的。在某些实施方案中，本文所述的系统和方法用于处理和/或加工富集的(例如，占总细胞群的百分比大于在自然界中发现的)、纯化的或分离的(例如，从它们的自然环境，以基本上纯的或均质的形式)无核细胞(例如，RBC、网织红细胞、和/或血小板)群。在某些实施方案中，本文所述的系统和方法用于处理和/或加工含有RBC(例如，红血球或网织红细胞)、血小板以及其他血细胞的全血。这些细胞类型的纯化或富集使用已知方法完成，所述已知方法诸如密度梯度系统(例如，Ficoll-Hypaque)、荧光激活细胞分选(FACS)、磁性细胞分选或成红细胞和类红细胞前体的体外分化。

如本文所用的术语“囊泡”是指包含被脂质双层包围的液体的结构。在一些例子中，所述脂质双层来源于天然存在的脂质组合物。在一些例子中，所述脂质双层可以来源于细胞膜。在一些例子中，囊泡可以源自各种实体，诸如细胞。在此类例子中，囊泡可以保留来自原始实体的分子(如细胞内蛋白或膜组分)。例如，源自红细胞的囊泡可以含有在红细胞和/或红细胞的膜组分中的任何数目的细胞内蛋白。在一些例子中，除了所需的有效载荷外，囊泡还可以含有任何数目的细胞内分子。

如本文所用，“有效载荷”是指被递送至(如加载到)AAC(例如，AAC)中的物质。“有效载荷”、“货物”、“递送材料”和“化合物”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，有效载荷可以指蛋白质、小分子、核酸(例如，RNA和/或DNA)、脂质、糖类、大分子、维生素、聚合物、荧光染料和荧光团、碳纳米管、量子点、纳米颗粒和类固醇。在一些实施方案中，所述有效载荷可以指蛋白质或小分子药物。在一些实施方案中，所述有效载荷可以包含一种或多种化合物。

术语“异源的”当其涉及核酸序列(如编码序列和控制序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞缔合的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或与其附接的核酸区段，所述核酸区段在自然界中未发现与另一分子缔合。例如，核酸构建体的异源区域可以包括如下编码序列，所述编码序列侧接在自然界中未发现与所述编码序列缔合的序列。异源编码序列的另一个例子是其中编码序列本身在自然界中未被发现的构建体(例如，具有与天然基因不同的密码子的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，被细胞中通常不存在的构建体转化的细胞将被认为是异源的。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生如本文所用的异源DNA。

术语“异源的”当其涉及氨基酸序列(如肽序列和多肽序列)时表示通常不连接在一起和/或通常不与特定细胞缔合的序列。因此，肽序列的“异源”区域是在另一个氨基酸分子内或与其附接的氨基酸区段，所述氨基酸区段在自然界中未发现与另一分子缔合。例如，肽构建体的异源区域可以包括侧接如下序列的肽的氨基酸序列，所侧接的序列在自然界中未发现与所述肽的氨基酸序列缔合。异源肽序列的另一个例子是如下构建体，其中肽序列自身在自然界中未被发现(例如，具有与天然基因所编码不同的氨基酸的合成序列)。类似地，出于本发明的目的，用表达通常不存在于细胞中的氨基酸构建体的载体转化的细胞将被认为是异源的。等位基因变异或天然存在的突变事件不产生如本文所用的异源肽。

术语“外源”在关于涉及细胞或细胞来源的囊泡的药剂(如抗原或佐剂)使用时，是指在细胞外的药剂或从细胞外递送到细胞内的药剂。细胞可能具有或可能不具有已经存在的药剂，并且在已递送外源药剂之后可能产生或可能不产生所述药剂。

如本文所用的术语“同源的”是指源自相同生物体的分子。在一些例子中，所述术语是指通常在给定生物体内发现或表达的核酸或蛋白质。

如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得有益的或所希望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或所希望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减小疾病的程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的传播(例如，转移)，预防或延迟疾病的复发，延迟或减缓疾病的进展，改善疾病状态，提供疾病的缓解(部分的或全部的)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，提高或改进生活质量，增加体重，和/或延长存活期。“治疗”还涵盖减少癌症的病理后果(例如像肿瘤体积)。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。

如本文所用，术语“预防性治疗”是指这样的治疗，其中已知或怀疑个体患有障碍或具有患上障碍的风险，但尚未展示出所述障碍的症状或展示出所述障碍的最小症状。可以在症状发作前治疗经历预防性治疗的个体。在一些实施方案中，如果个体患有癌前病变，特别是与HPV感染相关的癌前病变，则可以对其进行治疗。

如本文所用，“组合疗法”意指将第一药剂与另一种药剂结合施用。“与……结合”是指除了一种治疗模态外还施用另一种治疗模态，如除了向同一个体施用如本文所述的免疫缀合物外还施用如本文所述的有核细胞的组合物。因此，“与……结合”是指在向个体递送一种治疗模态之前、期间或之后施用另一种治疗模态。

如本文所用，术语“同时施用”意指组合疗法中的第一疗法和第二疗法以不超过约15分钟，如不超过约10、5或1分钟中的任何一个的时间间隔施用。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可以包含在同一组合物中(例如，包含第一疗法和第二疗法两者的组合物)或在单独的组合物中(例如，第一疗法在一种组合物中，并且第二疗法包含在另一种组合物中)。

如本文所用，术语“依序施用”意指组合疗法中的第一疗法和第二疗法以大于约15分钟，如大于约20、30、40、50、60分钟或更多分钟中的任何一个的时间间隔施用。可以首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独的组合物中，所述组合物可以包含在相同或不同的包装或试剂盒中。

如本文所用，术语“并行施用”意指在组合疗法中第一疗法的施用和第二疗法的施用彼此重叠。

在癌症的背景下，术语“治疗”包括以下中的任何一个或全部：杀死癌细胞、抑制癌细胞的生长、抑制癌细胞的复制、减低总体肿瘤负荷以及改善与疾病相关的一种或多种症状。

如本文所用，术语“调节”可以指变化、改变、变动或以其他方式修改特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指导致变化、改变、变动或以其他方式修改免疫应答的任何行为。在一些例子中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些例子中，“调节”是指阻抑特定靶标的存在或活性。在其他例子中，调节核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的改变、mRNA丰度的改变(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的相应改变、mRNA翻译的改变等。

如本文所用，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其他方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指导致免疫应答的阻断、减少、消除或任何其他拮抗的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的抑制可以包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，使mRNA转录沉默)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制、基因编辑等。在其他例子中，对蛋白质表达的抑制可以包括但不限于编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的降低、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的降低等。在另一个例子中，抑制可以指减缓或停止生长，例如延缓或阻止肿瘤细胞生长的行为。

如本文所用，术语“阻抑”可以指降低、减少、禁止、限制、减低或以其他方式削弱特定靶标的存在或活性的行为。阻抑可以指部分阻抑或完全阻抑。例如，阻抑免疫应答可以指导致降低、减少、禁止、限制、减低或以其他方式削弱免疫应答的任何行为。在其他例子中，对核酸表达的阻抑可以包括但不限于核酸转录的降低、mRNA丰度的降低(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在其他例子中，对蛋白质表达的阻抑可以包括但不限于编码蛋白质的核酸转录的减少、编码蛋白质的mRNA稳定性的降低、蛋白质翻译的抑制、蛋白质稳定性的降低等。

如本文所用，术语“增强”可以指改进、加强、提高或以其他方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指导致改进、加强、提高或以其他方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性例子中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来改进、加强、提高或以其他方式增加免疫应答。在其他例子中，增强核酸的表达可以包括但不限于增加核酸的转录，增加mRNA丰度(例如，增加mRNA转录)，减少mRNA的降解，增加mRNA翻译等。在其他例子中，增强蛋白质的表达可以包括但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。

如本文所用，术语“诱导”可以指引发、促进、刺激、建立或以其他方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指导致引发、促进、刺激、建立或以其他方式产生所希望的免疫应答的任何行为。在其他例子中，诱导核酸的表达可以包括但不限于核酸转录的引发、mRNA翻译的引发等。在其他例子中，诱导蛋白质的表达可以包括但不限于增加编码蛋白质的核酸的转录、增加编码蛋白质的mRNA的稳定性、增加蛋白质的翻译、增加蛋白质的稳定性等。

如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA；基因组DNA；cDNA；DNA-RNA杂合体；或包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然的、化学修饰的或生化修饰的非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸基团(如典型地可以在RNA或DNA中发现的)或者经修饰或取代的糖或磷酸基团。多核苷酸的骨架可以包含通过肽键(即，肽核酸)连接的重复单元，如N-(2-氨基乙基)-甘氨酸。可替代地，多核苷酸的主链可以包含合成亚基(如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯)的聚合物，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH₂)或混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯寡聚物或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。另外，双链多核苷酸可以从化学合成的单链多核苷酸产物，通过合成互补链并在适当的条件下使所述链退火或者通过使用DNA聚合酶用适当的引物从头合成互补链来获得。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于肽，寡肽，氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质及其片段两者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指如下蛋白质，其包括对天然序列的修饰(如缺失、添加和取代)(在本质上通常是保守的)，只要所述蛋白质保持所希望的活性即可。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增而引起的错误。

如本文所用，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与单独的抗原相比，将佐剂与抗原结合施用以实现针对抗原的免疫应答的增强。本文描述了各种佐剂。

术语“CpG寡聚脱氧核苷酸”和“CpG ODN”在本文中是指长度为10至30个核苷酸的DNA分子，其含有被磷酸酯隔开的胞嘧啶和鸟嘌呤的二核苷酸(在本文中也称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开的CpG ODN含有至少一种未甲基化的CpG二核苷酸。也就是说，所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶未被甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)骨架。

如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”意指不是生物学上或在其他方面不希望的材料，例如所述材料可以掺入施用于患者的药物组合物中而不引起任何显著的不希望的生物学作用或不与含有它的组合物的任何其他组分以有害方式相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选符合毒理学和制造测试的要求标准和/或包括在美国食品和药物管理局编写的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。

对于本文所述的任何结构和功能特征，确定这些特征的方法是本领域中已知的。

如本文所用，“微流体系统”是指其中加工低容量(例如，mL、nL、pL、fL)流体以实现小体积液体的离散处理的系统。本文所述的某些实施方式包括多路复用、自动化和高通量筛选。可以移动、混合、分离或以其他方式加工流体(例如，缓冲液、溶液、含有有效载荷的溶液或细胞悬浮液)。在本文所述的某些实施方案中，微流体系统用于对悬浮在缓冲液中的细胞施加诱导细胞中的扰动的机械缩窄部(例如，洞)，从而允许有效载荷或化合物进入细胞的细胞溶胶中。

如本文所用，“缩窄部”可以指由入口部、中心点和出口部限定的微流体通道的一部分，其中中心点由宽度、长度和深度限定。在其他例子中，缩窄部可以指孔或者可以是孔的一部分。所述孔可以包括在表面(例如，过滤器和/或膜)上。

治疗方法

在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂。

在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁷个AAC/kg至约5×10¹⁰个AAC/kg，并且其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂。

在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关癌症。在一些实施方案中，所述HPV相关癌症是宫颈癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌、唾液腺癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。在一些实施方案中，所述HPV相关疾病是HPV相关感染性疾病。

在一些实施方案中，AAC的有效量约为以下量中的任何一个：0.5×10⁶、1.0×10⁶、0.5×10⁷、1.0×10⁷、0.5×10⁸、1.0×10⁸、0.5×10⁹、1.0×10⁹、0.5×10¹⁰、1.0×10¹⁰、0.5×10¹¹和1.0×10¹¹个AAC/kg。在一些实施方案中，所述有效量为以下量中的任何一个：约0.5×10⁶至约1.0×10⁶、约1.0×10⁶至约0.5×10⁷、约0.5×10⁷至约1.0×10⁷、约1.0×10⁷至约0.5×10⁸个AAC、约0.5×10⁸至约1.0×10⁸、约1.0×10⁸至约0.5×10⁹个AAC、约0.5×10⁹至约1.0×10⁹、约1.0×10⁹至约0.5×10¹⁰个AAC、约0.5×10¹⁰至约1.0×10¹⁰、约1.0×10¹⁰至约0.5×10¹¹或约0.5×10¹¹至约1.0×10¹¹个AAC/kg。在一些实施方案中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸至约1×10⁹个AAC/kg，并且其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。示例性免疫检查点抑制剂是以下物质但不限于以下物质的拮抗剂：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下物质中的一种或多种的拮抗剂：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下物质中的一种或多种：结合PD-1的抗体、结合PD-L1的抗体、结合CTLA-4的抗体、结合LAG3的抗体、结合TIM-3的抗体、结合TIGIT的抗体、结合VISTA的抗体、结合TIM-1的抗体、结合B7-H4的抗体或结合BTLA的抗体。在另外的实施方案中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)。在另外的实施方案中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种化学化合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种肽。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向CTLA-4。

在一些实施方案中，提供了治疗个体的HPV相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸至约1×10⁹个AAC，并且其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂；以及施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是CTLA-4的拮抗剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是PD-1的拮抗剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是PD-L1的拮抗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括CTLA-4的拮抗剂、PD-1的拮抗剂和/或PD-L1的拮抗剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合PD-1的抗体。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包括结合CTLA-4的抗体、结合PD-1的抗体和/或结合PD-L1的抗体。

在一些方面，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸至约1×10⁹个AAC，并且其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂；以及施用有效量的以下物质：CTLA-4的拮抗剂、PD-1的拮抗剂和/或PD-L1的拮抗剂。在一些实施方案中，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸至约1×10⁹个AAC，并且其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂；以及施用有效量的以下物质：结合CTLA-4的抗体、结合PD-1的抗体和/或结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是派姆单抗。在一些实施方案中，所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗。在一些实施方案中，将结合CTLA-4的抗体施用于所述个体。在一些实施方案中，将结合PD-L1的抗体施用于所述个体。在一些实施方案中，将结合PD-1的抗体施用于所述个体。

在一些方面，提供了用于刺激个体中针对HPV抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含AAC(例如RBC来源的囊泡)的组合物，其中所述AAC包含HPV抗原；其中将所述至少一种HPV抗原细胞内递送至所述AAC。在一些实施方案中，所述AAC进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量的本文所述的组合物中的任一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。

在一些方面，提供了用于减少个体中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含AAC(例如RBC来源的囊泡)的组合物，其中所述AAC包含HPV抗原；其中将所述至少一种HPV抗原细胞内递送至所述AAC。在一些实施方案中，所述AAC进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量的本文所述的组合物中的任一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。

在一些方面，提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含AAC(例如RBC来源的囊泡)的组合物，其中所述AAC包含HPV抗原；其中将所述至少一种HPV抗原细胞内递送至所述AAC。在一些实施方案中，所述AAC进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量的本文所述的组合物中的任一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。

在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包含AAC(例如RBC来源的囊泡)的组合物，其中所述AAC包含HPV抗原；其中将所述至少一种HPV抗原细胞内递送至所述AAC。在一些实施方案中，所述AAC进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用有效量的本文所述的组合物中的任一种。

在一些方面，提供了一种用于刺激个体中针对HPV抗原的免疫应答的方法，所述方法包括：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC；以及c)向所述个体施用有效量的包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。

在一些方面，提供了一种用于减少个体中的肿瘤生长的方法，所述方法包括：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC；以及c)向所述个体施用有效量的包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。

在一些方面，提供了一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使HPV抗原或所述至少一种HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC；以及c)向所述个体施用有效量的包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。

在一些方面，提供了一种用于治疗个体的癌症的方法，所述方法包括：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC；以及c)向所述个体施用有效量的包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。

在根据本文所述的方法、用途或组合物中任一种的一些实施方案中，所述方法包括：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使HPV抗原通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原的AAC；以及c)向所述个体施用有效量的包含所述至少一种HPV抗原的AAC。

在一些实施方案中，提供了一种用于刺激个体中针对HPV蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包含有效量的如本文所述的包含含有HPV抗原的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。在一些实施方案中，提供了一种用于治疗个体的癌症的组合物，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，所述癌症是宫颈癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌、唾液腺癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。

在一些实施方案中，提供了一种用于刺激个体中针对HPV蛋白的免疫应答的组合物，其中所述组合物包含有效量的如本文所述的包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。在一些实施方案中，提供了一种用于治疗个体中的癌症的组合物，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物中的任何一种。

在一些实施方案中，提供了包含有效量的AAC的组合物在制造用于刺激针对HPV抗原的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，提供了包含有效量的AAC的组合物在制造用于减少个体中的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。在一些实施方案中，提供了包含有效量的AAC的组合物在制造用于治疗个体的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原的AAC的组合物中的任何一种。

在一些实施方案中，提供了包含有效量的AAC的组合物在制造用于刺激针对HPV抗原蛋白的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，提供了包含有效量的AAC的组合物在制造用于减少个体中的肿瘤生长的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物中的任何一种。在一些实施方案中，所述个体患有癌症。在一些实施方案中，提供了包含有效量的AAC的组合物在制造用于治疗个体中的癌症的药物中的用途，其中所述组合物包含有效量的本文所述的包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物中的任何一种。

在根据本文所述的方法、用途或组合物的一些实施方案中，所述个体患有癌症。在一些实施方案中，所述癌症是宫颈癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌、唾液腺癌、口咽癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、皮肤癌或头颈癌。在一些实施方案中，所述癌症是与HPV相关的癌症。在一些实施方案中，所述癌症是局部癌症。在一些实施方案中，所述癌症是局部癌症。在一些实施方案中，所述癌症是局部晚期癌症。在一些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是液体瘤。

在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为以下中的任何一个：所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约3.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约或小于以下值中的任何一个：0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm。在一些实施方案中，使包含所述输入无核细胞的细胞悬浮液通过多个缩窄部，其中所述多个缩窄部是串联和/或并联布置的。

在一些实施方案中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施方案中，所述无核细胞是红血球或网织红细胞。在一些实施方案中，所述AAC是无核细胞来源的囊泡。在一些实施方案中，所述AAC是RBC来源的囊泡或血小板来源的囊泡。在一些实施方案中，所述AAC是红血球来源的囊泡或网织红细胞来源的囊泡。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞对于将接受所述组合物的个体是自体的。在一些实施方案中，所述输入无核细胞对于将接受所述组合物的个体是同种异体的。在一些实施方案中，所述AAC对于将接受所述组合物的个体是自体的。在一些实施方案中，所述输入AAC对于将接受所述组合物的个体是同种异体的。

在一些实施方案中，其中所述AAC包含佐剂，用于调理的佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施方案中，所述佐剂是聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)。

在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含一种或多种抗原性HPV表位和一种或多种异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原与其他抗原或与佐剂复合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。

在一些实施方案中，所述方法包括多次施用包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC。在一些实施方案中，所述方法包括约3至约9次施用包含所述至少一种HPV抗原的AAC。在一些实施方案中，所述方法包括以约如下次数中的任何一个的次数施用包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次。在一些实施方案中，所述方法包括根据需要连续施用包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的两次连续施用之间的时间间隔在约1天与约30天之间。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原的AAC的两次连续施用之间的时间间隔是约21天。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的两次连续施用之间的时间间隔是约如下时间中的任何一个：1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或150天。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的最初两次连续施用之间的时间间隔是1天或2天。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的最初两次连续施用之间的时间间隔是1天或2天，其中所述方法包括多于两次施用包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC(例如但不限于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次施用)。在一些实施方案中，静脉内、瘤内、口服和/或皮下施用包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC。在一些实施方案中，静脉内施用包含所述至少一种HPV抗原的AAC。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸。在一些实施方案中，所述佐剂是聚I:C。

在一些实施方案中，所述个体对于以下物质的表达呈阳性：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16。

免疫检查点是免疫系统的调节剂，并且保持检查免疫应答。可以使用免疫检查点抑制剂来促进免疫应答的增强。在一些实施方案中，将包含含有所述至少一种HPV抗原的AAC的组合物与免疫检查点抑制剂的施用组合施用。在一些实施方案中，同时施用包含含有HPV抗原的AAC的组合物与所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，依序施用包含含有所述至少一种HPV抗原的AAC的组合物与所述免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，静脉内、瘤内、口服和/或皮下施用所述免疫检查点抑制剂和/或包含所述至少一种HPV抗原的AAC。在一些实施方案中，静脉内施用包含所述至少一种HPV抗原的AAC。在一些实施方案中，静脉内、瘤内、口服和/或皮下施用所述免疫检查点抑制剂。

在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂前施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂后施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂前约1小时至约1周施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。例如，在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂前在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。

在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂前约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂前在约7天至约10天之间、在约10天与约14天之间、在约14天与约18天之间、在约18天与约21天之间、在约21天与约24天之间、在约24天与约28天之间、在约28天与约30天之间、在约30天与约35天之间、在约35天与约40天之间、在约40天与约45天之间或在约45天与约50天之间施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。

在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂后施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂后约1小时至约1周施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。例如，在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂后在约1小时与约2小时之间、在约2小时与约3小时之间、在约3小时与约4小时之间、在约4小时与约6小时之间、在约6小时与约8小时之间、在约8小时与约10小时之间、在约10小时与约12小时之间、在约12小时与约14小时之间、在约14小时与约16小时之间、在约16小时与约18小时之间、在约18小时与约20小时之间、在约20小时与约24小时之间、在约24小时与约30小时之间、在约30小时与约36小时之间、在约36小时与约42小时之间、在约42小时与约48小时之间、在约48小时与约60小时之间、在约60小时与约3天之间、在约3天与约4天之间、在约4天与约5天之间、在约5天与约6天之间、在约6天与约7天之间施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。

在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。在一些实施方案中，在施用所述免疫检查点抑制剂后在约7天至约10天之间、在约10天与约14天之间、在约14天与约18天之间、在约18天与约21天之间、在约21天与约24天之间、在约24天与约28天之间、在约28天与约30天之间、在约30天与约35天之间、在约35天与约40天之间、在约40天与约45天之间或在约45天与约50天之间施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物。

在一些实施方案中，所述方法包括多次施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物和/或多次施用所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施方案中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施方案中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次或少于两百次施用包含含有所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。

示例性免疫检查点抑制剂靶向而不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向以下中的一种或多种：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：结合PD-1的抗体、结合PD-L1的抗体、结合CTLA-4的抗体、结合LAG3的抗体、或结合TIM-3的抗体、结合TIGIT的抗体、结合VISTA的抗体、结合TIM-1的抗体、结合B7-H4的抗体或结合BTLA的抗体。在另外的实施方案中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)。在另外的实施方案中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种化学化合物。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合和/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一种或多种的一种或多种肽。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。

在一些实施方案中，提供了包含HPV抗原和佐剂的多种AAC(例如RBC来源的囊泡)，其根据本文所述的任一种方法用于刺激个体中的免疫应答的方法中。

包含HPV抗原的AAC的组合物

在一些实施方案中，所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂。在一些实施方案中，所述AAC源自输入无核细胞。在一些实施方案中，所述AAC源自输入红细胞(RBC)。在一些实施方案中，所述AAC是包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。在一些实施方案中，所述AAC是包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的RBC来源的囊泡。

在一些方面，所述方法包括施用有效量的包含HPV抗原和佐剂的AAC，其中通过以下步骤制备包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原和所述佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些方面，提供一种包含HPV抗原、或HPV抗原和佐剂的AAC的组合物，其中通过以下步骤制备包含所述至少一种HPV抗原、或所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为以下中的任何一个：所述输入无核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm、约1μm至约4μm、约1.2μm至约3μm、约1.4μm至约2.6μm、约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约3.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约或小于以下值中的任何一个：0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm。在一些实施方案中，使包含所述输入无核细胞的细胞悬浮液通过多个缩窄部，其中所述多个缩窄部是串联和/或并联布置的。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在一些实施方案中，所述佐剂是聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)。

剂量和方案

在一些实施方案中，提供了治疗个体的HPV相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含AAC的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸至约1×10⁹个AAC，并且其中所述AAC包含细胞内递送的HPV抗原和佐剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂。

在根据本文所述的方法中任何一种的一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1.0×10⁹个AAC/kg。在一些实施方案中，AAC的有效量约为以下量中的任何一个：0.5×10⁶、1.0×10⁶、0.5×10⁷、1.0×10⁷、0.5×10⁸、1.0×10⁸、0.25×10⁹、0.5×10⁹、0.75×10⁹、1.0×10⁹、0.5×10¹⁰、1.0×10¹⁰、0.5×10¹¹和1.0×10¹¹个AAC/kg。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg、约2.5×10⁸个AAC/kg、约5×10⁸个AAC/kg或约7.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，AAC的有效量为以下量中的任何一个：约0.5×10⁶至约1.0×10⁶、约1.0×10⁶至约0.5×10⁷、约0.5×10⁷至约1.0×10⁷、约1.0×10⁷至约0.5×10⁸个AAC、约0.5×10⁸至约1.0×10⁸、约1.0×10⁸至约0.5×10⁹个AAC、约0.5×10⁹至约1.0×10⁹、约1.0×10⁹至约0.5×10¹⁰个AAC、约0.5×10¹⁰至约1.0×10¹⁰、约1.0×10¹⁰至约0.5×10¹⁰个AAC/kg。

在一些实施方案中，其中所述方法进一步包括施用有效量的免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂靶向CTLA-4。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为伊匹单抗。在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量为约0.1mg/kg至约30mg/kg。在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg中的任何一个。在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量约为以下量中的任何一个：0.1、0.2、0.5、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25或30mg/kg。在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量约为以下量中的任何一个：0.1至0.2、0.2至0.5、0.5至1.0、1.0至1.2、1.2至1.4、1.4至1.6、1.6至1.8、1.8至2.0、2.0至2.2、2.2至2.4、2.4至2.6、2.6至2.8、2.8至3、3至4、4至5、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至12、12至14、14至16、16至18、18至20、20至25、或25至30mg/kg。

在一些实施方案中，其中所述方法进一步包括施用有效量的免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为纳武单抗。在一些实施方案中，纳武单抗的有效量为约30mg至约1000mg。在一些实施方案中，纳武单抗的有效量为约300mg至约400mg中的任何一个。在一些实施方案中，纳武单抗的有效量为约360mg中的任何一个。在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量约为以下量中的任何一个：30、50、100、150、200、250、300、320、340、360、380、400、450、500、550、600、700、800、900或1000mg。在一些实施方案中，伊匹单抗的有效量约为以下量中的任何一个：30至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至320、320至340、340至360、360至380、380至400、400至450、500至550、550至600、600至700、700至800、800至900、900至1000mg。

在一些实施方案中，其中所述方法进一步包括施用有效量的免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为阿特利珠单抗。在一些实施方案中，阿特利珠单抗的有效量为约100mg至约2500mg。在一些实施方案中，阿特利珠单抗的有效量为约900mg至约1500mg中的任何一个。在一些实施方案中，阿特利珠单抗的有效量为约1200mg中的任何一个。在一些实施方案中，阿特利珠单抗的有效量约为以下量中的任何一个：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1150、1200、1250、1300、1400、1500、1600、1800、2000、2200或2500mg。在一些实施方案中，阿特利珠单抗的有效量约为以下量中的任何一个：100至200、200至300、300至400、400至500、500至600、600至700、700至800、800至900、900至1000、1000至1100、1100至1200、1200至1300、1300至1400、1400至1500、1500至1600、1600至1800、1800至2000、2000至2200、2200至2500mg。

在一些实施方案中，所述治疗方法包括向所述个体施用多个(如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个中的任一个)周期的如本文所述的AAC中的任何一种。例如，在一些实施方案中，提供了一种通过向个体施用包含抗原和/或佐剂的AAC 2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次来对所述个体进行针对抗原的疫苗接种的方法，所述包含抗原和/或佐剂的AAC是通过使输入无核细胞通过缩窄部以形成AAC，使得抗原和/或佐剂进入AAC而产生的。在一些实施方案中，AAC的任何两次连续施用之间的持续时间为至少约1天(如至少约2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年或更长时间中的任一个，包括在这些值之间的任何范围)。

在根据本文所述的方法中任何一种的一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周周期中的任何一个施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物以3周周期施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物以6周周期施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在治疗周期中的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天中的一天或多天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在治疗周期的第1天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在治疗周期的第2天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在治疗周期的第1天和第2天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在治疗周期的第1天和第3天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在治疗周期的第8天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物在三周周期的第1天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物进一步在三周周期的第2天施用。在一些实施方案中，将包含所述AAC的所述组合物以3周周期施用，直至所述AAC组合物供应耗尽，或持续一年。

在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用以下量中的任何一个：约0.5×10⁶、1.0×10⁶、0.5×10⁷、1.0×10⁷、0.5×10⁸、1.0×10⁸、0.25×10⁹、0.5×10⁹、0.75×10⁹、1.0×10⁹、0.5×10¹⁰、1.0×10¹⁰、0.5×10¹¹和1.0×10¹¹个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个AAC/kg、约2.5×10⁸个AAC/kg、约5.0×10⁸个AAC/kg或约7.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第2天施用以下量中的任何一个：约0.5×10⁶、1.0×10⁶、0.5×10⁷、1.0×10⁷、0.5×10⁸、1.0×10⁸、0.25×10⁹、0.5×10⁹、0.75×10⁹、1.0×10⁹、0.5×10¹⁰、1.0×10¹⁰、0.5×10¹¹和1.0×10¹¹个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个AAC/kg、约2.5×10⁸个AAC/kg、约5.0×10⁸个AAC/kg或约7.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用0.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用0.5×10⁸个AAC/kg，并且在每个三周周期的第2天施用0.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用0.5×10⁸个AAC/kg，并且在每个三周周期的第3天施用0.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用2.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用2.5×10⁸个AAC/kg，并且在每个三周周期的第2天施用2.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用2.5×10⁸个AAC/kg，并且在每个三周周期的第3天施用2.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用2.5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用5×10⁸个AAC/kg，并且在每个三周周期的第2天施用5×10⁸个AAC/kg。在一些实施方案中，在每个三周周期的第1天施用5×10⁸个AAC/kg，并且在每个三周周期的第3天施用5×10⁸个AAC/kg。

在一些实施方案中，其中所述方法进一步包括施用有效量的一种或多种免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂靶向CTLA-4、PD-1和/或PD-L1。在一些实施方案中，每个周期施用1、2、3、4、5、6次或更多次所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，每三周周期施用一次所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，每三周周期施用一次所述结合CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，每三周周期施用一次所述结合PD-1的抗体。在一些实施方案中，每三周周期施用一次所述结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，每两个三周周期施用一次所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。在一些实施方案中，每两个三周周期施用一次所述结合CTLA-4的抗体。在一些实施方案中，每两个三周周期施用一次所述结合PD-1的抗体。在一些实施方案中，每两个三周周期施用一次所述结合PD-L1的抗体。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂在治疗周期中的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天施用一次或多次。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合CTLA-4的抗体，其中将所述结合CTLA-4的抗体在每个三周周期的第1天施用。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体最多施用四次。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体的有效量为约3mg/kg。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗。在一些实施方案中，将所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗在每三周周期的第1天以约3mg/kg的剂量施用。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合PD-1的抗体，其中将所述结合PD-1的抗体在第一个三周周期的第8天和每个后续三周周期的第1天施用。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，将所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是纳武单抗，其中将所述纳武单抗在第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天以约360mg的剂量施用。

在一些实施方案中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂包含结合CTLA-4的抗体和结合PD-1的抗体，其中将所述结合CTLA-4的抗体在每个交替的三周周期的第1天(即每6周周期的第1天)施用，并且其中将所述结合PD-1的抗体在第一个三周周期的第8天和每个后续三周周期的第1天施用。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，并且所述结合PD-1的抗体是纳武单抗。在一些实施方案中，将所述伊匹单抗以约1mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，将所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。在一些实施方案中，所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗在每个交替的三周周期的第1天以约1mg/kg的剂量施用，并且所述结合PD-1的抗体是纳武单抗，其中将所述纳武单抗在第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天以约360mg的剂量施用。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是结合PD-L1的抗体，其中将所述结合PD-L1的抗体在第一个三周周期的第8天和每个后续三周周期的第1天施用。在一些实施方案中，所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗。在一些实施方案中，将所述阿特利珠单抗以约1200mg的剂量施用。在一些实施方案中，所述结合PD-1的抗体是阿特利珠单抗，其中将所述阿特利珠单抗在第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天以约360mg的剂量施用。

产生包含HPV抗原的AAC的组合物的方法

在一些实施方案中，提供了用于产生包含含有HPV抗原的AAC的组合物的方法，其中将所述至少一种HPV抗原细胞内递送至所述AAC。在一些实施方案中，提供了用于产生包含含有HPV抗原和佐剂的AAC的组合物的方法，其中将所述至少一种HPV抗原和所述佐剂细胞内递送至所述AAC。

在一些实施方案中，通过包括以下步骤的方法制备包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的所述AAC：a)使包含输入无核细胞群的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及b)将所述扰动的输入无核细胞群与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入无核细胞，从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC。

在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6的肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E7的肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6的肽。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红细胞(RBC)或血小板。在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红血球或网织红细胞。在一些实施方案中，所述AAC是无核细胞来源的囊泡。在一些实施方案中，所述AAC是RBC来源的囊泡或血小板来源的囊泡。在一些实施方案中，所述AAC是红血球来源的囊泡或网织红细胞来源的囊泡。

在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含一种或多种抗原性HPV表位和一种或多种异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，将所述至少一种HPV抗原与其他抗原或与佐剂一起递送。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一种或多种异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原与其自身、与其他抗原或与所述佐剂复合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原能够被加工成MHC II类限制性肽。

HPV抗原

在根据本文所述的方法的一些实施方案中，所述外源性抗原是人乳头瘤病毒(HPV)抗原。乳头瘤病毒是病毒粒子尺寸为直径约55nm的小型无包膜DNA病毒。已完全表征了超过100种HPV基因型，并且推测存在更高的数目。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知病因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且自发清除，但是一种致癌性HPV类型的持续性感染可能发展为癌前期或癌症。其他HPV相关疾病可以包括寻常疣、足底疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头瘤、疣状囊肿、喉乳头瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。许多已知的HPV类型会引起良性病变，其一个子组是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，HPV类型分为十五种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知它们共同表现为低级和高级宫颈变化和癌症以及其他肛门生殖器癌(诸如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌)以及头颈癌。最近，还描述了高风险型HPV 16和18与乳腺癌的相关性。已知被归类为“低风险型”的十一种HPV类型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)表现为良性低级宫颈变化、生殖器疣和复发性呼吸道乳头瘤病。皮肤HPV类型5、8和92与皮肤癌相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统受到抑制，并且相应地抗肿瘤应答显著受损。参见Suresh和Burtness,Am J Hematol Oncol 13(6):20-27(2017)。在一些实施方案中，所述外源性抗原是引发针对相同和或不同抗原的应答的多种多肽的集合。在一些实施方案中，所述多种抗原的集合中的抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含抗原性HPV表位和一种或多种异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原与其自身、与其他抗原或与所述佐剂复合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。在一些实施方案中，所述抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含与SEQ ID NO:18-25中任何一个具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含与SEQ ID NO:18具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含与SEQ ID NO:19具有至少90％相似性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由SEQ IDNO:21的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列中的至少一个的多种抗原。在一些实施方案中，所述外源性抗原是包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列中的2、3、4、5、6、7或8个的多种抗原。在一些实施方案中，所述外源性抗原是包含与SEQ ID NO:19具有至少90％相似性的氨基酸序列和与SEQ ID NO:23具有至少90％相似性的氨基酸序列的多种抗原。在一些实施方案中，所述外源性抗原是包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:23的氨基酸序列的多种抗原。在一些实施方案中，所述多种抗原包含在非共价连接的肽的集合内。在一些实施方案中，所述多种抗原包含在非共价连接的肽的集合内，其中每种肽包含不超过一种抗原。在一些实施方案中，所述多种抗原包含在非共价连接的肽的集合内，其中SEQ ID NO:19的氨基酸序列和SEQ ID NO:25的氨基酸序列包含在单独的肽内。

在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原在引发针对相同和或不同HPV抗原的应答的多种多肽的集合内。在一些实施方案中，所述多种抗原的集合中的抗原不降低针对所述多种抗原的集合中的其他抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含一种抗原性HPV抗原和一种或多种异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原与其自身、与其他抗原或与所述佐剂复合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由HLA-A11特异性表位构成。在一些实施方案中，HPV抗原由HLA-B7特异性表位构成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原由HLA-C8特异性表位构成。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原包含全长HPV蛋白的N末端结构域的一部分或全部。

在根据本文所述的方法中任何一种的一些实施方案中，所述AAC(例如RBC来源的囊泡)包含含有多个免疫原性表位的多种HPV抗原。在另外的实施方案中，在向个体施用包含含有所述多个免疫原性表位的所述多种抗原的AAC后，所述多个免疫原性表位都不降低所述个体中针对任何其他免疫原性表位的免疫应答。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施方案中，所述免疫原性肽表位与N末端侧翼多肽和/或C末端侧翼多肽融合。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列的多肽。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原是包含免疫原性肽表位的多肽，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施方案中，所述侧接异源肽序列源自疾病相关的免疫原性肽。在一些实施方案中，所述侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施方案中，所述侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施方案中，所述至少一种HPV抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。

佐剂

如本文所用，术语“佐剂”可以指直接或间接调节和/或引起免疫应答的物质。在本发明的一些实施方案中，将佐剂细胞内递送至无核细胞或AAC的群体，如RBC或RBC来源的囊泡的群体(即，在缩窄部加工之前、期间和/或之后，但在施用于个体前，将细胞或囊泡与佐剂一起孵育)以形成包含所述佐剂的AAC。在一些情况下，将所述佐剂与HPV抗原结合施用，以实现如与单独的HPV抗原相比，针对所述至少一种HPV抗原的免疫应答的增强。因此，佐剂可以用于加强对针对HPV抗原的免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的引发。示例性佐剂包括而不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂，视黄酸诱导型基因I(RIG-I)激动剂，以及针对TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。示例性佐剂包括而不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在具体实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpGODN或C类CpG ODN。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂包含来自以下的组的选择：CpGODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPGODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些实施方案中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:30))或CpG ODN 2006(也称为CpG ODN 7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:31))寡核苷酸。在一些实施方案中，所述佐剂是CpG 7909。在一些实施方案中，所述RIG-I激动剂包含聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)。还可以结合HPV抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原的AAC进一步包含多于一种佐剂。还可以结合HPV抗原使用多种佐剂以增强免疫应答的引发。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原的AAC进一步包含多于一种佐剂。在一些实施方案中，包含所述至少一种HPV抗原的AAC进一步包含以下佐剂的任何组合：CpGODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖基神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚I:C)、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。

包含HPV抗原和佐剂的AAC的进一步修饰

在根据本文所述的方法中任何一种的一些实施方案中，所述AAC的组合物进一步包含如下药剂，与不包含所述药剂的相应AAC的组合物相比，所述药剂增强所述AAC的功能。在一些实施方案中，所述AAC的组合物进一步包含如下药剂，与不包含所述药剂的相应AAC的组合物相比，所述药剂在冻-融循环后增强所述AAC的功能。在一些实施方案中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施方案中，在任何冻-融循环之前，与不包含所述药剂的相应AAC的组合物相比，所述冷冻保存剂和所述低温保存剂均不能防止包含所述药剂的AAC的组合物中超过10％或20％的细胞死亡。在一些实施方案中，与冻-融循环之前相应无核细胞来源的囊泡的组合物相比，包含所述冷冻保存剂和/或所述低温保存剂的无核细胞来源的囊泡组合物的冻-融循环引起不超过10％、20％、30％、40％或50％的功能丧失。在一些实施方案中，当与不含所述冷冻保存剂和所述低温保存剂的相应无核细胞来源的囊泡的组合物的冻-融循环相比，包含所述冷冻保存剂和/或所述低温保存剂的无核细胞来源的囊泡组合物的冻-融循环引起10％、20％、30％、40％或50％较少的功能丧失。在一些实施方案中，所述无核细胞来源的囊泡组合物的功能或功能性是通过对于膜联蛋白V染色呈阳性的无核细胞来源的囊泡的百分比测量的。在一些实施方案中，所述无核细胞来源的囊泡组合物的功能或功能性是通过对于CD235a染色呈阳性的无核细胞来源的囊泡的百分比测量的。在一些实施方案中，所述无核细胞来源的囊泡组合物的功能或功能性是通过对于CD235a和膜联蛋白V染色呈阳性的无核细胞来源的囊泡的百分比测量的。在一些实施方案中，在高达1、2、3、4、5个冻-融循环之后，至少约70％、约80％或约90％的AAC是功能性的。在一些实施方案中，所述药剂是增强内吞作用的化合物、稳定剂或辅助因子。在一些实施方案中，所述药剂是白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是小鼠、牛或人白蛋白中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些实施方案中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、葡糖酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施方案中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、/>DMSO、/>CS2、/>CS5、CS10、/>CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、/>

在根据本文所述的方法中任何一种的一些实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤：将所述AAC的组合物与如下药剂一起孵育，与在没有进一步的孵育步骤的情况下制备的相应AAC相比，所述药剂增强所述AAC的功能。

在一些实施方案中，配制品包含冷冻保存介质。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9mL至约10mL冷冻保存介质中的约1×10⁹至约1×10¹¹个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9mL至约10mL冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约0.5×10⁷、0.7×10⁷、1.0×10⁷、0.5×10⁸、0.7×10⁸、1.0×10⁸、0.5×10⁹、0.7×10⁹、1.0×10⁹、0.5×10¹⁰、0.7×10¹⁰、1.0×10¹⁰、0.5×10¹¹、0.7×10¹¹、1.0×10¹¹、0.5×10¹²、0.7×10¹²和1.0×10¹²个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9mL至约10mL冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约0.5×10⁷至约1.0×10⁷、约1.0×10⁷至约0.5×10⁸个AAC、约0.5×10⁸至约1.0×10⁸、约1.0×10⁸至约0.5×10⁹个AAC、约0.5×10⁹至约1.0×10⁹、约1.0×10⁹至约0.5×10¹⁰、约0.5×10¹⁰至约1.0×10¹⁰、约1.0×10¹⁰至约0.5×10¹¹、约0.5×10¹¹至约1.0×10¹¹个AAC、约1.0×10¹¹至约0.5×10¹²个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9mL至约10mL冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹和1×10¹⁰个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9.5mL冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹和1×10¹⁰个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9mL至约10mL冷冻保存介质中的约7×10⁹个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9.5mL冷冻保存介质中的约7×10⁹个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9.5mL冷冻保存介质中的约6.65×10⁹个AAC。在一些实施方案中，所述包含AAC的配制品包含在冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约0.5×10⁷、0.7×10⁷、1.0×10⁷、0.5×10⁸、0.7×10⁸、1.0×10⁸、0.5×10⁹、0.7×10⁹、1.0×10⁹、0.5×10¹⁰、0.7×10¹⁰、1.0×10¹⁰、0.5×10¹¹、0.7×10¹¹、1.0×10¹¹、0.5×10¹²、0.7×10¹²和1.0×10¹²个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约0.5×10⁷至约1.0×10⁷、约1.0×10⁷至约0.5×10⁸个AAC、约0.5×10⁸至约1.0×10⁸、约1.0×10⁸至约0.5×10⁹个AAC、约0.5×10⁹至约1.0×10⁹、约1.0×10⁹至约0.5×10¹⁰个AAC、约0.5×10¹⁰至约1.0×10¹⁰、约1.0×10¹⁰至约0.5×10¹¹、约0.5×10¹¹至约1.0×10¹¹个AAC、约1.0×10¹¹至约0.5×10¹²个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在冷冻保存介质中的以下量中的任何一个：约1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹和1×10¹⁰个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在冷冻保存介质中的约7×10⁹个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在冷冻保存介质中的约6.65×10⁹个AAC。在一些实施方案中，融化后，所述配制品包含在冷冻保存介质中的约0.7×10⁹个AAC/mL。在一些实施方案中，融化后，所述配制品包含在冷冻保存介质中的约0.7×10⁹个AAC/mL，如通过库尔特计数器所测量的。在一些实施方案中，所述冷冻保存介质包含CS2。在一些实施方案中，所述冷冻保存介质是/>CS2。

在一些实施方案中，所述包含AAC的组合物包含在约9mL至约10mLCS2中的约7×10⁹个AAC。在一些实施方案中，所述包含AAC的组合物包含在约9.5mL/>CS2中的约7×10⁹个AAC。在一些实施方案中，所述配制品包含在约9.5mL/>CS2中的约6.65×10⁹个AAC。

在一些实施方案中，所述配制品中的AAC保持等于或大于约50％功能性，多达1、2、3、4、5个冻-融循环。在一些实施方案中，所述配制品保持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％功能性，多达1、2、3、4、5个冻-融循环。在一些实施方案中，在等于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，所述配制品中的AAC保持等于或大于约70％功能性。在一些实施方案中，在等于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，所述配制品保持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％功能性。在一些实施方案中，在等于或低于-140℃的温度下储存至少6、9、12、15、18、24、30或36个月后，所述配制品保持等于或大于约70％功能性。在一些实施方案中，在等于或低于-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃或-200℃的温度下储存至少12个月后，所述配制品保持等于或大于约70％功能性。

在一些实施方案中，所述配制品中的AAC保持等于或大于约50％的对于膜联蛋白V和/或CD235a的阳性染色，多达1、2、3、4、5个冻-融循环。在一些实施方案中，所述配制品保持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的对于膜联蛋白V和/或CD235a的阳性染色，多达1、2、3、4、5个冻-融循环。在一些实施方案中，在等于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，所述配制品中的AAC保持等于或大于约70％的对于膜联蛋白V和/或CD235a的阳性染色。在一些实施方案中，在等于或低于-140℃的温度下储存至少12个月后，所述配制品保持等于或大于约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的对于膜联蛋白V和/或CD235a的阳性染色。在一些实施方案中，在等于或低于-140℃的温度下储存至少6、9、12、15、18、24、30或36个月后，所述配制品保持等于或大于约70％的对于膜联蛋白V和/或CD235a的阳性染色。在一些实施方案中，在等于或低于-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃或-200℃的温度下储存至少12个月后，所述配制品保持等于或大于约70％的对于膜联蛋白V和/或CD235a的阳性染色。

用于产生包含HPV抗原的AAC的组合物的缩窄部

在一些实施方案中，本发明提供了用于刺激免疫应答的包含HPV抗原的AAC的组合物。在一些实施方案中，所述无核细胞是RBC或血小板。在一些实施方案中，所述无核细胞是红血球或网织红细胞。在一些实施方案中，将所述至少一种HPV抗原细胞内递送至所述无核细胞。将有效载荷引入无核细胞的方法在本领域中是已知的。

在一些实施方案中，通过以下方式将所述至少一种HPV抗原引入所述无核细胞中：使所述细胞通过缩窄部使得将瞬时孔引入细胞膜，从而允许所述至少一种HPV抗原进入所述细胞。基于缩窄部递送化合物至细胞中的例子由WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO2016/070136、WO 2017041050、WO 2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO2019/178005、WO 2019/178006、WO 2020/072833、WO 2020/154696和WO 2020/176789、US20180142198和US20180201889提供。

在一些实施方案中，通过使包含无核细胞(例如，RBC)的细胞悬浮液通过收缩部，将所述至少一种HPV抗原和佐剂递送至所述无核细胞中以产生本发明的AAC，其中所述缩窄部使细胞变形，从而引起细胞的扰动，使得HPV抗原和佐剂进入所述细胞。在一些实施方案中，所述缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，可以在所述微流体通道内并联和/或串联放置多个缩窄部。

在一些实施方案中，所述微流体通道内的缩窄部包括入口部、中心点和出口部。在一些实施方案中，所述微流体通道内的缩窄部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施方案中，所述微流体通道内的缩窄部的宽度随无核细胞的直径而变化。确定无核细胞的直径的方法在本领域中是已知的；例如，高内涵成像、细胞计数器或流式细胞术。

在基于缩窄部递送HPV抗原至AAC的一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约0.5μm至约10μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约1μm至约4μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约1μm至约3μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约1.5μm至约2.5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约1.2μm至约2.8μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约0.5μm至约5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2μm至约2.5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约1.5μm至约2μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约0.5μm至约3.5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约3.2μm至约3.8μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约3.8μm至约4.3μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约或小于以下值中的任何一个：0.25μm、0.5μm、1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm、1.8μm、2.0μm、2.2μm、2.4μm、2.6μm、2.8μm、3.0μm、3.2μm、3.4μm、3.6μm、3.8μm、4.0μm、4.2μm、4.4μm、4.6μm、4.8μm、5.0μm、5.2μm、5.4μm、5.6μm、5.8μm、6.0μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.5μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约3μm。

可能影响将化合物递送至AAC中的参数的例子包括但不限于缩窄部的尺寸、缩窄部的入口角度、缩窄部的表面特性(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速度(例如，通过缩窄部的细胞传输时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中化合物的浓度、细胞悬浮液中的缓冲液，并且AAC在通过缩窄部之后恢复或孵育的时间量可以影响使递送的化合物穿过进入AAC中。影响化合物递送至AAC中的另外参数可以包括输入无核细胞在缩窄部中的速度、缩窄部中的剪切速度、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量以及在缩窄部中的时间。另外，串联和/或并联的包括通道的多个芯片可能影响向AAC的递送。并联的多个芯片可能可用于提高通量。可以设计此类参数以控制化合物的递送。在一些实施方案中，细胞浓度的范围是从约10至至少约10¹²个细胞/mL或在其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以是约10ng/mL至约1g/mL或在其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施方案中，递送化合物浓度的范围可以是约1pM至至少约2M或在其间的任何浓度或浓度范围。

在一些实施方案中，与所述无核细胞或无核细胞来源的囊泡一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与所述无核细胞或AAC一起孵育的HPV抗原的浓度是以下中的任一个：小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与所述无核细胞或AAC一起孵育的HPV抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与所述无核细胞或AAC一起孵育的HPV抗原的浓度是以下中的任一个：在约0.01μM与约0.1μM之间、在约0.1μM与约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM之间或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与所述无核细胞或AAC一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述无核细胞或AAC一起孵育的HPV抗原的浓度在约0.1μM与约10μM之间。在一些实施方案中，与所述无核细胞或AAC一起孵育的HPV抗原的浓度是1μM。

在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度在约0.01μM与约10mM之间。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度是以下中的任一个：小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度大于约10mM。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度是以下中的任一个：在约0.01μM与约0.1μM之间、在约0.1μM与约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM之间或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约1mM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度在约0.1μM与约10μM之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原的浓度是1μM。

在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比是在约10000:1至约1:10000之间的任一个。例如，在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比是约以下中的任一个：10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比是以下中的任一个：在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比是约200:1。在一些实施方案中，与所述扰动的输入无核细胞一起孵育的抗原与佐剂的摩尔比是约20:1。

在一些实施方案中，所述AAC包含浓度在约1nM与约1mM之间的所述佐剂。例如，在一些实施方案中，所述AAC包含浓度是以下中的任一个的所述佐剂：小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度大于约10mM中的任一个的所述佐剂。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度为以下中的任一个的所述佐剂：在约1nM至约10nM、约0.1μM与约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述佐剂。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度是约1μM的所述佐剂。

在一些实施方案中，所述AAC包含浓度在约1nM与约1mM之间的所述抗原。例如，在一些实施方案中，所述AAC包含浓度是以下中的任一个的所述抗原：小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度大于约10mM中任一个的所述抗原。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度是以下中的任一个的所述抗原：在约1nM至约10nM、约0.1μM和约1μM之间、在约1μM与约10μM之间、在约10μM与约100μM之间、在约100μM与约1mM或在1mM与约10mM之间。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度在约0.1μM与约1mM之间的所述抗原。在一些实施方案中，所述AAC包含浓度是约1μM的所述抗原。

在一些实施方案中，所述AAC中抗原与佐剂的摩尔比是在约10000:1至约1:10000之间的任一个。例如，在一些实施方案中，所述AAC中抗原与佐剂的摩尔比是约以下中的任一个：10000:1、约1000:1、约100:1、约10:1、约1:1、约1:10、约1:100、约1:1000或约1:10000。在一些实施方案中，所述AAC中抗原与佐剂的摩尔比是以下中的任一个：在约10000:1与约1000:1之间、在约1000:1与约100:1之间、在约100:1与约10:1之间、在约10:1与约1:1之间、在约1:1与约1:10之间、在约1:10与约1:100之间、在约1:100与约1:1000之间、在约1:1000与约1:10000之间。在一些实施方案中，所述AAC中抗原与佐剂的摩尔比是约200:1。在一些实施方案中，所述AAC中抗原与佐剂的摩尔比是约20:1。

AAC的特征和通过抗原呈递细胞内化

在根据本文所述的方法、用途或组合物中任何一种的实施方案中，所述方法包括：a)使包含输入无核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使HPV抗原和佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；b)将所述扰动的输入无核细胞与所述至少一种HPV抗原和佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述至少一种HPV抗原和佐剂进入所述扰动的输入无核细胞；从而产生包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC。在一些实施方案中，与输入无核细胞相比，包含有效载荷(如HPV抗原和佐剂)的AAC展示出不同的特征。在一些实施方案中，与包含通过其他递送方法(如溶血加载或电穿孔)引入的有效载荷的无核细胞相比，包含有效载荷(如HPV抗原和佐剂)的AAC展示出不同的特征。

在一些实施方案中，与施用于哺乳动物后所述输入无核细胞的半衰期相比，施用于所述哺乳动物后所述AAC的半衰期降低。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞的血红蛋白含量相比，所述AAC的血红蛋白含量降低。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞的ATP产生相比，所述AAC的ATP产生减少。在一些实施方案中，所述AAC展现出球形形态。在一些实施方案中，所述AAC是红血球，并且其中与所述输入无核细胞相比，所述AAC具有减小的双凹形状。在一些实施方案中，所述AAC是红细胞血影。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC在其表面上具有大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC的群体分布展现出更高的平均表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC的至少50％的群体分布展现出更高的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC展现出在组织或细胞中的优先摄取。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC展现出在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的优先摄取。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC经修饰以增强在组织或细胞中的摄取。在一些实施方案中，与未修饰的AAC相比，所述AAC经修饰以增强在吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中的摄取。在一些实施方案中，所述吞噬细胞和/或抗原呈递细胞包含树突细胞或巨噬细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，所述组织或细胞包括肝或脾中的一种或多种。在一些实施方案中，所述AAC在其表面上包含CD47。

在上述用于产生AAC的方法的一些实施方案中，所述缩窄部包含在微流体通道内。在一些实施方案中，所述微流体通道包含多个缩窄部。在一些实施方案中，所述多个缩窄部串联和/或并联布置。在一些实施方案中，所述缩窄部在多个微柱之间；在以阵列配置的多个微柱之间；或在一个或多个可移动板之间。在一些实施方案中，所述缩窄部是孔或包含在孔内。在一些实施方案中，所述孔包含在表面中。在一些实施方案中，所述表面是过滤器。在一些实施方案中，所述表面是膜。在一些实施方案中，所述缩窄部尺寸随悬浮液中输入无核细胞的直径而变。在一些实施方案中，所述缩窄部尺寸是悬浮液中输入无核细胞直径的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％或约70％。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约0.25μm至约4μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约4μm、3.5μm、约3μm、约2.5μm、约2μm、约1.5μm、约1μm、约0.5μm或约0.25μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的宽度为约2.2μm。在一些实施方案中，在范围为约10psi至约90psi的压力下使所述输入无核细胞通过所述缩窄部。在一些实施方案中，所述细胞悬浮液在通过所述缩窄部之前、同时或之后与所述抗原接触。

在一些实施方案中，其中包含有效载荷(例如HPV抗原、或HPV抗原和佐剂)的AAC由输入无核细胞制备，所述AAC具有以下特性中的一种或多种：(a)与所述输入无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低，(b)与所述输入无核细胞相比，血红蛋白水平降低，(c)球形形态，(d)与所述输入无核细胞相比，表面磷脂酰丝氨酸水平增加，或(e)与所述输入无核细胞相比，ATP产生减少。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述输入无核细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红细胞或血小板。在一些实施方案中，红细胞是红血球或网织红细胞。

在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC在哺乳动物中的循环半衰期降低。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，在哺乳动物中的循环半衰期降低超过约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞是人细胞，并且其中所述AAC的循环半衰期小于约1分钟、约2分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约10天、约25天、约50天、约75天、约100天、约120天。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红细胞，其中与所述输入无核细胞相比，所述AAC中的血红蛋白水平降低。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC中的血红蛋白水平降低至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％或约100％。在一些实施方案中，所述AAC中的血红蛋白水平是所述输入无核细胞中血红蛋白水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红血球，并且其中所述AAC在形态上是球形的。在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红血球，并且其中与所述输入无核细胞相比，所述AAC具有减小的双凹形状。

在一些实施方案中，所述输入无核细胞是红细胞或红血球，并且其中所述AAC是红细胞血影(RBC血影)。

在一些实施方案中，所述AAC在其表面上包含CD47。

在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC具有增加的表面磷脂酰丝氨酸水平。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，通过所述方法制备的AAC在其表面上具有大于约1.5倍的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC在其表面上具有多出约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约99％、约100％或大于约100％的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，通过测量AAC表面上膜联蛋白染色(例如，膜联蛋白V染色)的水平来确定AAC表面上磷脂酰丝氨酸的水平。

在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC具有减少的ATP产生。在一些实施方案中，所述AAC产生的ATP低于由所述输入无核细胞产生的ATP水平的约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％或约50％。在一些实施方案中，所述AAC不产生ATP。

在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC展现出在组织或细胞中的增强的摄取。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞的摄取相比，所述AAC展现出在肝或脾中的优先摄取或被吞噬细胞或抗原呈递细胞的优先摄取。

在一些实施方案中，与所述输入无核细胞相比，所述AAC经进一步修饰以增强在组织或细胞中的摄取。在一些实施方案中，与所述输入无核细胞的摄取相比，所述AAC经进一步修饰以增强在肝或脾中的摄取或被吞噬细胞或抗原呈递细胞的摄取。

在一些实施方案中，其中所述AAC展现出在肝或脾中的增强的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，所述AAC的内化导致所述吞噬细胞或所述抗原呈递细胞的成熟标记物的表达增加。在一些实施方案中，所述吞噬细胞和/或所述抗原呈递细胞是单核细胞来源的树突细胞(MODC)。在一些实施方案中，所述成熟标记物是CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种。在一些实施方案中，与未与包含HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包含HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施方案中，与和所述输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包含HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。

在一些实施方案中，其中包含HPV抗原、或HPV抗原和佐剂的AAC展现出在肝或脾中的增强的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，所述AAC的内化导致包含在所述AAC内的所述至少一种HPV抗原的呈递增加。在一些实施方案中，与和包含通过其他递送方法(例如但不限于溶血加载)引入的HPV抗原的相应无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包含相同HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中所述至少一种HPV抗原的呈递增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。

在一些实施方案中，其中包含HPV抗原、或HPV抗原和佐剂的AAC展现出在肝或脾中的增强的摄取或被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞的增强的摄取，所述AAC的内化导致所述吞噬细胞和/或所述抗原呈递细胞诱导抗原特异性免疫应答的能力增加。在一些实施方案中，与和所述输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，由与包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC接触的所述吞噬细胞和/或所述抗原呈递细胞介导的抗原特异性免疫应答增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施方案中，与和包含通过其他递送方法(例如但不限于溶血加载)引入的所述至少一种HPV抗原的无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，由与包含相同HPV抗原和佐剂的AAC接触的所述吞噬细胞和/或所述抗原呈递细胞介导的抗原特异性免疫应答增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施方案中，所述抗原特异性免疫应答是抗原特异性CD4+ T细胞应答。在一些实施方案中，所述抗原特异性免疫应答是抗原特异性CD8+ T细胞应答。

在一些实施方案中，所述个体对于以下物质呈阳性：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08和/或HLA-C*16。

在根据本文所述的方法、组合物或用途中任何一种的一些实施方案中，所述吞噬细胞是具有以下单倍型的人细胞：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08和/或HLA-C*16。在一些实施方案中，所述抗原呈递细胞是具有以下单倍型的人细胞：HLA-A*02、HLA-A*11、HLA-B*07或HLA-C*08。在一些实施方案中，由本文所述的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原由HLA-A2特异性表位构成。在一些实施方案中，由本文所述的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原由HLA-A11特异性表位构成。在一些实施方案中，由本文所述的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原由HLA-B7特异性表位构成。在一些实施方案中，由本文所述的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞呈递的HPV抗原由HLA-C8特异性表位构成。

在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的AAC，其中所述AAC被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞内化。在一些实施方案中，其中所述AAC被吞噬细胞和/或抗原呈递细胞内化，所述AAC的内化导致所述吞噬细胞或所述抗原呈递细胞的成熟标记物的表达增加。在一些实施方案中，所述吞噬细胞和/或所述抗原呈递细胞是单核细胞来源的树突细胞(MODC)。在一些实施方案中，所述成熟标记物是CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种。在一些实施方案中，与未与包含HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包含HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。在一些实施方案中，与和所述输入无核细胞接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞相比，在与包含HPV抗原的AAC接触的吞噬细胞和/或抗原呈递细胞中CD80、CD86、CD83和MHC-II中的一种或多种的表达增加至少约以下中的任何一个：10％、20％、50％、80％、100％、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍、10000倍或更多。

在一些实施方案中，在制备所述AAC期间，所述输入无核细胞未(a)进行热加工、(b)进行化学处理、和/或(c)经受低渗或高渗条件。在一些实施方案中，在由所述输入无核细胞制备所述AAC期间保持摩尔渗透压浓度。在一些实施方案中，所述摩尔渗透压浓度保持在约200mOsm与约600mOsm之间。在一些实施方案中，所述摩尔渗透压浓度保持在约200mOsm与约400mOsm之间。

系统和试剂盒

在一些方面，本发明提供了一种用于本文公开的方法的系统，其包括缩窄部、无核细胞悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种。所述系统可以包括针对以上公开的方法所述的任何实施方案，所述实施方案包括用于提供细胞变形缩窄部的微流体通道或具有孔的表面、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在一些实施方案中，所述细胞变形缩窄部的大小适于递送至无核细胞。在一些实施方案中，优化递送参数，如操作流速度、细胞和化合物浓度、细胞在缩窄部中的速度以及细胞悬浮液的组成(例如，摩尔渗透压浓度、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)，以使化合物阻抑免疫应答或诱导耐受性的反应最大化。

还提供了用于治疗患有HPV相关癌症的个体的试剂盒或制品。在一些实施方案中，所述试剂盒包含AAC，所述AAC在细胞内包含突变的抗原并且在细胞内包含佐剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含所述缩窄部、无核细胞悬浮液、HPV抗原或佐剂中的一种或多种，其用于产生AAC以用于治疗患有HPV相关疾病(如癌症)的个体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含在合适包装中的本文所述的组合物(例如，微流体通道或含有孔的表面、细胞悬浮液和/或化合物)。合适的包装材料在本领域中是已知的，并且包括例如小瓶(如密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。可以进一步将这些制品灭菌和/或密封。

本发明还提供了包含本文所述的方法的组分的试剂盒，并且可以进一步包含用于执行所述方法以治疗患有与HPV相关的癌症的个体的说明书和/或用于将HPV抗原和佐剂引入无核细胞中的说明书。本文所述的试剂盒可以进一步包含其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和包装插页，所述包装插页具有用于执行本文所述的任何方法的说明书；例如，用于治疗患有与HPV相关的癌症的个体的说明书或用于产生AAC以在细胞内含有HPV抗原并且在细胞内含有佐剂的说明书。

示例性实施方案

实施方案1.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含激活抗原载体(AAC)的组合物，其中所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg，并且其中所述AAC包含细胞内递送的至少一种HPV抗原和佐剂。

实施方案2.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括：

向所述个体施用有效量的包含激活抗原载体(AAC)的组合物，其中所述AAC包含细胞内递送的至少一种HPV抗原和佐剂，以及

向所述个体施用有效量的CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。

实施方案3.根据实施方案2所述的方法，其中所述CTLA4的拮抗剂是结合CTLA4的抗体。

实施方案4.根据实施方案2或3所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1的拮抗剂是结合PD-1的抗体或结合PD-L1的抗体。

实施方案5.根据实施方案3或4所述的方法，其中将结合CTLA-4的抗体和结合PD-1的抗体施用于所述个体。

实施方案6.根据实施方案3-5中任一项所述的方法，其中所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗。

实施方案7.根据实施方案4-6中任一项所述的方法，其中所述结合PD-1的抗体是纳武单抗。

实施方案8.根据实施方案4-6中任一项所述的方法，其中所述结合PD-1的抗体是派姆单抗。

实施方案9.根据实施方案4-6中任一项所述的方法，其中将结合CTLA-4的抗体施用于所述个体，并且将结合PD-L1的抗体施用于所述个体。

实施方案10.根据实施方案4和9中任一项所述的方法，其中所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗。

实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。

实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6和/或E7的肽。

实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6和/或E7的HLA-A2限制性肽。

实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ IDNO:1-4中任何一个的氨基酸序列。

实施方案15.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。

实施方案16.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述AAC包含含有SEQID NO:19的氨基酸序列的抗原和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。

实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。

实施方案18.根据实施方案17所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。

实施方案19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

实施方案20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述个体对HLA-A*02呈阳性。

实施方案21.根据实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述AAC对所述个体是自体的或同种异体的。

实施方案22.根据实施方案1-21中任一项所述的方法，其中所述HPV相关癌症是当前、局部晚期或转移性癌症。

实施方案23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌、宫颈癌、肛门癌或食道癌。

实施方案24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中静脉内施用包含AAC的所述组合物。

实施方案25.根据实施方案2-24中任一项所述的方法，其中静脉内、口服或皮下施用所述CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。

实施方案26.根据实施方案3-25中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。

实施方案27.根据实施方案1-26中任一项所述的方法，其中包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约7.5×10⁸个AAC/kg。

实施方案28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg。

实施方案29.根据实施方案1-28中任一项所述的方法，其中包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg、约2.5×10⁸个AAC/kg、约5×10⁸个AAC/kg或约7.5×10⁸个AAC/kg。

实施方案30.根据实施方案6-29中任一项所述的方法，其中伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。

实施方案31.根据实施方案7和11-30中任一项所述的方法，其中纳武单抗的有效量为约360mg。

实施方案32.根据实施方案10-30中任一项所述的方法，其中阿特利珠单抗的有效量为约1200mg。

实施方案33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中在三周周期的第1天递送包含所述AAC的所述组合物。

实施方案34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中进一步在第一个三周周期的第2天施用包含所述AAC的所述组合物。

实施方案35.根据实施方案33或34所述的方法，其中在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个细胞/kg至约1×10⁹个细胞/kg。

实施方案36.根据实施方案33-35中任一项所述的方法，其中在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个细胞/kg、约2.5×10⁸个细胞/kg、约5.0×10⁸个细胞/kg或约7.5×10⁸个细胞/kg。

实施方案37.根据实施方案33-36中任一项所述的方法，其中在每个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个细胞/kg至约1×10⁹个细胞/kg。

实施方案38.根据实施方案33-37中任一项所述的方法，其中在所述第一个三周周期的第2天施用约0.5×108个细胞/kg、约2.5×10⁸个细胞/kg、约5.0×10⁸个细胞/kg或约7.5×10⁸个细胞/kg。

实施方案39.根据实施方案33-38中任一项所述的方法，其中每三周周期施用一次结合CTLA-4的抗体和/或结合PD-1的抗体和/或结合PD-L1的抗体。

实施方案40.根据实施方案33-39中任一项所述的方法，其中每两个三周周期施用一次结合CTLA-4的抗体。

实施方案41.根据实施方案33-40中任一项所述的方法，其中在每个三周周期的第1天施用结合CTLA-4的抗体。

实施方案42.根据实施方案39-41中任一项所述的方法，其中所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。

实施方案43.根据实施方案39-42中任一项所述的方法，其中在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用所述结合PD-1的抗体。

实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述结合PD-1的抗体是纳武单抗，其中将所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。

实施方案45.根据实施方案39-44中任一项所述的方法，其中所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗在两个三周周期的第一个三周周期的第1天以约1mg/kg的剂量施用，并且将所述结合PD-1的抗体在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天以约360mg的剂量施用。

实施方案46.根据实施方案33-39中任一项所述的方法，其中在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用结合PD-L1的抗体。

实施方案47.根据实施方案46所述的方法，其中所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗，其中将所述阿特利珠单抗以约1200mg的剂量施用。

实施方案48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中将包含PBMC的组合物施用于所述个体持续至少约三个月、六个月、九个月或一年。

实施方案49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述包含AAC的组合物包含在冷冻保存介质中的约1×10⁹个AAC至约1×10¹⁰个AAC。

实施方案50.根据实施方案1-49中任一项所述的方法，其中所述包含AAC的组合物包含在约10mL冷冻保存介质中的约7×10⁹个PBMC。

实施方案51.根据实施方案49或50所述的方法，其中所述冷冻保存介质是CS2。

实施方案52.根据实施方案1-51中任一项所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法制备包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的所述AAC：

a)使包含输入无核细胞群的细胞悬浮液通过细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述悬浮液中的所述输入无核细胞的直径而变化，从而引起所述输入无核细胞足够大的扰动以使所述至少一种HPV抗原和所述佐剂通过以形成扰动的输入无核细胞；以及

b)将所述扰动的输入无核细胞群与所述至少一种HPV抗原和所述佐剂一起孵育足够的时间，以允许所述抗原进入所述扰动的输入无核细胞，从而产生包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的所述AAC。

实施方案53.根据实施方案52所述的方法，其中所述缩窄部的直径为约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。

实施方案54.根据实施方案52或53所述的方法，其中所述输入无核细胞是红细胞。

实施方案55.根据实施方案52-54中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含源自HPV E6的肽和源自HPV E7的肽。

实施方案56.根据实施方案52-55中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。

实施方案57.根据实施方案52-55中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含SEQ ID NO:18-25中任何一个的氨基酸序列。

实施方案58.根据实施方案52-55中任一项所述的方法，其中所述AAC包含含有SEQID NO:19的氨基酸序列的抗原和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。

实施方案59.根据实施方案52-58中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。

实施方案60.根据实施方案59所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。

实施例

本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内可以有若干种实施方案。现在将通过参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。以下实施例进一步说明了本发明，但是当然不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1.SQZ-AAC-HPV的安全性和耐受性的I期研究

进行了SQZ-AAC-HPV作为单一疗法以及与(1)伊匹单抗、(2)纳武单抗和(3)纳武单抗加伊匹单抗组合在患有复发性、局部晚期或转移性HPV16+实体瘤的HLA A*02+患者中的安全性和耐受性、抗肿瘤活性以及免疫原性和药效学效应的1期开放标签、多中心研究。

SQZ-AAC-HPV是激活抗原载体(AAC)的红细胞(RBC)来源的产物，其用作HLA-A血清型组阳性(HLA-A*02+)患者内的呈人白细胞抗原(HLA)血清型的人乳头瘤病毒(HPV)毒株16阳性(HPV16+)癌症的治疗。SQZ-AAC-HPV由自体RBC组成，所述自体RBC是使用在制造期间经细胞溶胶递送的HPV16的HLA-A*02限制性E6和E7表位和佐剂聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)加工得到的。

E6SLP：QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL(SEQ ID NO:19)

E7SLP：QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL(SEQ ID NO:23)

所述过程在临床现场以特定患者开始，在临床现场收集全血，然后将其运送到制造现场。在制造现场，去除血小板和白细胞，并且使用细胞挤压技术将E6和E7表位与聚I:C佐剂一起递送至细胞中。由于细胞挤压技术，AAC表面上的磷脂酰丝氨酸相对于起始RBC增加。所得细胞是AAC-HPV药物物质。将所述AAC-HPV药物物质用冷冻保存介质洗涤，随后配制成SQZ-AAC-HPV自体药品，并冷冻保存。SQZ-PBMC-HPV药物物质由自体PBMC组成，所述自体PBMC具有含有在制造过程期间经细胞溶胶递送的HPV16的HLA-A*02限制性E6和E7表位的合成长肽(SLP)。

概述

研究群体由患有晚期HPV16+实体瘤(头颈癌、宫颈癌和其他肿瘤类型)的HLA-A*02+患者组成。HLA A*02+状态和HPV16+肿瘤状态是经由实验室报告确认的，并且在对患者血液采集以用于制造自体血液产品前，必须符合所有合格标准。如果赞助者认为实验室鉴定的文件不充分，则具有局部确认的HPV16+状态的患者可以通过筛选时采集的新鲜肿瘤活检物进行中心确认。

合格的患者将在研究现场经历单次血液采集以制造自体药品。为此目的抽取至少200mL全血。将此血液采集物送至合同制造商以制造每位患者的个性化自体细胞疗法。然后将SQZ AAC HPV的冷冻小瓶送至研究现场以用于施用。

此研究分2部分进行，其中第1部分由剂量递增组成，以确定SQZ-AAC-HPV单一疗法的安全性、初步功效和RP2D。研究的第2部分将评价SQZ-AAC-HPV在与免疫检查点抑制剂组合时(组合安全时期)的安全性和初步功效。

在所有群组中，将SQZ AAC-HPV以3周间隔施用持续最多1年或直至SQZ AAC-HPV供应耗尽或符合治疗中断标准，以先出现者为准。

在每次施用SQZ AAC HPV之后观察第1部分和第2部分中的所有患者至少4小时。另外，在首次施用SQZ AAC-HPV之后，对每个群组中的前2名患者进行最少23小时的观察。

在整个研究中，根据RECIST 1.1和iRECIST执行肿瘤评估，直至疾病进展、不可接受的毒性、同意退出、死亡或从首次施用SQZ AAC HPV之日起持续2年，以先出现者为准。如果治疗研究者认为符合患者的最佳利益，则可以继续向经历根据RECIST 1.1的疾病进展的患者给药，以允许确认疾病进展；即，根据iRECIST(Seymour等人,2017)的iCPD。

在末次给药研究性产品之后，进行跟踪访视以监测安全性和耐受性并评价总存活期。

第1部分：递增时期(SQZ-AAC-HPV单一疗法)

递增时期的计划剂量群组示于表1中。虽然传统的3+3设计旨在评估安全性和耐受性，但为了进一步研究安全性和耐受性、免疫原性效应和抗肿瘤活性，谨慎的做法可以是在一个群组中治疗总共多达12名另外的患者。在这种修改的3+3设计中，每个群组将有最多12名患者。

表1在递增时期期间计划的单一疗法群组的汇总

a.每3周持续进行SQZ-AAC-HPV给药，直到符合治疗中断标准、SQZ-AAC-HPV供应耗尽或持续最长1年，以先出现者为准。

b.在第1周期中，患者将在第1天和第2天接受SQZ-AAC-HPV。

c.如果没有观察到安全性信号，则高剂量水平将是5×10⁸个AAC/kg。如果在DLT期期间在3名患者中的1名中或6名患者中的2名中观察到≥2级相关的非PD相关毒性，则高剂量水平将是2.5×10⁸个AAC/kg。

d.如果选择2.5×10⁸个AAC/kg的高剂量，则一旦完成了2.5×10⁸个AAC/kg的DLT评估，就可以开放用5×10⁸个AAC/kg的第三群组。

测试至少2种单一疗法剂量水平。低剂量的SQZ-AAC-HPV将是0.5×10⁸个AAC/kg。为了确保群组2中的患者暴露于可能的最大免疫原性细胞剂量，SQZ-AAC-HPV的高剂量水平是基于群组1中的安全性结果。如果没有观察到安全性信号(即，没有≥2级治疗相关毒性)，则高剂量水平为5×10⁸个AAC/kg。如果在DLT期期间在3名患者中的1名中或6名患者中的2名中观察到≥2级相关的非PD相关毒性(或DLT)，则高剂量水平是2.5×10⁸个AAC/kg。如果选择2.5×10⁸个AAC/kg的高剂量，则一旦完成了2.5×10⁸个AAC/kg的DLT评估，就可以开放用5×10⁸个AAC/kg的第三群组。在评审了从给定群组中的患者可获得的安全性、功效和药效学数据后，SSC决定是否批准探索另外的更高或更低的单或双抗原负荷剂量水平。在这种情况下，剂量递增或递减的幅度将由SSC基于观察到的TEAE的类型和严重程度来确定。

患者在第1周期的第1天和第2天以及每个后续21天周期的第1天接受SQZ-AAC-HPV。在第1部分中，DLT观察期是28天(图1)。

在研究现场以交错方式募入患者，意味着群组中有不超过1名患者将在1周内接受首次SQZ AAC-HPV施用。在后续群组中SQZ AAC-HPV的施用将直到SSC已经评审了可获得的安全性数据并决定批准进行剂量递增时才开始。

剂量递增和RP2D确定

虽然传统的3+3设计旨在评估安全性和耐受性，但为了进一步研究安全性和耐受性、免疫原性效应和抗肿瘤活性，谨慎的做法可以是在一个群组中治疗多达6名另外患者。在这种修改的3+3设计中，每个群组有最多12名患者。

在给定剂量水平下的前3名患者完成DLT观察期之后，考虑剂量递增或将群组大小增加至6至12名患者，并且在SSC进行安全性数据评审后，发现安全性是可评价的。第1部分的DLT观察期定义为28天。

如果在整个DLT观察期在给定剂量水平下的前3名募入患者中的任一名中均未观察到DLT，则可以开放募入下一个更高剂量水平群组。如果所述前3名患者中的1名经历DLT，则募入另外3名患者(在相同剂量水平下总共6名可评价的患者)。如果所述前3名患者中≥1名或6名患者中≥2名经历DLT，则不再考虑剂量递增，并且这将是最大施用剂量(MAD)。RP2D可以是先前评价的更低剂量水平；或者可以选择替代性中间剂量水平用于进一步评价。RP2D确定是由SSC基于来自至少6名患者的安全性数据进行的。在研究的第2部分(组合安全时期)中进一步评价RP2D。可替代地，可以基于药效学评估宣布RP2D，其中确定已达到最大生物效应，并且患者将不受益于进一步的剂量递增。

如果由于除了安全性以外的任何原因，患者不能完成DLT观察期，或者如果药效学评估不足以定义研究治疗的生物效应，则认为患者是不可评价的。在研究者与赞助者之间进行协商之后，可以替换第1部分中被认为是不可评价的患者。

在任何施用剂量之后出现的不良事件在后续施用时消退至≤2级。类似地，在任何施用剂量之后出现的特别关注的不良事件(AESI)在后续施用时消退至<2级。如果在第1周期中首次施用后，符合这些再治疗标准，则在≥23小时观察期期间(即，第一剂量后的16小时与24小时之间)进行第二次SQZ AAC-HPV施用。在第二抗原负荷施用之后观察患者最少4小时。在2次施用之间的最小间隔是16小时。

在单一疗法群组中第一剂量的SQZ AAC HPV之后针对DLT的发生监测患者28天。遵循修改的3+3规则，确认群组关于DLT安全所需的患者的最小数目是在3名患者中0个DLT，在6个患者中≤1个DLT，在9名患者中≤2个DLT或在12名患者中≤3个DLT。

为了确定单一疗法RP2D方案，所有群组中的DLT评估都必须是完整的。RP2D方案基于对所有可获得的安全性、耐受性、免疫原性和其他药效学和抗肿瘤数据的评审来选择。SSC评审数据并向负责RP2D批准的DSMB做出推荐。

一旦限定了RP2D方案，则可以启动第2部分(组合安全时期)。

第2部分：组合安全时期(SQZ-AAC-HPV+一种或多种检查点抑制剂)

在组合安全性探索期间评价的SQZ-AAC-HPV剂量是基于对所有可获得的安全性、耐受性、免疫原性和其他药效学和抗肿瘤数据的评审来选择的。DSMB决定是选择SQZ-AAC-HPV单一疗法RP2D用于组合安全时期，还是以更低剂量开始。

由SQZ AAC HPV RP2D和组合配偶体限定群组。在群组2a、2b和2c中以RP2D施用SQZAAC-HPV。

群组2a：SQZ-AAC-HPV(RP2D)加伊匹单抗(如果耐受性允许，则每3周3mg/kg，最多4剂)

群组2b：SQZ-AAC-HPV(RP2D)加纳武单抗(每3周360mg)

群组2c(取决于群组2a和2b中各自治疗的6名患者的安全性评估)：SQZ-AAC-HPV(RP2D)加纳武单抗(每3周360mg)和伊匹单抗(每6周1mg/kg)

第2部分中的募入从群组2a和2b开始。一旦群组2a和2b中各自募入了6名患者，并且成功完成了42天DLT评价期；即＜33％的患者经历DLT，则群组2c开放募入。基于来自两个群组的可获得的安全性数据，SSC判定是对于群组2c选择对于群组2a和2b所选择的SQZ-AAC-HPV剂量方案，还是以更低剂量方案开始。如果SSC推荐以更低剂量的SQZ-AAC-HPV开始群组2c，则最初募入6名患者，并且观察至少4名患者42天。如果SSC认为组合是安全的，其中<33％的患者经历DLT，则可以将SQZ-AAC-HPV的剂量递增至完全单一疗法RP2D，并且如果获得批准，则可以继续募入直至募入了多达12名患者。

第2部分组合安全性群组中的患者在第1周期的第1天和第2天以及每个后续21天周期的第1天接受SQZ-AAC-HPV。在每个群组中，在前2名患者完成第1周期第8天之后，可以在该群组中治疗所述群组中的另外的患者。

评价所有患者的安全性和耐受性以及抗肿瘤反应的初步证据。

群组2a-SQZ-AAC-HPV加伊匹单抗

在第1周期中，根据第1部分中确定的RP2D静脉内施用SQZ-AAC-HPV；即在第1天和第2天以双抗原负荷，或在第1天以单抗原负荷剂量。在第1天施用SQZ AAC HPV之前，以3mg/kg在90分钟内静脉内施用伊匹单抗。在第2周期、第3周期和第4周期中，在第1天在施用SQZ-AAC-HPV后施用伊匹单抗。施用伊匹单抗，持续最多4个周期。以3周周期给予SQZ-AAC-HPV，直到符合中断标准、SQZ-AAC-HPV供应已耗尽或持续长达1年，以先出现者为准(图2)。

群组2b-SQZ-AAC-HPV加纳武单抗

在第1周期中，根据第1部分中确定的RP2D静脉内施用SQZ-AAC-HPV；即在第1天和第2天以双抗原负荷，或在第1天以单抗原负荷剂量。在第1周期第8天，在SQZ-AAC-HPV输注完成后立即以360mg的剂量在30分钟内静脉内施用纳武单抗。在后续周期中，在每3周的第1天施用SQZ AAC-HPV，随后施用纳武单抗。可以每3周给予纳武单抗，持续长达2年或直到符合中断标准。以3周周期施用SQZ-AAC-HPV，直到符合中断标准、SQZ-AAC-HPV供应已耗尽或持续最长1年，以先出现者为准(图3)。

群组2c-SQZ-AAC-HPV加纳武单抗加伊匹单抗

在第1周期中，基于群组2a和2b中的结果，根据RP2D静脉内施用SQZ-AAC-HPV。值得注意的是，SSC可以确定建议以低于对于群组2a和2b所选择的剂量的剂量或改进的剂量方案(例如仅在第1天以单一抗原负荷剂量)进行。在SQZ-AAC-HPV前，在第1天以1mg/kg的剂量在30分钟内静脉内施用伊匹单抗。在第1周期第8天，在30分钟内静脉内施用360mg纳武单抗。在施用SQZ-AAC-HPV后，在后续3周周期中的第1天给予纳武单抗。在后续周期中施用SQZ-AAC-HPV和纳武单抗后，每6周施用伊匹单抗(图4)。可以从第1周期第1天给予纳武单抗和伊匹单抗持续2年，直到符合治疗中断的标准之一。以3周周期施用SQZ-AAC-HPV，直到符合中断标准、SQZ-AAC-HPV供应已耗尽或持续最长1年，以先出现者为准。

如果由于免疫介导的AE导致患者符合检查点抑制剂的中断标准(根据附录E)，并且研究者不能确定事件是与纳武单抗相关，还是与伊匹单抗相关，则患者中断两种药物，并且可以继续SQZ-AAC-HPV。

对于第2部分中的所有群组，在≥23小时观察期间进行在第1周期第2天的第二次SQZ-AAC-HPV施用。在任何施用剂量之后出现的不良事件在后续施用时被消退至≤2级。类似地，在任何施用剂量之后出现的AESI在后续施用时消退至<2级。如果符合这些再治疗标准，则在≥23小时观察期期间(即，第一剂量后的16小时与24小时之间)进行第二次SQZAAC-HPV施用。在第二抗原负荷施用之后观察患者最少4小时。在2次施用之间的最小间隔是16小时。在每个群组中，在前2名患者完成第1周期第14天之后，治疗所述群组中的另外的患者。

在组合疗法群组中首次给药SQZ AAC HPV之后针对DLT的发生监测患者42天。

在单独患者中出现DLT或其他显著毒性的情况下，将发生剂量递减至更低的SQZAAC-HPV剂量。在对来自单独组合安全性群组中的患者的可获得的安全性、功效和药效学数据进行评审后，SSC可以确定对于1个或多个剂量组合，不建议双抗原负荷。在这种情况下，SSC可以推荐降低第二(第1周期第2天)SQZ-AAC-HPV剂量。可替代地，SSC可以确定可以研究SQZ-AAC-HPV的更低剂量水平(剂量递减)。例如，如果在单独组合安全性群组中≥33％的患者中观察到DLT，则开放并探索评价更低SQZ-AAC-HPV水平的群组。更高剂量群组表示为2c、2d等，并且更低剂量群组表示为2a-1、2b-1等。

给药时间安排和研究持续时间

在开始治疗前，对所有患者进行用于制造自体血液产品的单次血液采集。在研究现场对患者进行这种血液采集；这典型地在(第1周期第1天)初始施用SQZ AAC HPV前大约1至2周发生。SQZ AAC HPV的首次施用的时间安排考虑了现场位置和运输物流。

一个周期定义为21天的治疗期。

患者以3周间隔接受SQZ AAC HPV，持续长达1年，直到研究性产品耗尽或直到符合治疗中断标准，以先出现者为准。

积累的临床证据表明，用免疫系统刺激剂治疗的一些受试者在展现临床客观反应和/或疾病稳定之前可能显示疾病进展的体征(通过常规反应标准)。已经提出了两种假设来解释这种现象。首先，肿瘤内炎症增强可能导致肿瘤尺寸增加，其将表现为增大的指数病灶和新的可见的小非指数病灶。然后，随着时间的推移，肿块的恶性部分和炎性部分两者都可能减小，导致明显的临床改进迹象(Wolchok等人,2009)。可替代地，在一些个体中，肿瘤生长动力学可能最初超过了抗肿瘤免疫活性。在足够的时间内，抗肿瘤活性将占优势并且变得在临床上明显。因此，重要的是在每个时间点并行地评估RECIST 1.1和iRECIST

患者可以在初始RECIST 1.1-定义的进展之后继续研究疗法，并且因此如果符合以下标准，则允许根据iRECIST(Seymour等人,2017)确认疾病进展：

1.研究者评估的临床益处且没有快速疾病进展

2.研究药物的耐受性，如由研究者定义的3.稳定的体能状态

4.进展后的治疗不会延迟临近的干预以防止由快速进展的疾病导致的严重后果

5.没有疾病进展的并发症(例如，CNS转移)

临床益处的评估考虑了患者是否在临床上恶化以及是否不太可能从继续的治疗中获得进一步的益处。

剂量限制性毒性

如果患者有如下情况，则认为对于DLT评估，患者是可评价的：1)在DLT评估期期间经历DLT，而不管所接受的细胞剂量；或2)在DLT评估期期间接受至少70％的SQZ-AAC-HPV预期剂量之后，在DLT评估期期间没有经历DLT。在DLT评估期期间没有经历DLT但仍接受低于70％的预期SQZ-AAC-HPV剂量的患者被认为不能进行DLT评价并被替换。

经历不是IRR的DLT的患者被中断研究。如果研究者和赞助者认为继续使用研究性产品进行治疗符合患者的最佳利益，则后续治疗将由研究者与赞助者协商来确定。对于IRR，可以调整预先用药或施用率以使患者能够继续研究。

DLT定义为AE或临床显著异常实验室值，其由主要研究者评估并由SSC证实为与疾病、疾病进展、并发疾病、伴随用药/程序或环境因素无关，但与SQZ-AAC-HPV(单独或组合)相关，发生在用单一疗法治疗的前28天或用组合疗法治疗的前42天内，并且其符合如下使用国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(CTCAE)5.0版列出的任何预定义的标准。CRS和神经毒性的分级将使用美国移植和细胞疗法学会(ASTCT)一致性分级，分别如6.1.4节和6.1.5节所提及。

非血液学毒性

4级或5级。

3级毒性，尽管有最佳支持性照护，但7天内未消退至≤1级或基线，3级CRS或神经毒性除外，其在24小时内未消退至≤2级。

3级实验室值持续>7天并需要医学干预。

>3级肝毒性持续>48小时，以下例外：对于基线时具有2级天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和/或碱性磷酸酶异常的患者，只有增加>8×正常值上限(ULN)持续>48小时，才被认为是DLT。

肝脏检查异常符合海氏法则标准(Hy's law criteria)。

血液学毒性

任何5级毒性。

任何4级贫血。

任何≥3级发热性中性粒细胞减少症。

≥4级嗜中性粒细胞减少症(绝对嗜中性粒细胞计数<500/μL)持续>7天。

≥4级血小板减少症(<25,000/μL)。

≥3级血小板减少症(<50,000/μL)持续>7天，与临床显著出血相关。

至少可能与SQZ-AAC-HPV(单独或组合)相关的TEAE，其导致预先安排的SQZ AACHPV施用的第2周期第1天的永久中断或延迟>14天。

在研究者和赞助者的判断中认为是DLT的任何其他事件。

以下事件不被认为是DLT：

分离的3级脂肪酶值，其不伴随≥3级淀粉酶值或胰腺炎的临床症状或影像学证据。

3级CRS，在有或没有对症治疗的情况下，其在24小时内改进至≤2级。

3级皮疹，在有或没有适当的支持性照护的情况下，其在7天内消退≤2级。

在施用细胞产品2小时内发生的速发型超敏反应，其在24小时内可逆至≤2级。

1级或2级电解质异常，其在72小时内得到校正而无临床后遗症。

脱发。

通过增加预先用药或修改施用率可以充分管控的3级IRR不被认为是DLT，除非基于SSC的推荐，这些变化被认为适用于募入研究中的所有后续患者。如果一种或多种修改适用于所有后续患者，则群组重新开始DLT评价。经历3级输注反应的患者可以在对他们的预先用药或输注率进行修改的情况下继续研究。

如果在任何群组中都没有达到最大耐受剂量(MTD)，则可以测试另外的细胞剂量水平或方案。如果AE被DLT的定义所涵盖但与SQZ-AAC-HPV无关，则将由SSC讨论结果。

群组的停止标准和停止剂量递增或进展到群组和终止研究

修改的3+3规则限定了将群组宣布为安全的最终决定。确认群组安全所需的最少患者数目是3名患者具有0个DLT，其可以增加到多达12名患者以确认群组是安全的(即，<33％的患者具有DLT；例如，6名患者具有<2个DLT，9名患者具有<3个DLT，或12名患者具有<4个DLT，无论哪个都确认群组的安全性)。如果群组都没有表明已经达到MTD，则可以测试另外的细胞剂量水平或方案。如果AE被DLT的定义所涵盖但与SQZ-AAC-HPV无关，则将由SSC讨论结果。

符合DLT的定义并且出现在DLT窗口之外的AE将不被计数为DLT，而是将在给定群组的总体安全性评估和RP2D方案的选择中被考虑。

组群停止规则是在相同剂量组群内在接受研究性产品的多达12名患者中出现≥3DLT(≥33％)。如果触发了停止规则，则SSC可以作出以下推荐之一：

宣布先前耐受剂量水平为MTD。

在没有观察到DLT的情况下，宣布剂量水平为最大施用剂量(MAD)水平。因此，RP2D将不是MTD。

推荐测试中间剂量水平。

建议修改方案以增加患者安全性。

中断募入和/或研究。

在SSC评审之后，可以基于这些一般安全性标准，基于患者安全性的利益，可以停止患者的给药：

任何严重不良事件(SAE)，被认为是潜在威胁生命的并且通过医学监测仪评估为与研究性产品相关。

任何其他临床显著的变化，其向研究者或赞助者表明主要的耐受性问题。

研究群体

研究群体包括患有晚期HPV16+实体瘤(头颈癌、宫颈癌和其他肿瘤类型)的HLA-A*02+患者。

患者可能已经接受了用PD-1、CTLA-4抑制剂或其他免疫检查点抑制剂进行的先前疗法。

患者的数目

患者的数目将取决于安全性和观察到的免疫原性效应。在单一疗法第1部分(剂量递增时期)中，预期可以募入大约9至36名DLT可评价的患者。如果计划的群组都没有表明已经达到MTD，则可以测试另外的细胞剂量水平或方案。在第2部分可以募入总共多达大约36名可评价的患者(n＝12名/群组)。根据需要替换群组内的患者，预期在研究中将治疗大约72名可评价的患者。

入选标准

1.≥18岁的男性或女性患者，其是HLA-A*02+，如通过来自血液的基因型分型测定所确认的。

2.组织学上确认为HPV16+的不可治愈的或转移性实体瘤(包括但不限于宫颈和头颈肿瘤)。

3.对于不适合用手术、放射和/或化学放射疗法进行治愈性治疗的宫颈癌，所述癌症必须是在辅助或复发环境下用基于铂的方案进行的在先全身性化疗治疗之后有所进展。患者在接受最近的在先治疗时或在完成最近的在先治疗之后必须有疾病进展。

对于对基于铂的全身性化疗治疗不耐受或因复发性疾病而拒绝基于铂的全身性化疗治疗的患者，必须记录原因。

4.对于不适合用手术、放射和/或化学放射疗法进行治愈性治疗的复发性和转移性头颈癌，所述癌症必须是在原发、辅助或复发环境中在至少1次在先基于铂的化疗后有所进展，并且已经接受了检查点免疫疗法。如果复发时再次进行铂激发未见到受益，则在含铂的确定性化学辐射之后或在辅助化学辐射之后复发的患者是合格的。

5.患有除宫颈癌或头颈癌以外的不可治愈的或转移性HPV16+癌症的患者必须在至少1次针对不可治愈疾病的可用标准疗法之后有所进展，或患者对一种或多种标准疗法不耐受或拒绝一种或多种标准疗法或患有不存在一种或多种标准疗法的肿瘤。

剂量递增时期(第1部分)和组合安全时期(第2部分)

6.东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态(PS)为0至1。

7.患者必须同意静脉输液通路以进行用于制造自体血液产品的血液采集，并且如果静脉输液通路成问题，则愿意插入中心静脉导管。

8.患有不可切除的或转移性实体瘤的患者必须具有可以在可接受的临床风险下进行活检的病变，并且同意在筛选时和在第2周期第8天(±2天)进行新鲜活检。

a.只要在研究募入之前存在病变进展的客观证据，就可以对先前照射区域中的病变进行活检。

9.至少1处根据RECIST 1.1可测量的病变。

a.如果在研究募入之前存在病变进展的客观证据，则先前照射区域中的病变有资格被认为是可测量的疾病。

10.如通过在用于制造自体血液产品的血液采集前的14天内执行的如下实验室评估所表明的适当器官功能和骨髓储备：

a.骨髓功能：绝对嗜中性粒细胞计数≥1000/μL；血红蛋白≥9g/dL；血小板计数≥75,000/μL。注：在血红蛋白值<9g/dL的稳定化患者中，可以利用输血以符合入选标准。

b.肝功能：血清总胆红素≤1.5×ULN；血清AST/ALT≤2.5×ULN(在存在肝转移的情况下，≤5×ULN)；碱性磷酸酶<2.5×ULN，以下例外：肝和骨受累的患者：碱性磷酸酶≤5×ULN。

i.患有胆红素代谢遗传性障碍的患者应与赞助者一起讨论。

c.肾功能：血清肌酐≤2.5×ULN或肌酐清除率≥30mL/min，基于尿液采集或科克克罗夫特-高尔特估计。

d.凝血概况：凝血酶原时间(PT)，国际归一化比值(INR)/部分促凝血酶原激酶时间(PTT)≤1.5×ULN。如果研究者认为患者适于研究，则在用于制造自体血液产品的血液采集前进行至少30天的抗凝疗法的稳定保持方案的患者可以具有>1.5×ULN的PT/INR测量值。在募入前必须向赞助者提供充分的理由。

11.在用免疫检查点抑制剂治疗后需要激素替代疗法的患有免疫介导的内分泌疾病的患者是合格的。

a.如果每日剂量不超过10mg，则需要泼尼松作为激素替代疗法的一部分的患者是合格的。

12.具有生育潜力的女性患者必须：

a.在筛选时具有阴性血清β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)妊娠测试，和

b.同意从知情同意之时直到末次给药的免疫检查点抑制剂或SQZ-AAC-HPV之后至少5个月使用高效避孕(CTFG,2020)。

高效避孕的例子包括以下：

·与抑制排卵相关的组合激素避孕药(含有雌激素和孕酮两者)；可以是口服、阴道内或经皮的)

·宫内节育器(IUD)

·宫内激素释放系统(IUS)

·双侧输卵管闭塞

·输精管切除的伴侣

·性欲节制

13.未进行输精管切除术的男性患者必须愿意从知情同意之时直到末次给药的免疫检查点抑制剂或SQZ-AAC-HPV之后至少5个月使用避孕套。

14.患者能够理解并遵守协议，并且已经签署了所需知情同意书(ICF)。在执行相关研究程序之前，必须签署适当的ICF。如果适用，男性患者的女性伴侣理解并签署妊娠伴侣ICF。

排除标准

1.在用于制造自体血液产品的血液采集前2周内用抗癌疗法(包括研究性疗法)进行了治疗。对于半衰期长于3天的在先疗法，应与赞助者一起讨论中断疗法的时机。

2.患者具有根据NCI CTCAE 5.0版与用抗癌或研究性疗法进行的先前治疗相关的>1级不良事件(AE)(2级脱发除外)且在用于制造自体血液产品的血液采集前至少2周未消退(即，≤1级或更好)。

3.具有以下病史：来自在先免疫疗法的任何4级irAE(患有用替代疗法管控的内分泌病或血清淀粉酶或脂肪酶的无症状升高的患者是合格的)、导致在先免疫疗法的永久中断的任何irAE、或在用于制造自体血液产品的血液采集前≤6个月出现的任何3级irAE。

4.在最近6个月内用基于非皮质类固醇的免疫抑制剂治疗的患者可能不合格，并且应与赞助者一起讨论。

5.患有活动性、已知或疑似自身免疫性疾病的患者可能不合格，并且应与赞助者一起讨论。

6.接受脾切除术的患者。

7.已经接受或预期需要在抽血用于自体研究性产品制造前4周内输血的患者。

注：患者可以在如临床指示的抽血后接受输血。

8.进行了在先同种异体骨髓或实体器官移植的患者可能不合格，并且应与赞助者一起讨论。

9.在用于制造自体血液产品的血液采集前4周内进行了活病毒疫苗接种。

10.在用于制造自体血液产品的血液采集前14天内，用皮质类固醇(>10mg泼尼松或等同物/天)或其他免疫抑制药物进行了全身性治疗。

注：吸入、鼻内、关节内和局部(包括眼部)类固醇是允许的。允许患有肾上腺功能不全的患者使用类固醇替代物。允许在患有肾上腺功能不全的患者中使用氟氢可的松来替代盐皮质激素。

11.患有已知的活动性中枢神经系统转移和/或癌性脑膜炎。具有先前治疗的脑转移瘤的患者可以参与，条件是这些脑转移瘤是稳定的(在首次给药研究性产品前至少4周没有通过成像得到的进展证据，并且任何神经病学症状都已经恢复到基线)，没有新的或增大的脑转移瘤的证据，并且在用于制造自体血液产品的血液采集前至少7天没有使用类固醇。这种例外不包括癌性脑膜炎，其不管临床状态如何都被排除。

12.具有以下病史：需要类固醇的间质性肺病、特发性肺纤维化、肺炎(包括药物诱导的)或组织型肺炎(例如，闭塞性细支气管炎、隐源性组织型肺炎)。

a.不需要针对肺炎进行类固醇疗法的患有无症状肺炎的患者是合格的。

13.临床上显著的心脏病，包括不稳定型心绞痛、在用于制造自体血液产品的血液采集前6个月内的急性心肌梗塞、纽约心脏协会III或IV类充血性心力衰竭以及需要治疗的心律失常。

14.在用于制造自体血液产品的血液采集前1个月内发生全身性动脉血栓形成或栓塞事件，如脑血管意外(包括缺血发作)。

15.在用于制造自体血液产品的血液采集前1个月内发生全身性静脉血栓形成事件(例如，深静脉血栓形成)或肺动脉事件(例如，肺栓塞)。

a.在用于制造稳定抗凝疗法的自体血液产品的血液采集之前具有静脉血栓形成事件的患者是合格的。

16.异常心电图(ECG)史或存在异常心电图，研究者认为这在临床上是有意义的。

17.左心室射血分数(LVEF)<50％。

18.在用于制造自体血液产品的血液采集的2周内进行了大型手术；在大型手术后>2周在用于制造自体血液产品的血液采集前，所有手术伤口必须愈合并且没有感染或裂开。

19.任何其他临床上显著的共病，如活动性感染、已知的精神或神经障碍、或任何其他病症，其在研究者的判断中可能损害对方案的依从性、干扰研究结果的解释、或使患者容易有安全风险。

20.已知的活动性乙型肝炎或丙型肝炎、或活动性结核分枝杆菌感染。

21.患者在入选的12个月内有酒精和/或违禁药物滥用史。

22.在筛选访视时正进行母乳喂养或具有阳性血清妊娠测试的女性患者。

23.患者对SQZ-AAC-HPV的任何组分具有过敏或超敏反应史。

24.对嵌合、人或人源化抗体或输注蛋白的严重过敏性过敏反应史(仅组合群组)。

25.对伊匹单抗、纳武单抗、中国仓鼠卵巢细胞产品或者伊匹单抗或纳武单抗配制品的任何组分的已知超敏反应(仅组合群组)。

26.HIV+患者的募入应当与赞助者讨论。

用于制造自体血液产品的血液采集。

用于自体产品制造的血液采集的目标是为每名患者提供大约500×10⁹个细胞的RBC产量，以支持延长的治疗持续时间。为此，抽取至少200mL全血(±10％)以便采集至少500×10⁹个RBC。根据当地程序，在血液采集期间获得RBC或全血细胞计数，从而可以增加加工的血液体积。如果在血液采集期间不能获得RBC或全血细胞计数，则如果可能，在血液采集结束时取样，以确定RBC采集中的RBC计数。结果应该被尽可能快地处理并被实时提供给赞助者。

肿瘤反应评估和时间表

在筛选(基线)时执行肿瘤评估，并且在首次给药SQZ AAC HPV之后每9周(±7天)由研究者评估肿瘤反应，持续1年，然后此后每12周(±7天)评估肿瘤反应，直到如通过RECIST和iRECIST确认有疾病进展、不可接受的毒性、同意退出、死亡或从首次施用SQZ AACHPV之日起持续2年，以先出现者为准。

对于达到部分反应(PR)或完全反应(CR)的患者，4周后重复肿瘤评估以确认应答。

经由放射照相成像(CT扫描或MRI)评价疾病；放射照相法在整个研究中是一致的。如果治疗研究者认为符合患者的最佳利益，则可以继续向经历根据RECIST 1.1的疾病进展的患者给药，以允许确认疾病进展；即，根据iRECIST(Seymour等人,2017)的iCPD。

如果患者由于进展以外的原因而中断研究性产品，则继续按照上面概述的时间表使患者成像。如果患者由于临床恶化而中断治疗，则在AE页上记录与临床进展相关的TEAE。应获得并记录放射照相评估。

在筛选和所有后续时间点，宫颈癌、肛门癌/直肠癌、外阴癌/阴道癌和阴茎癌需要躯干(胸部、腹部和骨盆)和所有已知疾病部位的计算机断层扫描(CT)；口咽癌需要头部、颈部和胸部以及其他已知受累区域的CT。如果由于合理的原因，CT扫描无法使用或不允许适当的肿瘤评估，则容许磁共振成像(MRI)并且在筛选期间通知赞助者。在整个研究中使用与在筛选时用以评估疾病部位相同的放射照相程序。对于所有其他晚期实体瘤类型，研究者使用研究者认为最适合该肿瘤类型的成像模态对所有已知的疾病部位进行成像。

在筛选所有具有脑转移史的患者时需要脑的磁共振成像，并且可以在后续时间点在任何具有脑转移史的患者和/或任何患上暗示脑转移的症状的患者中重复。如果患者不能耐受MRI或具有MRI的禁忌证，则使用CT扫描。

如果可能，同一评价者执行评估以确保访视之间的内部一致性。根据研究者的判断，如果怀疑是疾病进展(PD)，则在任何时间重复CT扫描。对于达到部分反应(PR)或完全反应(CR)的患者，4周后重复肿瘤评估以确认应答。

包括免疫原性测量的药效学评估

样品采集时间表

为了评估SQZ-AAC-HPV对包括免疫原性测量的药效学的影响，采集血液和肿瘤活检物。

肿瘤活检物

在用于制造自体血液产品的血液采集前，患者经历筛选肿瘤活检(原发性肿瘤或转移)，肿瘤活检物可以来自先前放射的具有活动性肿瘤生长的部位。所有患者需要在第2周期第8天(±2天)经历同一原发性肿瘤或转移的重复肿瘤活检。如果可能，则在第5周期第1天(+2天)(给药前)获得另外的重复肿瘤活检物；此样品是任选的。如果初步数据表明，治疗中肿瘤活检时间点的修改将更适当，则可以考虑替代的治疗中肿瘤活检时间点。

基于总肿瘤含量和存活肿瘤含量，肿瘤组织应该具有良好的质量。在筛选时从原发性肿瘤或转移部位取得的新鲜肿瘤活检物和后续活检物来自在筛选时进行活检的同一原发性肿瘤或转移。解剖位置(器官和器官内的区域)应在CRF上标注。

药效学评估

只要可能，则使用基线样品进行细胞相关测试的纵向评估，包括但不限于通过流式细胞术(包括四聚体染色)进行的免疫表型分型、在与HPV肽(IFNγ和颗粒酶B酶联免疫斑点[ELISPOT])共培养后T细胞产生细胞因子的评估、以及循环无细胞HPV16DNA(cfHPVDNA)。将基线肿瘤活检物和选择的血液样品用于与仅治疗后样品比较(表2)。

表2药效学和免疫原性评估

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缩写：DNA＝脱氧核糖核酸；HPV16＝人乳头瘤病毒株16；IFNγ＝干扰素-γ

可以经由ELISPOT、T细胞受体测序和表位扩展对内源性免疫应答的发展进行评价。经由ELISPOT检测的关于内源性免疫应答的信息将告知肿瘤活检物的免疫组织化学分析。

细胞因子评估

患有2、3或4级CRS的患者具有在2、3或4级CRS事件期间执行的另外细胞因子血浆水平。在给药前、在第1周期第1天、和在CRS确诊时、在严重程度增加时(例如，当2级CRS进展至3级CRS时)、神经症状发作时、以及在出院或消退时进行血液采集。

细胞因子检测组套的评价包括但不限于IFN-γ(IFNγ)和IL 6。尽管CRS可能延迟发作，但其很少出现在疗法开始后14天以上。仔细评价患者展现出与此窗口外呈现的CRS一致的症状的其他原因。

还监测细胞因子以进行药效学评估。采集基线和治疗后血清样品，以通过测量细胞因子来评估抗肿瘤免疫应答，所述细胞因子可以提供关于药物炎症应答的信息。

为了评估在静脉内施用后从血流中去除SQZ-AAC-HPV的动力学，在第1周期和第2周期中采集血液样品。

安全性评估

已经确立了此研究的合格标准以确保参与患者的安全性。在本研究中，通过监测所有SAE和非严重AE以及实验室异常来评价安全性，根据NCI CTCAE 5.0版对其进行定义和分级。一般安全性评估将包括体格检查和具体实验室评价，包括血清化学、凝血和包括差异的血液计数。SAE和≥2级AESI将以快速方式报告以便进入安全性数据库。

在进行研究期间，评审观察到的安全性事件的总和(包括消退至2级的CRS事件)，并且将做出给定事件是否需要在此事件后开始交错募入患者的决定。在潜在的另外单一疗法群组(第1部分)或在组合安全性群组(第2部分)中的交错募入要求一个或多个群组中的所有后续新募入的患者交错1周。如果适用，则可以在一些群组中继续患者的平行募入。患有2、3或4级CRS的患者将具有另外的血样被送去安全性实验室和细胞因子检测组套的评价。

暴露于免疫检查点抑制剂可以增加irAE、尤其是自身免疫病症的风险。因此，irAE被早期识别并被迅速治疗以避免潜在的主要并发症。

所有患者在末次给药的研究性产品之后的15至45天内返回诊所进行安全性跟踪访视。记录所有AE和SAE，直到末次给药的研究性产品之后6周(EOD6W)或从退出直至45天或直到开始另一抗癌疗法，以先出现者为准。只有研究者确定为可能、大概或明确与SQZ-AAC-HPV单一疗法或组合疗法相关的正在持续的SAE才会被追踪。

体格检查及身高和体重

体格检查将包括身高(仅筛选)、体重、和一般外貌的评估以及以下系统的评估：皮肤、头、眼、耳、鼻、口/喉/颈、甲状腺、淋巴结、呼吸、心血管、胃肠、四肢、肌肉骨骼、神经和妇科以及泌尿生殖器系统，如所指示的。在用于制造自体血液产品的血液采集的24小时内对患者进行体格检查期间，获取体重是特别重要的，因为患者的给药是由体重决定的。

体能状态

使用东部肿瘤学合作组量表和标准来评估患者的体能状态，评估疾病如何影响患者的日常生活能力，并确定适当的治疗和预后。

12导联心电图

由合格的现场人员在预先安排的时间点使用ECG机执行12导联ECG，该ECG机测定心率、PR间期、QRS间期、RR间期和QT间期。将基于QT间期和RR间期计算QTcB(由贝泽特公式(Bazett’s formula)校正的QTc)和/或QTcF(由弗里德里恰氏公式(Fridericia’sformula)校正的QTc)。在ECG采集期间，患者在ECG采集之前应当处于休息姿势，处于安静环境而不分心(例如，没有电视、手机)至少10分钟。

所有ECG均由合格的医师针对异常的存在进行评价。

超声心动图

将执行超声心动图或多门控采集(MUGA)扫描以在筛选时和如临床指示测量LVEF。

实验室评估

在时间点采集用于临床实验室评估的样品。表3中概述的临床实验室测试是通过现场执行的。将表3中概述的用于实验室测试的样品收集在合适的试管中，并根据现场的标准程序进行处理。

临床实验室变量列于表3中。出于安全性监测目的，研究者必须评审、签署和记录所有超出范围的实验室结果。必须记录实验室结果。

表3临床实验室评估

a.在用于制造自体血液产品的血液采集前或当天需要收集这些实验室测试的结果，在用于制造自体血液产品的血液采集前得到这些结果。

b.在任何肿瘤活检的当天或第二天需要凝血参数的结果。

缩写：CRS＝细胞因子释放综合征；T3＝三碘甲状腺原氨酸；T4＝甲状腺素；TSH＝促甲状腺激素

不良事件

AE是患者中的任何不幸医疗事件，它不一定与所施用的研究性产品有因果关系。因此，AE可以是与研究性产品的使用暂时相关的任何不利或无意的体征(包括异常实验室发现)、症状或疾病，而无论是否与研究性产品相关。不良事件可以是新事件或者可以是严重程度或频率已经加重或已经恶化的预先存在的病症。

不良事件可以是在体格检查、实验室测试或其他诊断研究中自基线的临床上显著的变化。

在本研究中，如果开始时间是在施用研究性产品之后至末次给药的研究治疗(SQZ-AAC-HPV或免疫检查点抑制剂)之后6周，则AE是治疗期间出现的。

严重不良事件

SAE是导致以下任何情况的任何AE：

死亡。

是立即危及生命的。

需要住院治疗或延长现有住院治疗时间。

导致持续性或显著的残疾或无能。

导致先天性异常或先天缺陷。

是可能危害患者或可能需要医学干预以防止上面列出的结局之一的重要医学事件。

在任何患者签署了ICF之后、治疗之前、治疗期间或终止治疗后30天内发生的所有SAE(无论它们是否与研究相关)都必须记录在适当的临床程序表中。

特别关注的不良事件

AESI是研究性产品特有的科学和医学问题的AE(严重或非严重的)，对此，需要研究者进行正在持续的监测并立即通知赞助者。这样的AE可能需要进一步研究以表征和理解它们。在研究期间，可以通过方案修改来添加或去除特别关注的不良事件。

以下AE都被认为是AESI：

提示超敏反应、细胞因子释放、全身性炎症应答综合征、全身性炎症活化的事件。

流感样疾病。

输液反应综合征。

与免疫疗法相关的irAE，如心肌炎、神经学irAE、免疫相关病因的转氨酶升高和肾炎。

所有2级或更高级别的AESI都将在知晓的24小时内报告给赞助者。研究者认为是irAE或怀疑是免疫相关的事件应当立即与赞助者一起讨论。

另外，将向赞助者报告以下事件：

怀疑过量的SQZ-AAC-HPV。

肝脏测试符合海氏定律标准的异常，即AST或ALT实验室值≥3×ULN且总胆红素实验室值≥2×ULN，并且同时碱性磷酸酶实验室值<2×ULN，如通过方案指定或未预先安排的实验室测试所确定的。

通用

从第一个ICF签署之日直到EOD6W或从退出直至45天或直到开始另一抗癌疗法(以先出现者为准)，收集每名患者的不良事件，包括SAE。在报告期内发生的所有SAE和≥2级AESI(不管原因如何)都必须在从研究者知晓SAE或AESI之时的24小时内由研究者报告给赞助者或指定人员。只有研究者确定为可能、大概或明确与SQZ AAC HPV单一疗法或组合疗法相关的正在持续的SAE才会被追踪。

AE项在可能的情况下以标准医学术语报告。对于每个AE，研究者将评价和报告发作(日期和时间)、消退(日期和时间)、严重程度、因果关系、采取的行动、是否严重、以及它是否引起患者中断研究或导致研究性产品施用的修改或延迟。

所有AE(预期的和未预期的两者)(由患者自发报告或响应于研究人员的开放式问题或通过观察揭示的)将研究期间在研究现场记录在适当的研究特异性临床程序表上。如果与PD相关的临床结局或症状符合SAE和/或死亡标准，并且在末次研究性产品施用的6周内发生，则将它们报告为SAE和/或死亡。它们是根据事件的诊断或症状而不是术语“疾病进展”来报告。

标记任何超出正常范围的实验值以在现场引起研究者或指定人员的注意。研究者或指定人员将评审临床意义。如果在给药之后、研究期间和/或终止研究性产品后的6周内所采集的样品中发现临床显著的异常，则应将其记录为AE，并且按照研究者的判断，对患者进行随访，直到一种或多种测试正常化或稳定化。构成SAE或导致研究性产品的施用中断的异常实验室值被报告并记录在病例报告表(CRF)的AE页上。

对SAE和AESI进行跟踪，直到消退、病症稳定，或者研究者和赞助者认为不需要跟踪。如果在研究报告期结束时事件没有消退，则必须将其记录为正在持续。在得知该事件的24小时内，将所有SAE和非严重的≥2级AESI报告给全球药物警戒处理组。

严重程度的评估

使用NCI CTCAE 5.0版来评估AE和实验室异常的严重程度并对其进行分级。将ASTCT共识分级用于CRS和ICANS。每个AE项被映射到最新版本的监管活动医学词典(Medical Dictionary for Regulatory Activities，MedDRA)项和代码。

如果CTCAE 5.0版中没有涵盖该事件，则按表4中示出的准则来评估严重程度。

表4未被CTCAE涵盖的事件的严重程度和毒性等级

来源：(NIAID，2003)

缩写：CTCAE＝不良事件的通用术语标准

因果性的评估

由研究者评估与研究性产品的关系。因此，AE和SAE报告表包括将因果关系归因于SQZ-AAC-HPV、伊匹单抗、纳武单抗或组合的选项。对于接受SQZ AAC-HPV和一种或多种免疫检查点抑制剂的组合疗法的患者，单独对每种方案指定的疗法评估因果关系。如果事件与免疫检查点抑制剂标记一致，则合理的疑似因果关系归因于单独的免疫检查点抑制剂。

AE与研究性产品(即，SQZ-AAC-HPV、伊匹单抗、纳武单抗或组合)的关系记录如下：

明确的：AE明显与研究性产品相关。

很可能：AE很可能与研究性产品相关。

可能：AE可能与研究性产品相关。

不太可能：AE不太确定地与研究性产品相关。

不相关：AE明显与研究性产品不相关。

具有医学资格的研究者确定每个AE与研究性产品的关系。研究者根据他或她的医学判断判定该事件是否有由研究性产品引起的合理可能性。如果没有有效的理由表明存在关系，则将AE划分为“不相关”。如果有任何有效的理由(即使尚未确定)怀疑在研究性产品与AE的发生之间可能存在因果关系，则该AE将被视为“相关”。

如果在AE/SAE与研究性产品之间的关系被确定为“明确的”、“大概的”或“可能的”，则出于快速监管报告的目的，该事件被认为与研究性产品相关。

预期性

未列在适用产品信息中或与适用产品信息的特异性或严重程度不一致的AE(例如，针对SQZ-AAC-HPV的IB或针对伊匹单抗或纳武单抗的批准标记)被认为是出乎意料的。

功效分析

定义

无进展存活期(PFS)定义为从第1周期第1天到首次记录根据RECIST 1.1的客观肿瘤进展(PD，放射学)或由于任何原因导致死亡(以先出现者为准)的时间。将在记录患者无PD的末次肿瘤评估之日审查无进展生存期数据，所述患者没有客观肿瘤进展且在分析时仍处于研究之中，被给予除研究性产品以外的抗肿瘤治疗，或在记录客观肿瘤进展前从治疗随访中移除。在募入之后没有进行肿瘤评估的、尚不知道是否已死亡的患者将在第1周期第1天中接受PFS审查。根据RECIST 1.1和iRECIST标准两者评估PFS，以适应在参与现场之间的不同做法。

总存活期(OS)定义为从第1周期第1天的日期到由于任何原因导致死亡的日期的时间。在没有确认死亡的情况下，在已知患者存活的最后日期审查存活时间。缺乏超出第1周期第1天的数据的患者将第1周期第1天审查他们的存活时间。

客观反应率(ORR)定义为根据RECIST 1.1具有CR或PR的患者的比例。客观反应率作为未确认的ORR和确认的ORR提供。确认的反应是在初始记录反应之后至少28天在重复成像研究上持续的那些。类似地，还将汇总并报告根据iRECIST的iORR。

反应持续时间(DoR)定义为从首次记录PR或CR到首次记录客观肿瘤进展或由于任何原因导致的死亡的时间。在记录患者没有PD的末次肿瘤评估的当天审查反应持续时间数据，所述患者：1)没有肿瘤进展且在分析时仍处于研究之中；2)被给予除研究性产品以外的抗肿瘤治疗；或3)在记录客观肿瘤进展前从研究随访中移除。类似地，汇总并报告根据iRECIST的iDoR。

一旦报告了从第1周期第1天直到疾病进展或死亡的所有肿瘤评估，则确定最佳总体反应(BOR)。通常，它是所有评估中的最佳反应；然而，在BOR确定中使用CR、PR和疾病稳定(SD)的确认。为了确认CR或PR，通过重复评估确认肿瘤测量的变化，所述重复评估应当在首次符合反应标准之后不少于4周(28天)进行。为了确认SD，其必须在从第1周期第1天起至少12周内出现；否则，BOR将取决于后续评估。最佳总体反应将通过百分比且使用募入作为锚定日期作为对于达到最佳反应的时间的时间事件变量进行汇总。类似地，汇总并报告根据iRECIST的iBOR。

疾病控制率(DCR)是在限定的时间点根据RECIST 1.1确定其中BOR为CR、PR或SD的患者的比例。在基线处具有可测量疾病并且适合肿瘤评估的安全性群体中的所有患者都被认为是在3、6和12个月时DCR比例的分母。类似地，汇总并报告根据iRECIST的iDCR。

分析

对安全性群体执行功效分析。还将描述具有记录的HLA I类表达的患者的抗肿瘤活性(ORR、PFS、OS)。如果符合方案群体不同于安全性群体，则还将使用PP群体执行功效分析。

使用研究者的评审评估来分析使用根据RECIST 1.1或iRECIST的反应评估进行的所有评估。

使用卡普兰-迈耶方法(Kaplan-Meier method)来估计中位PFS和双侧95％置信区间。无论死亡原因如何，死亡的患者都将被认为已经发生了事件，除非在死亡前接受了后续抗癌疗法。如果接受了后续疗法，则将在后续疗法前在末次可评价肿瘤评估之日审查患者。同意退出研究的患者被视为是在同意退出前的末次可评价肿瘤评估时被审查。在临床数据截止日期时仍然存活的患者将在最近可评价肿瘤评估时被审查。在临床数据截止日期前失访的所有患者也将被视为是在失访前的末次可评价肿瘤评估时被审查。

反应持续时间、达到最佳总体反应的时间和总体存活期将使用与PFS相同的审查算法。另外，使用类似的方法分析并报告使用iRECIST的iPFS、iBOR、iDCR和达到iBOR的时间。

基于精确二项式分布，客观反应率(ORR)和DCR呈现为具有95％双侧置信区间的比例。持续至少12周的SD将作为点估计值报告。

安全性分析

使用安全性群体分析所有安全性参数。安全性参数包括AE、实验室评价、生命体征、ECOG、暴露、ECG、ECHO/MUGA和体格检查。

安全性的主要终点是具有任何AE和对SQZ-AAC-HPV施用观察到毒性的患者的数目，其中使用NCI CTCAE 5.0版评估严重程度。在首次施用SQZ-AAC-HPV之后发作的所有AE都将包括在分析中。从签署知情同意书开始收集不良事件；然而，将集中于治疗期间出现的AE执行分析。

将使用描述性统计学来分析AE。对于多次发生给定AE的患者，使用最高的严重程度。

不良事件

使用当前版本的MedDRA编码字典对AE进行编码。

如果AE在第1周期第1天至末次给药的研究性产品之后6周发作，则所述AE是治疗期间出现的。对于具有部分发作时间的AE，使用非缺失日期部分来确定AE是否是治疗期间出现的。如果无法确定AE是相对于研究性产品施用何时发生的，则将AE划分为治疗期间出现的。治疗中出现的AE还包括在首次施用研究性产品前存在的和在所述施用之后毒性恶化的任何AE。

本节中所述的分析是基于TEAE，为简便起见，本节中将其简称为AE。

出于概述的目的，将研究者认为可能、很可能或明确与研究性产品相关的不良事件划分为相关的。

汇总了具有任何AE、任何相关AE、任何SAE、任何相关SAE、任何3级或更高等级的AE、任何相关3级或更高等级的AE的患者的数目和百分比，以及每一类的事件总数。汇总了由于AE导致的死亡数目、由于AE导致的住院治疗数目和由于AE导致的治疗中断以及DLT和AESI。

具有AE的患者的数目和百分比以及AE的总数通过系统器官类别和优选术语来概述。对于相关的AE、AESI、SAE、相关的SAE、和≥3级AE以及相关的≥3级AE，将重复此列表。

所有AE(包括非TEAE)都提供在患者列表中。将产生导致研究性产品中断的AE、导致死亡的AE、SAE、相关AE、AESI、DLT和≥3级AE的患者列表。

临床实验室评价

基线定义为在首次暴露于研究性产品前的最后一个非缺失值。这典型地是在周期第1天给药前，但也可以更早。通过研究访视汇总了实际值和自基线临床实验室测试的变化。

实验室测试结果根据NCI CTCAE 5.0版和如由研究者所确定的临床意义分类。如果每次研究访视对于每个参数报告多于1个实验室结果，则将选择产生最严重分类的结果用于分析。建立转移表以显示分级实验室参数自基线的最大变化。

所有实验室评估都提供在列表中。

列出了具有临床显著异常实验室测试结果的患者。此列表将包括实验室参数的所有结果，所述结果是异常的并且在整个研究访视中由研究者对于患者确定为临床显著的。

生命体征

基线定义为在首次暴露于研究性产品前的最后一个非缺失值。生命体征的实际值和自基线的变化将通过研究访视和研究时间点来汇总。所有生命体征数据都呈现在患者列表中。

生命体征值根据如由研究者所确定的临床意义进行分类。具有非缺失结果的患者的数目、具有非临床显著性结果的患者的数目和百分比以及临床显著性结果将通过研究访视和研究时间点来汇总。如果每次研究访视和每个研究时间点对于每个参数报告多于1个生命体征结果，则将选择产生最严重分类的结果用于分析。

列出了具有临床显著生命体征值的患者。此列表包括由研究者确定在研究时间点上对于患者是临床显著的生命体征参数的所有结果。

体格检查

列出了异常体格检查结果。

12导联ECG

ECG结果在转移表(正常、异常临床上不显著、异常临床上显著)中呈现，以显示自基线的最大变化。所有ECG结果都呈现在患者列表中。

其他安全性变量

所有安全性数据都将提供在列表中。

在收集的每次预定安排的访视中汇总ECOGPS和ECOGPS自基线的变化。将ECOGPS自基线的变化汇总为连续变量和分类变量。将自基线减小≥1分归类为自基线“改进”。将自基线增加≥1分归类为自基线“恶化”。通过在评价ECOGPS的每个募入后时间点的处理，将自基线改进、恶化和未改变的ECOGPS汇总为分类变量。

药效学分析

对于每个时间点，针对自基线的变化和自基线的变化％，对生物标记物进行汇总。用描述性和图解方法探索药效学标记物与SQZ-AAC-HPV之间的相关性。

报告每种标记物的描述性统计学(平均值、标准差、中位数值、最小值、最大值和几何平均值)。将呈现根据剂量组单独值随时间推移的图。

剂量制造可行性

基于单独患者批次产量、禁止使用的产品失效、以及认为相关的来自血液采集以通过SQZ AAC HPV产品产生制造自体血液产品的任何另外的信息评估剂量制造可行性。

实施例2.如通过流式细胞术所测量的M-AAC-HPV的产生和基于膜联蛋白V+细胞的表面磷脂酰丝氨酸的表征

这些研究的目的是经由M-AAC-HPV的膜联蛋白V染色和流式细胞术分析来表征表面磷脂酰丝氨酸(PS)水平。

用于产生M-AAC-HPV的方法的描述

为了产生M-AAC-HPV，用E7合成长肽(SLP)和佐剂聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C)SQZ加工小鼠RBC。小鼠E7SLP(下面用粗体和下划线示出)包括在C57BL/6J I类MHC H2-Kb上呈现的小鼠E7抗原表位。此序列包含在人E7SLP来源的相同HPV16E7蛋白中。应注意到，对于C57BL/6J小鼠，E7是免疫显性抗原，并且针对E6的免疫在HPV16TC-1肿瘤模型中几乎不提供治疗益处(Oosterhuis 2011；Peng 2016,Li 2010)。因此，M-AAC-HPV仅含有小鼠E7SLP。下面是小鼠E7SLP和人E7SLP的结构的比较。

小鼠E7SLP：GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR(SEQ ID NO:25)人E7SLP：QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL(SEQ ID NO:23)

在M-AAC-HPV生产中使用的佐剂是与在SQZ-AAC-HPV(人药品)中使用的相同佐剂聚I:C。

除了促进E7SLP和聚I:C向M-AAC-HPV内部的递送外，SQZ过程还增加了暴露的PS在M-AAC-HPV膜上的水平。假设此表面PS充当由抗原呈递细胞上的受体识别的配体，所述抗原呈递细胞使静脉内施用之后的M-AAC-HPV内化。使用膜联蛋白V的荧光衍生物(以高亲和力结合PS的磷脂结合蛋白(Koopman 1994))针对细胞表面PS进行细胞染色，并且使用流式细胞仪检测。

从小鼠收获全血，并且分离小鼠RBC。然后将小鼠RBC以1×10⁹个细胞/mL悬浮于含有在PBS(磷酸盐缓冲盐水)或RPMI(洛斯维帕克纪念研究所(Roswell Park MemoryInstitute)(培养基))中的抗原(小鼠E7SLP；100M)和佐剂(聚I:C；1mg/mL)的溶液中，因为这些研究比较了在这个过程中PBS或RPMI的使用。将所得细胞悬浮液转移到小型SQZ设备的注射器中，然后进行SQZ加工。SQZ加工后，将所得AAC的悬浮液在室温下孵育20-60分钟。然后使用离心用PBS洗涤M-AAC-HPV悬浮液，并且最终用PBS重悬至2×10⁹/mL。

M-AAC-HPV上的表面PS水平

经由膜联蛋白V染色和通过流式细胞术获取的数据的分析来表征表面PS水平。显示膜联蛋白V+的M-AAC-HPV的百分比的汇总数据示于图5A和图5B中。

来自6个独立制备批次(3个批次在PBS中进行SQZ加工并且3个批次在RPMI中进行SQZ加工)的膜联蛋白V+M-AAC-HPV的平均百分比为94.8％±5.3％(平均值±标准差)，并且膜联蛋白V+未加工的RBC的平均百分比为2.0％±1.3％。来自6个独立制备批次的M-AAC-HPV中膜联蛋白V MFI(几何平均荧光强度)与未加工的RBC中膜联蛋白V MFI的平均比率为99±59(平均值±标准差)。另外，当在PBS或RPMI中加工细胞时，M-AAC-HPV的膜联蛋白VMFI与未加工的RBC中的膜联蛋白V MFI的比率没有显著差异。

这些研究证实，在用于SQZ加工RBC的条件下，PS的表面水平升高。对于M-AAC-HPV而言膜联蛋白V+AAC的百分比与人产品SQZ-AAC-HPV的所述百分比相当，其为至少95.8％。

实施例3.通过流式细胞术对AAC-HPV的细胞表征

研究的目的是定量FAM(5-羧基-荧光素)标记的SLP(合成长肽)、FAM-E6和FAM-E7SLP至AAC的递送，和表征AAC上的表面磷脂酰丝氨酸(PS)水平。

用于产生人AAC的小规模过程的描述

在研究之前一天采集全血，并且在研究的当天分离RBC。然后将RBC以2×10⁹个细胞/mL悬浮于含有抗原(SLP)和佐剂(聚I:C)的溶液中。将所得细胞悬浮液在冰上孵育10分钟，转移到小型SQZ设备的注射器中，然后进行SQZ加工。SQZ加工后，将所得AAC的悬浮液在2℃-8℃下孵育20分钟，然后在37℃下孵育60分钟。然后使用离心用PBS洗涤AAC悬浮液，并且最终用PBS重悬至2×10⁹/mL。

将FAM-E6SLP和FAM-E7SLP递送至AAC

在三个单独实验中从三名健康供体分离的RBC各自：A)照原样(未经SQZ加工)用作对照，B)用未标记的E6SLP、未标记的E7SLP和聚I:C进行SQZ加工以产生AAC-HPV，C)用5-羧基-荧光素(FAM)标记的E6SLP、未标记的E7SLP和聚I:C进行SQZ加工以产生AAC-HPV(F-E6、E7)，或D)用FAM标记的E7SLP、未标记的E6SLP和聚I:C进行SQZ加工以产生AAC-HPV(F-E7、E6)。表3描述了这些实验组。将三个批次的人RBC(每个批次来自不同的供体)进行SQZ加工以产生AAC-HPV、AAC-HPV(F-E6、E7)和AAC-HPV(E6、F-E7)。将SQZ加工的细胞用AF647-膜联蛋白V染色，并且通过流式细胞术分析以定量荧光标记的SLP的掺入并评估表面PS水平(基于膜联蛋白V；结果描述于2.4.3中)。未加工的RBC和AAC-HPV充当阴性对照(没有FAM标记)。

表5实验组

NA表示“不适用”。

显示FAM-E6SLP+样品和FAM-E7SLP+样品的百分比的汇总数据示于图6中。分别在0.1％和0.0％的AAC-HPV和未加工的RBC(阴性对照)中检测FAM荧光。大多数AAC对于FAM-E6SLP或FAM-E7SLP呈阳性；平均97.8％的AAC-HPV(F-E6,E7)和95.0％的AAC-HPV(E6,F-E7)分别对于FAM-E6SLP和FAM-E7SLP呈阳性。

将未加工的RBC和SQZ加工的细胞用AF647-膜联蛋白V染色，并且通过流式细胞术分析以定量表面PS水平(基于膜联蛋白V)。显示膜联蛋白V+样品的百分比的汇总数据示于图7中。尽管膜联蛋白V+的未加工的RBC的平均百分比为1.0％，但是至少95.8％的AAC-HPV、AAC-HPV(F-E6、E7)或AAC-HPV(E6、F-E7)对于膜联蛋白V呈阳性，证实SQZ过程增加了质膜上的PS。

实施例4.用荧光标记的SLP进行SQZ加工的人RBC的成像

本研究证实了SQZ加工后荧光标记的HPV E6和E7SLP细胞内递送至AAC中。

表6描述了这些研究中使用的实验组。在三个独立实验的每一个中，将来自健康供体的RBC从全血中分离，并且用以下进行SQZ加工：A)5-羧基-荧光素(FAM)-标记的E6SLP、未标记的E7SLP和聚I:C，以产生AAC-HPV(F-E6、E7)；B)FAM-标记的E7SLP、未标记的E6SLP和聚I:C，以产生AAC-HPV(E6、F-E7)；或C)未标记的E6SLP、未标记的E7SLP和聚I:C，以产生AAC-HPV。将SQZ加工的样品用太平洋蓝(PB)-缀合的抗CD235a抗体染色，并且用epi荧光显微术成像。对每个样品的图像进行线扫描分析以确定FAM标记的SLP定位是否在腔内(在AAC的内部)。

表6实验组

通过三名单独供体RBC(1名供体/实验)的SQZ加工产生的AAC-HPV(F-E6、E7)、AAC-HPV(E6、F-E7)和AAC-HPV的代表性epi-荧光图像及其相应的线扫描轨迹分别示于图8、图9和图10中。FAM+AAC-HPV(F-E6、E7)、AAC-HPV(E6、F-E7)和AAC-HPV的百分比的平均值和范围示于表7中。

表7FAM⁺AAC的平均百分比

组	FAM+％平均值	FAM+％的范围
			AAC-HPV(F-E6、E7)	100.0	100.0
AAC-HPV(E6、F-E7)	95.0	92.2-97.8
			AAC-HPV	0.0	0.0

表注：N＝3名供体/组。

经由荧光显微术使通过SQZ过程将荧光标记的E6和E7SLP(FAM-E6和FAM-E7)细胞内递送至人AAC中可视化。将AAC-HPV(F-E6、E7)、AAC-HPV(E6、F-E7)和AAC-HPV用PB缀合的抗CD235a抗体进行染色以限定质膜。然后通过荧光显微术使FAM-E6或FAM-E7SLP的定位可视化。用未标记的SLP进行SQZ加工的AAC-HPV充当阴性对照。

在荧光图像上执行的线扫描确认了SQZ加工后FAM-E6和FAM-E7的AAC内定位。具体地，在所有(100.0％)分析的AAC-HPV(F-E6、E7)和大多数(平均95.0％)分析的AAC-HPV(E6、F-E7)中观察到AAC内FAM。

此成像研究确认了作为SQZ加工的结果，荧光标记的E6或E7SLP分别递送至大多数人AAC-HPV(F-E6、E7)和AAC-HPV(E6、F-E7)中。

实施例5.通过流式细胞术测量的由人抗原呈递细胞(APC)实现的AAC-HPV的体外摄取

研究的目的是评估由人抗原呈递细胞(APC)实现的AAC-HPV的体外摄取。

将由HLA-A*02+供体通过CD14+单核细胞的五天GM-CSF/IL-4分化产生的单核细胞来源的树突细胞(MODC)用作人APC的体外模型。

将来自3名健康人供体的红细胞(RBC)用PKH26(亲脂性荧光膜染料)标记。使用报告号SQZ-AAC-0124中所述的方法，用E6SLP、E7SLP和聚I:C对未标记的RBC和PKH26标记的RBC进行SQZ加工，分别产生未标记的AAC-HPV和PKH26标记的AAC-HPV。

通过MODC实现的AAC-HPV的体外摄取表征为在37℃下与PKH26标记的AAC-HPV过夜共培养之后MODC(CD11c+细胞)中PKH26荧光增加，如通过流式细胞术所测量的。将MODC与PKH26标记的AAC-HPV在4℃下的共培养物或MODC与未标记的AAC-HPV的共培养物用作阴性对照。来自三个独立实验的汇总图示于图11中。示出在37℃下培养的MODC到在4℃下共培养的MODC的PKH26荧光的倍数增加的汇总数据示于表8中。

表8对于3名不同的MODC/RBC供体的不同剂量的PKH26标记的AAC-HPV在37℃和4℃下共培养时测量的MODC的平均PKH26几何平均荧光强度(MFI)

N/A表示不可用。在ELN1084中，PKH26标记的AAC-HPV或AAC-HPV的最高测试剂量是200×10⁶个细胞/孔。

在37℃下与PKH26标记的AAC-HPV共培养的MODC的PKH26MFI相对于在4℃下共培养的MODC的PKH26MFI显示出增加(2.8-31.2倍)，4℃是摄取被阻抑的温度(Albert 1998)。在所有研究(3个实验中的3个)中对于从2×10⁶至600×10⁶的范围的AAC-HPV剂量观察到这一点。在包含未标记的AAC-HPV的共培养物中没有观察到荧光，证实MODC的PKH26MFI的增加取决于PKH26标记的AAC-HPV。因此，CD11c+MODC以剂量和温度依赖性方式内化PKH26标记的AAC-HPV。

本研究证实MODC以剂量和温度依赖性方式摄取PKH26标记的AAC-HPV。

实施例6.如通过流式细胞术所测量的在AAC-HPV摄取后APC的体外成熟

本研究的目的是评估在与AAC-HPV共培养大约两天后，成熟标记物在人模型APC，MODC(单核细胞来源的树突细胞)上的体外上调。

将来自五名HLA-A*02+供体中的每一名的单核细胞与GM-CSF/IL-4一起孵育4天以产生五批MODC。对MODC进行表型分析，将其冷冻并在≤140℃下储存直至解冻以供使用。

使用报告号SQZ-AAC-0124中所述的方法，用E6SLP、E7SLP和聚I:C对人RBC进行SQZ加工，产生AAC-HPV。类似地，在不存在抗原(E6和E7SLP)和佐剂(聚I:C)的情况下用培养基对人RBC进行SQZ加工，产生C-培养基。

将来自五名不同供体的MODC与AAC-HPV一起共培养大约两天。

通过经由流式细胞术测量CD86、CD80、CD83、MHC-II和CD40染色的几何平均荧光强度(MFI)，并将其与仅用C-培养基或对照培养基培养的MODC的成熟标记物水平相比较，确定成熟标记物的上调。

CD86、CD80、CD83和MHC-II的汇总图示于图12中。与MODC共培养的AAC-HPV相对于用对照培养基的培养物没有导致MODC上CD40表达的增加；因此，CD40没有呈现在图中。

对于CD80、CD86和MHC-II，观察到MODC表面上成熟标记物的上调的统计学上显著的增加。尽管未观察到成熟标记物CD83上调的统计学上显著的增加，但是与C-培养基相比，五名MODC供体中的三名在与AAC-HPV共培养后展现出CD83的上调。另外，对于对照培养基、C-培养基和AAC-HPV的原始(未归一化)数据执行的统计学分析显示在对照培养基与C-培养基之间没有差异，确认在没有佐剂(和抗原)的情况下进行SQZ加工的RBC没有上调MODC上的成熟标记物。

本研究证实，与AAC-HPV一起体外共培养的MODC显著上调在MODC表面上的包括CD80、CD86和MHC-II的多种成熟标记物。尽管不显著，但是在用于MODC产生的5名供体中的3名中观察到CD83的上调。

实施例7.测量为与MODC共培养后由E711-20反应性CD8+ T细胞得到的IFN分泌的SQZ-AAC-HPV体外活性

研究的目的是证实对与人模型APC、MODC(单核细胞来源的树突细胞)和E711-20特异性CD8+ T细胞共培养的SQZ-AAC-HPV的功能性应答。

通过用E6和E7SLP以及聚I:C SQZ加工健康供体新鲜血液产生七个不同批次的SQZ-AAC-HPV，并将其配制为药品。通过用GM-CSF和IL-4刺激CD14+单核细胞五天，将SQZ-AAC-HPV与源自HLA-A*02+供体的MODC共培养。通过ELISA针对E711-20特异性CD8+ T细胞的IFN分泌分析来自所得共培养物的培养基。

来自七个不同批次的汇总数据示于图13中，所述数据示出了如通过ELISA所测量的来自与MODC共培养的E7特异性CD8+ T细胞的SQZ-AAC-HPV诱导的抗原特异性IFN应答。示出呈现为在含SQZ-AAC-HPV的共培养物中测量的IFN与在培养基对照共培养物中测量的IFN之间的倍数增加的IFN分泌量的汇总数据示于表9中。

与MODC和CD8+ T细胞与培养基对照的共培养物相比，MODC和CD8+ T细胞与所有7个批次的SQZ-AAC-HPV的共培养物导致分泌的IFNγ增加至少6倍。

本研究证实，在与HLA-A*02+MODC和E7特异性CD8+ T细胞一起体外共培养后，SQZ-AAC-HPV诱导由识别E711-20最小表位的E7特异性CD8+ T细胞分泌IFNγ。

表9SQZ-AAC-HPV的活性在7个独立SQZ-AAC-HPV批次的MODC和E7特异性CD8+ T细胞共培养物中测量

^a对于SQZ-AAC-HPV和培养基对照条件计算倍数增加

实施例8.如通过流式细胞术测量的在静脉内施用M-AAC-HPV后在小鼠中内源性APC的体内成熟

研究SQZ-AAC-0127的目的是评估在用小鼠原型M-AAC-HPV对小鼠进行免疫之后，在各种内源性脾APC(抗原呈递细胞)上成熟标记物的体内上调。

表10说明了评价M-AAC-HPV在雌性C57BL/6J小鼠体内激活脾APC的研究设计。将M-C-培养基(用培养基(在没有抗原或佐剂的情况下)进行SQZ加工的小鼠RBC)用作对照。处死动物的那天是执行免疫表型分型的那天。

评价的脾APC是CD11chiMHC-IIhiCD8+细胞(CD8+树突细胞或CD8+DC)、CD11chiMHC-IIhiCD11b+细胞(CD11b+树突细胞或CD11b+DC)和F4/80+CD11blo/-(RPM；红髓巨噬细胞)。

通过经由流式细胞术测量CD40、CD86、CD80、CD83和MHC-II染色的几何平均荧光强度(MFI)证实APC成熟标记物的上调。在施用M-AAC-HPV或M-C-培养基之后14-16小时执行脾的流式细胞术分析，以允许成熟标记物在细胞表面上的积累。

表10通过M-AAC-HPV实现的体内抗原呈递细胞成熟

M-AAC-HPV＝AAC-HPV的小鼠原型(用小鼠E7SLP和聚I:C进行SQZ加工的小鼠RBC)；M-C-培养基＝用培养基(在没有抗原或佐剂的情况下)进行SQZ加工的小鼠RBC；RO：眶后(施用途径)

脾APC上的标记物的汇总图示于以下图中，对于CD86几何MFI，在图14中；对于CD83几何MFI，在图15中；对于CD40几何MFI，在图16中；对于CD80几何MFI，在图17中；并且对于MHC-II几何MFI，在图18中。

来自两个独立实验的结果证实，与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中CD86几何MFI在所有三个脾APC群(CD8+DC、CD11b+DC、RPM)上均在统计学上显著增加。来自2个独立实验的结果证实，与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中CD83、CD40和CD80几何MFI选择性地在脾树突细胞(即CD8+DC和CD11b+DC)上在统计学上显著增加。来自2个独立实验的结果证实，与接受M-C-培养基的小鼠相比，在接受M-AAC-HPV的小鼠中MHC-II几何MFI选择性地在脾CD8+DC和RPM上在统计学上显著增加。

研究证实，用小鼠原型M-AAC-HPV免疫小鼠体内激活了包括CD8+DC、CD11b+DC和RPM的脾APC。在静脉内(IV)施用M-AAC-HPV后14-16小时，在各种APC群上观察到共刺激标记物(CD86、CD83、CD40、CD80和MHC-II)的上调，即标记物成熟，但在接受在没有任何抗原或佐剂的情况下(M-C-培养基)进行SQZ加工的小鼠RBC的小鼠中未观察到。

实施例9.在小鼠中用M-AAC-HPV进行体内免疫以测量如通过流式细胞术ICS所评估的CD8+ T细胞内源性应答-抗原和佐剂的影响

使用对于IFNγ的细胞内细胞因子染色(ICS)来检查在小鼠中引发E7特异性CD8+T细胞应答中对抗原和佐剂的需要。

如上所述执行小鼠血液的收获和RBC的分离。将RBC重悬，并且用仅含E7SLP(以产生M-AC)或仅含聚I:C(以产生M-C-聚I:C)的PBS溶液或含有E7SLP和聚I:C两者(以产生M-AAC-HPV)的溶液在如报告SQZ-AAC-0126中所述的SQZ加工条件下进行SQZ加工。

表11说明了评价在SQZ加工的红细胞(RBC)中需要抗原(E7SLP)和佐剂(聚I:C)以在雌性C57BL/6J小鼠中体内引发E7特异性CD8+ T细胞应答的研究设计。处死动物的那天是对脾细胞执行细胞内细胞因子染色(ICS)的那天。

表11抗原和佐剂对内源性应答的影响

ICS＝细胞内细胞因子染色；M-AAC-HPV＝AAC-HPV的小鼠原型(用小鼠E7SLP和聚I:C进行SQZ加工的小鼠RBC)；M-AC＝仅用抗原(在不存在佐剂的情况下)进行SQZ加工的小鼠RBC；M-C-聚I:C＝仅用佐剂(在不存在抗原的情况下)进行SQZ加工的小鼠RBC；NA＝不适用；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；RO＝眶后(静脉内施用方法)

在上表11对于ICS指示的当天，处死小鼠，收集脾脏，并且分离细胞以用于分析。通过评价当用E7最小表位肽再刺激时产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比来测量E7特异性CD8+T细胞应答。

E7特异性CD8+ T细胞应答的大小示于图19中。当用于免疫的SQZ加工的细胞含有佐剂(聚I:C)和抗原(E7SLP)两者时，产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比最大。与在接受仅用佐剂(M-C-聚I:C)或仅用抗原(M-AC)制备的SQZ加工的RBC的动物中相比，在接受M-AAC-HPV的动物中当用E7最小表位肽再刺激时产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比显著更大(p<0.0001)(对于M-AAC-HPV，平均值为0.60％，相比之下，对于M-C-聚I:C，平均值为0.02％，并且对于M-AC，平均值为0.03％)。

用M-AAC-HPV治疗的小鼠引发显著的E7特异性CD8+ T细胞应答，其取决于抗原(E7)和佐剂(聚I:C)的存在。

实施例10.在小鼠中在M AAC-HPV施用后CD8+ T细胞内源性应答的评估-剂量反应

本研究的目的是使用对于IFNγ的细胞内细胞因子染色(ICS)检查在小鼠中增加剂量的M-AAC-HPV(5×10⁷、1×10⁸、2.5×10⁸、5×10⁸和1×10⁹个M-AAC HPV/小鼠)对E7特异性CD8+ T细胞应答的影响。

上文描述了用于分离小鼠RBC和用E7SLP和聚I:C SQZ加工RBC以产生AAC-HPV的小鼠原型(M-AAC-HPV)的方法。

表12说明了体内评价不同剂量的M-AAC-HPV的研究设计。将雌性C57BL/6J小鼠用于研究。处死动物的那天是对脾细胞执行细胞内细胞因子染色(ICS)的那天。

表12 M-AAC-HPV剂量滴定

M表示百万；B表示十亿；NA表示“不适用”；RO：眶后(静脉内施用方法)；ICS＝细胞内细胞因子染色

在上表对于ICS指示的当天，处死小鼠，收集脾脏，并且分离细胞以用于分析。通过评价当用E7最小表位肽再刺激时产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比来测量E7特异性CD8+ T细胞应答。示于图20中的E7特异性CD8+ T细胞应答的大小证实了一定剂量范围的M-AAC-HPV的影响。

如图20中所见，E7特异性CD8+ T细胞IFNγ应答的大小取决于M-AAC-HPV的剂量。随着M-AAC-HPV的剂量增加，应答相应地增加，其中当用E7短肽再刺激时产生IFNγ的CD8+T细胞的百分比从剂量5×10⁷个M-AAC-HPV/小鼠时的平均值0.10％增加到剂量1×10⁹个M-AAC-HPV/小鼠时的平均值0.63％，相比之下，对于PBS对照的平均值为0.02％。在研究的剂量范围(5×10⁷个M-AAC-HPV/小鼠至1×10⁹个M-AAC-HPV/小鼠)内，应答在2.5×10⁸个M-AAC-HPV/小鼠下似乎趋于平稳。

用M-AAC-HPV治疗的小鼠引发显著的CD8+ T细胞IFNγ应答，其大小取决于M-AAC-HPV剂量。

实施例11.在小鼠中用M-AAC-HPV体内免疫以测量如通过四聚体染色所评估的血液中的E7特异性CD8+细胞-加强时间表的影响

其目的是确定向小鼠加强施用M-AAC-HPV对于E7特异性CD8+ T细胞内源性应答大小的影响，如使用四聚体染色在血液中所测量的。

表13说明了评价向雌性C57BL/6J小鼠施用另外的加强剂量的M-AAC-HPV对E7特异性CD8+ T细胞应答的大小的影响的研究设计。通过以下方式测量E7特异性CD8+T细胞：用结合对小鼠(E749-57-RAHYNIVTF)中的E7免疫显性表位特异性的T细胞受体(TCR)的MHC I类四聚体染色全血中的细胞，并通过流式细胞术评价全血中E7四聚体+CD8+ T细胞的百分比。

表13加强对E7特异性CD8+ T细胞应答的影响

NA表示“不适用”；RO：眶后(静脉内施用方法)

在末次免疫之后的不同时间点E7特异性CD8+ T细胞应答的大小示于图21、图22和图23。

在本研究中，通过测量激活的(CD44^hi)E7-四聚体阳性CD8⁺ T细胞相对于全血中的所有CD8⁺ T细胞的百分比，监测随着时间的推移对于E7的CD8+ T细胞应答。如图21-图23中所见，施用单剂量的M-AAC-HPV引发E7特异性CD8⁺ T细胞应答，如通过与PBS对照(范围0.02％-0.07％，平均值0.03％)相比，仅初免组中全血中E7四聚体⁺CD8⁺ T细胞(范围0.22％-0.44％，平均值0.28％)增加所证明的，但此差异没有达到统计学显著性。此外，相对于仅接受初免剂量的动物，初免之后2天或6天施用的另外免疫可以显著增加E7四聚体⁺CD8⁺ T细胞的百分比。

在最后免疫之后大约一周观察到所有组的最大E7四聚体⁺CD8⁺ T细胞应答。E7特异性CD8⁺ T细胞的百分比的范围对于PBS对照组为0.02％-0.07％(平均值0.03％)，对于单独初免组的动物为0.22％-0.44％(平均值0.28％)，对于第2天加强的动物为0.47％-1.27％(平均值0.79％)，对于第6天加强的动物为0.68％-1.30％(平均值0.98％)。在最后免疫之后大约两周，接受单次初免剂量的动物中的E7特异性CD8+ T细胞应答(范围0.03％-0.11％)与PBS对照(范围0.00％-0.03％)没有显著差异。相反，在第2天(范围：0.21％-0.6％)或第6天(范围：0.76％-1.08％)加强的动物中E7特异性CD8⁺ T细胞应答保持升高，并且显著高于单独初免动物中的应答。此外，甚至与在第2天加强的动物相比，在第6天加强的动物具有显著更多的E7特异性CD8⁺ T细胞。

本文中的研究证实用M-AAC-HPV免疫引发血液中E7特异性CD8+ T细胞体内应答。在250×10⁶个M-AAC-HPV的初免剂量之后2天或6天向小鼠静脉内施用250×10⁶个M-AAC-HPV的加强剂量导致E7特异性CD8+ T细胞应答相对于PBS对照组和仅初免组两者均显著和持续增加。

实施例12.在TC 1肿瘤模型中静脉内施用M-AAC-HPV进行治疗性免疫后在小鼠中的功效的体内确定-对抗原的需求

本研究的目的是评估与以相同剂量单次静脉内施用M-C-聚I:C(用聚I:C(无抗原)SQZ加工的小鼠RBC)和静脉内施用PBS相比，在以250×10⁶或1×10⁹个M-AAC-HPV/小鼠静脉内施用M-AAC-HPV单次疫苗接种后，在治疗性TC-1肿瘤模型中抑制肿瘤生长和延长中位存活期对抗原的需求。

用于分离小鼠RBC和用E7SLP和聚I:C SQZ加工RBC以产生AAC-HPV的小鼠原型(M-AAC-HPV)的方法描述于报告号SQZ-AAC-0126中。使用用聚I:C SQZ加工小鼠RBC等效地产生M-C-聚I:C。

下表说明了评价肿瘤研究中抗原的影响的研究设计(表14和表15)。在第0天，向小鼠(雌性C57BL/6J)皮下(SC)注射TC-1肿瘤细胞(50,000个细胞)。在表14和表15中所述的那天，通过眶后施用用测试品治疗小鼠。每天监测存活，并且每周两次测量肿瘤生长。

表14在M-AAC-HPV中抗原的抗肿瘤作用

NA表示“不适用”。“M”表示百万。

表15在M-AAC-HPV中抗原的抗肿瘤作用

NA表示“不适用”。“B”表示十亿。

来自两个独立实验(ELN103212和ELN1416)的汇总肿瘤生长数据示于图23中，并且汇总存活数据示于图25和表16中。

表16用M-AAC-HPV或M-C-聚I:C治疗的组的中位存活时间

如图24A和图24B中所示，在两个研究中静脉内施用250×10⁶或1×10⁹剂量的M-AAC-HPV显著延迟了肿瘤生长速率。相对于PBS对照，施用相等剂量的不含抗原的佐剂载体M-C-聚I:C不能减缓肿瘤生长。

如图25和表16所见，与对照治疗的小鼠相比，用任一剂量的M-AAC-HPV治疗的小鼠显示出统计学上显著延长的存活期。在用250×10⁶个M-AAC-HPV治疗的小鼠中存活期范围为38至53天(研究ELN103212)，并且在用1×10⁹个M-AAC-HPV治疗的小鼠中存活期范围为38至48天(研究ELN1416)。在用PBS和250×10⁶个M-C-聚I:C治疗的小鼠中，存活期范围分别为26至45天和26至34天(ELN103212)。在第2个研究(ELN1416)中，对于PBS和1×10⁹个M-C-聚I:C治疗的小鼠，存活期范围为27至34天，和27至41天。

与对照治疗的小鼠相比，静脉内施用剂量为250×10⁶或1×10⁹的M-AAC-HPV治疗小鼠导致显著延迟的肿瘤生长。另外，M-AAC-HPV治疗的小鼠在两种剂量下均显示出统计学上显著延长的存活期。相反，用M-C-聚I:C治疗的小鼠相对于对照在延迟肿瘤生长或延长存活期方面没有显示出改进，无论M-C-聚I:C剂量如何。

这些数据支持了抗原存在对治疗性TC-1模型中功效的必要性。

实施例13.在TC 1肿瘤模型中静脉内施用M-AAC-HPV进行治疗性免疫后在小鼠中的治疗性功效的体内确定-剂量反应

本研究的目的是评估TC-1小鼠肿瘤模型中静脉内施用增加剂量的M-AAC-HPV(50×10⁶、100×10⁶、250×10⁶和1×10⁹个M-AAC-HPV/小鼠)的抗肿瘤活性。

下表说明了在肿瘤研究中评价不同剂量的M-AAC-HPV(表17至表20)的研究设计。在第0天，向小鼠(雌性C57BL/6J)皮下(SC)注射TC-1肿瘤细胞(50,000个细胞)。在研究的第10天，通过眶后施用用测试品治疗小鼠。每天监测存活，并且每周两次测量肿瘤生长。

表17ELN103058的M-AAC-HPV剂量滴定

NA表示“不适用”

表18ELN103212的M-AAC-HPV剂量滴定

NA表示“不适用”

表19ELN133(SQZ-AAC-0132)的M-AAC-HPV剂量滴定

NA表示“不适用”

表20ELN1069的M-AAC-HPV剂量滴定

/>

NA表示“不适用”

来自4个独立实验的汇总肿瘤生长数据示于图26中，并且汇总存活数据示于图27和表21中。

表21用增加剂量的M AAC HPV治疗的组的中位存活时间

NA表示“不适用”。研究中不包括组。

显示与PBS组相比，给定剂量下M-AAC-HPV组的统计学显著性。*表示p<0.05，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。

这些研究证实在表达HPV-16E6和E7的TC-1小鼠肿瘤模型中用M-AAC-HPV静脉内免疫小鼠治疗性地抑制肿瘤生长并延长存活期。M-AAC-HPV抑制TC-1肿瘤生长和延长荷瘤小鼠的存活期的能力取决于M-AAC-HPV的剂量。具体地，与施用PBS的小鼠相比，在使用TC-1模型的所有(4个中的4个)研究中，静脉内施用剂量为1×10⁹或250×10⁶/小鼠的M-AAC-HPV治疗的小鼠展现出减缓的肿瘤生长。与施用PBS的小鼠相比，在大多数(3个中的2个)研究中，施用剂量为100×10⁶的M-AAC-HPV的小鼠展现出减缓的肿瘤生长。此外，在4个研究中的4个中，使用1×10⁹剂量观察到中位存活期的显著增加，在4个研究中的3个中，使用250×10⁶剂量观察到中位存活期的显著增加，并且在3个研究中的1个中，使用100×10⁶剂量观察到中位存活期的显著增加。在施用50×10⁶剂量的小鼠中既未观察到肿瘤生长的抑制，也未观察到中位存活期的延长(2个研究中的0个)。

实施例14.在TC-1肿瘤模型中静脉内施用M-AAC-HPV进行治疗性免疫后在小鼠中的功效的体内确定-加强方案的影响

本研究的目的是评估在TC-1肿瘤模型中，与以相同剂量单次施用(仅初免)相比，以100×10⁶或250×10⁶个M-AAC-HPV/小鼠静脉内施用M-AAC-HPV的两次施用(初免和加强)的抗肿瘤活性。

下表说明了在肿瘤研究中评价不同剂量的M-AAC-HPV(表22和表23)的研究设计。在第0天，向小鼠(雌性C57BL/6J)皮下(SC)注射TC-1肿瘤细胞(50,000个细胞)。按照表22和表23中所述的时间表，通过眶后施用用测试品治疗小鼠。

表21在加强下M-AAC-HPV的抗肿瘤作用(ELN133)

NA表示“不适用”

表22在加强下M-AAC-HPV的抗肿瘤作用(研究ELN1069)

NA表示“不适用”

来自两个独立实验的汇总肿瘤生长数据示于图28中。汇总存活数据示于图29和表24中。

表24用增加剂量的M-AAC-HPV治疗的组的中位存活时间

/>

这些研究证实，在TC-1肿瘤模型中，相对于单独施用初免，两次静脉内施用M-AAC-HPV(初免+加强)可以导致较慢的肿瘤生长，而不影响中位存活期。当与以100×10⁶个AAC/小鼠的剂量的M-AAC-HPV单独初免相比时，在第2天用初免+加强治疗的小鼠在2个研究中的1个中显示统计学上显著较慢的肿瘤生长，并且在第二个研究中显示可能的较慢生长趋势。在此剂量水平下，在2个研究中的2个中观察到与单独初免相比，初免+加强的中位存活期没有统计学差异。当与单独初免相比，以250×10⁶个AAC/小鼠的剂量的M-AAC-HPV进行初免加第2天加强治疗的小鼠在2个研究中的1个中显示统计学上显著较慢的肿瘤生长，并且在第二个研究中显示可能的较慢生长趋势。在此剂量水平下，在2个研究中的2个中与单独初免相比，初免+加强的中位存活期没有统计学差异。最后，与对照PBS治疗的小鼠相比，用100×10⁶或250×10⁶个M-AAC-HPV/小鼠进行的初免或初免+加强治疗小鼠可以延迟肿瘤生长并延长中位存活期。

实施例15.用M-AAC-HPV体内免疫携带TC-1肿瘤的小鼠以测量E7特异性CD8+ TIL的募集

本研究的目的是在用M AAC-HPV静脉内免疫后12天定量TC-1肿瘤的肿瘤微环境中的E7特异性CD8+ T细胞。

表25说明用于定量M-AAC-HPV施用后TC-1肿瘤中的E7特异性CD8+ T细胞的研究设计。在第0天，向小鼠(雌性C57BL/6J；5只/组)皮下注射TC-1肿瘤细胞(50,000个细胞)。在研究的第14天(ELN68中的研究)或第13天(ELN221中的研究)，用如表25中所述的测试品免疫小鼠。监测肿瘤体积和存活期直至处死前一天(第24天或第25天)。在施用测试品之后12天处死小鼠(在ELN68中第26天，和在ELN221中第25天)，并且取出肿瘤，以酶促加工成单细胞悬浮液。对细胞悬浮液执行四聚体染色，以通过流式细胞术确定E7特异性的浸润性CD8+ T细胞的百分比。

表24评估E7特异性CD8⁺ TIL的组

组	小鼠(#)	M-AAC-HPV(#/小鼠)	注射的总体积(μL)
				A：PBS	5	NA	200
B：M-AAC-HPV	5	250×10⁶	200

NA表示“不适用”

图30描绘了总活细胞中CD8⁺ T细胞的瘤内百分比、总活细胞中E7四聚体⁺细胞的百分比和CD8⁺ T细胞群中E7四聚体⁺细胞的百分比。针对肿瘤质量归一化的总CD8⁺ T细胞和E7特异性CD8⁺ T细胞示于图31中。被处死用于肿瘤采集的小鼠的肿瘤生长汇总数据示于图32中。

如图30中所见，在ELN68和ELN221中在免疫之后12天，与PBS治疗的对照相比，用M-AAC-HPV免疫的小鼠的肿瘤中CD8⁺ T细胞的平均百分比分别增加12.8倍和20.8倍。在M-AAC-HPV治疗的动物中，这些CD8+ T细胞中的大多数对E7抗原具有特异性，如通过四聚体染色所确定的(在ELN68中，CD8⁺ T群体的76.6±12.6％，和在ELN221中，CD8⁺ T群体的86.2±7.9％)。这些数据证实，在免疫后12天，与PBS治疗相比，用M-AAC-HPV免疫显著增加了肿瘤微环境中E7特异性CD8⁺ T细胞的平均百分比(在ELN68中，增加209.3倍；以及在ELN221中，增加71.2倍)。如图31中所示，当转化成针对肿瘤质量归一化的细胞数目时，还注意到E7特异性CD8⁺ T细胞的这种增加。E7特异性CD8⁺ T细胞的增加加上肿瘤体积的减小显示M-AAC-HPV通过扩增E7特异性效应CD8+ T细胞来减少肿瘤负荷。

这些研究证实，在TC-1小鼠肿瘤模型中，用M-AAC-HPV静脉内免疫导致浸润肿瘤的E7特异性CD8⁺ T细胞的显著增加。此观察结果与所提出的M-AAC-HPV的作用机制一致。

实施例16.重复静脉内施用M-AAC-HPV后在小鼠中的体内血清细胞因子/趋化因子分析，通过Luminex分析测量

本研究的目的是测量与对照PBS注射的小鼠相比，在用1、2、3、4或5剂M-AAC-HPV静脉内免疫之后的不同时间点，小鼠中的血清细胞因子/趋化因子。

表27说明了评价用至多5剂M-AAC-HPV免疫的C57BL/6J雌性小鼠中血清细胞因子/趋化因子浓度的研究设计。如图32中所指示，在所有时间点采集血清后，使用Milliplex测定执行细胞因子/趋化因子浓度的分析。

表27研究设计

B表示加强；所有静脉内施用均通过眶后(RO)途径进行。

^a经由颌下静脉穿刺采集血清。

^b通过终末心脏穿刺采集血清。

Milliplex测定中包括的分析物如下：G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、KC、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES和TNF-α。表28是描述相对于相应PBS时间点，在至少一个时间点上展现出统计学差异的任何细胞因子/趋化因子的关键结果的汇总表。

四种趋化因子(即IP-10、MIP-1β、MCP-1和RANTES)在所有组(一个例外)中证实了在末次免疫之后1天血清浓度的显著、一致但瞬时的增加。在研究过程中的任何时间点，在一组(P/B3)中MIP-1β相对于免疫前值的倍数变化在M-AAC-HPV与PBS对照之间没有显著差异(p＝0.46)。在所有组中，IP-10浓度保持升高，直到免疫之后4天。到第7天，M-AAC-HPV组中所有细胞因子/趋化因子的倍数变化(相对于免疫前值)与PBS对照中观察到的变化相比不再显著升高，除IL-12p70外。在接受M-AAC-HPV的5组中的1组(单独初免组)中，在第7天IL-12p70的倍数变化保持显著高于在相应PBS组中观察到的倍数变化。然而，在整个研究中在单独初免组中接受M-AAC-HPV的小鼠中IL-12p70相对于免疫前值的变化(范围0.43-2.05)是在相应PBS组中观察到的范围(范围0.43-2.37)内。所评价的其他细胞因子/趋化因子的浓度不是一直显著升高的，尽管对于一些其他细胞因子/趋化因子，观察到了偶发的统计学上显著的升高。这些包括GM-CSF、IL-7、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、KC和MIP-1α。

先前已经显示佐剂(如聚I:C)是先天免疫系统的激活剂，其导致多种细胞类型分泌趋化因子，包括IP-10、MIP-1β、MCP-1和RANTES(Longhi 2015；De Waele 2018)。还已经显示这些特异性趋化因子对于CD4+和CD8+ T细胞迁移到次级淋巴器官(如脾)的富含抗原呈递细胞(APC)的区域是重要的(综述于Sokol 2015中)。此外，还已经显示它们促进在T细胞与APC之间的簇集和稳定接触的形成，从而促进幼稚T细胞生产性激活和分化成效应T细胞。因此，IP-10、MIP-1β、MCP-1和RANTES的血清水平的早期和瞬时增加可能表明M-AAC-HPV对先天免疫细胞的早期激活。

在所有M-AAC-HPV组中，在本研究中测量的其他分析物(包括G-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-15、IL-17、MIP-2和TNF-α)在所有时间点与PBS治疗的对照相比都没有显示出显著变化。

本研究证实，在末次免疫之后第1天开始静脉内施用M-AAC-HPV通常导致IP-10、MIP-1β、MCP-1和RANTES的血清浓度与相应的PBS对照相比显著但短暂的升高。在接受M-AAC-HPV的小鼠与末次疫苗接种之后第7天接受PBS的小鼠之间，所有分析物浓度相对于免疫前值的变化都是可比的。

表27与PBS对照相比，在M-AAC-HPV之后显示显著增加的细胞因子/趋化因子的汇总表

/>

实施例17.在重复静脉内施用M-AAC-HPV后在小鼠中RBC清除率的体内确定

本研究的目的是确定五次重复施用M-AAC-HPV是否导致针对RBC的组分的免疫应答，从而导致后续施用的未加工的RBC的加速清除。进行本研究是因为先前在小鼠中的研究已经显示，在静脉内血液施用时静脉内施用的佐剂(如聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚I:C))可以诱导或增强针对表面RBC抗原的免疫应答(Gibb 2017)。已经显示这类应答导致在后续静脉内施用中的RBC的加速清除(Stowell SR 2014)。

表29说明了评价在用5剂M-AAC-HPV免疫的雌性C57BL/6J小鼠中静脉内施用未加工的(未SQZ加工的)同基因RBC(用PKH26标记)的循环动力学的研究设计。在血液采集后立即在表29中所指示的时间点通过流式细胞术对PKH26标记的RBC执行循环RBC的分析。

表29循环RBC的分析

所有静脉内施用均通过眶后(RO)途径进行。

M-AAC-HPV＝AAC-HPV的小鼠原型(用小鼠E7SLP和聚I:C SQZ加工的小鼠RBC)；PBS＝磷酸盐缓冲盐水

在静脉内施用后的不同时间点，全血中标记的RBC的百分比示于图34中。

本研究通过测量静脉内施用的标记的RBC的清除率评价重复给予M-AAC-HPV对诱导针对同基因RBC的免疫应答的影响。在M-AAC-HPV的第五次和末次免疫之后一周施用标记的RBC以允许有足够的时间用于产生免疫应答。静脉内施用后，监测标记的RBC持续48小时的时间段。在除了两小时时间点之外的所有时间点，在这两组之间没有统计学差异。在两小时时间点，全血中PKH26标记的RBC的百分比值对于M-AAC-HPV为6.05％(范围：5.86％-6.21％)，相比之下，对于PBS为6.41％(范围：5.87％-7.11％)，这一差异在预期的动物间变异内并且在生理学上不显著。

本研究证实，当与5剂PBS对照相比，静脉内施用5剂M-AAC-HPV没有导致可以引起同基因RBC加速清除的免疫应答，如在施用之后长达48小时静脉内施用的同基因标记的RBC的等效循环所证明的。

序列

/>

序列表

<110> SQZ生物技术公司

<120> 用激活抗原载体治疗癌症的方法

<130> 75032-20035.40

<140> Not Yet Assigned

<141> Concurrently Herewith

<150> US 63/131,506

<151> 2020-12-29

<160> 50

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 1

Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 2

Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 3

Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 4

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe

1 5

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 5

Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 6

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 7

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 8

Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 9

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu

1 5 10

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 10

Gly Gln Ala Glu Pro Asp

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 11

Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 12

Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

1 5

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 13

Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

1 5

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 14

Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys

1 5 10 15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 15

Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu

1 5 10 15

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 16

Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His

1 5 10 15

Val Asp Ile Arg

20

<210> 17

<211> 20

<212> PRT

<213> 人乳头瘤病毒

<400> 17

Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His

1 5 10 15

Val Asp Ile Arg

20

<210> 18

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 18

Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

20 25 30

Asp Phe Ala Phe

35

<210> 19

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 19

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu

1 5 10 15

Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20 25

<210> 20

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 20

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp

1 5 10 15

Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

20 25

<210> 21

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 21

Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala

1 5 10 15

Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val

20 25 30

Ser Asp Lys

35

<210> 22

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 22

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 23

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 23

Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu

1 5 10 15

Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu

20 25

<210> 24

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 24

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys

1 5 10 15

Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 25

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 25

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser

1 5 10 15

Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 26

ggggtcaacg ttgagggggg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 27

gggggacgat cgtcgggggg 20

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 28

ggggacgacg tcgtgggggg g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 29

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 30

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 31

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 32

tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 33

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23

<210> 34

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 34

tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 35

tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 36

tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 37

tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29

<210> 38

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 38

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu

35

<210> 39

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 39

Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu

1 5 10 15

Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn

20 25 30

Ile Val Thr

35

<210> 40

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 40

Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys

1 5 10 15

Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val

20 25 30

Asp Ile Arg

35

<210> 41

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 41

Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu

1 5 10 15

Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser

20 25 30

Gln Lys Pro

35

<210> 42

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 42

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

<210> 43

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 43

Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile

1 5 10 15

Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr

20 25 30

<210> 44

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 44

Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp

1 5 10 15

Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn

20 25

<210> 45

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 45

Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys

1 5 10 15

Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

20 25

<210> 46

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 46

Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr

1 5 10 15

Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu

20 25

<210> 47

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 47

His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn

1 5 10 15

Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg

20 25

<210> 48

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 48

Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu

1 5 10 15

Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys

20 25 30

<210> 49

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 49

Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg

1 5 10 15

His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr

20 25 30

<210> 50

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 50

Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg

1 5 10 15

Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

20 25 30

Claims

1.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含激活抗原载体(AAC)的组合物，其中所述有效量为约0.1×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg，并且其中所述AAC包含细胞内递送的至少一种HPV抗原和佐剂。

2.一种用于治疗个体的人乳头瘤病毒(HPV)相关癌症的方法，所述方法包括：

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述CTLA4的拮抗剂是结合CTLA4的抗体。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1的拮抗剂是结合PD-1的抗体或结合PD-L1的抗体。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中将结合CTLA-4的抗体和结合PD-1的抗体施用于所述个体。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述结合PD-1的抗体是纳武单抗。

8.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述结合PD-1的抗体是派姆单抗。

9.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中将结合CTLA-4的抗体施用于所述个体，并且将结合PD-L1的抗体施用于所述个体。

10.根据权利要求4和9中任一项所述的方法，其中所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原是HPV-16抗原或HPV-18抗原。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含源自HPVE6和/或E7的肽。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含源自HPVE6和/或E7的HLA-A2限制性肽。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述HLA-A2限制性肽包含SEQ ID NO:1-4中任何一个的氨基酸序列。

15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含SEQ IDNO:18-25中任何一个的氨基酸序列。

16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述AAC包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述个体对于HLA-A*02呈阳性。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述AAC对于所述个体是自体的或同种异体的。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述HPV相关癌症是当前、局部晚期或转移性癌症。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述HPV相关癌症是头颈癌、宫颈癌、肛门癌或食道癌。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中静脉内施用包含AAC的所述组合物。

25.根据权利要求2-24中任一项所述的方法，其中静脉内、口服或皮下施用所述CTLA-4的拮抗剂和/或PD-1/PD-L1的拮抗剂。

26.根据权利要求3-25中任一项所述的方法，其中静脉内施用所述结合CTLA-4的抗体和/或所述结合PD-1的抗体和/或所述结合PD-L1的抗体。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约1×10⁹个AAC/kg。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg至约7.5×10⁸个AAC/kg。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中包含所述至少一种HPV抗原和所述佐剂的AAC的所述有效量为约0.5×10⁸个AAC/kg、约2.5×10⁸个AAC/kg、约5×10⁸个AAC/kg或约7.5×10⁸个AAC/kg。

30.根据权利要求6-29中任一项所述的方法，其中伊匹单抗的有效量为约1mg/kg至约3mg/kg。

31.根据权利要求7和11-30中任一项所述的方法，其中纳武单抗的有效量为约360mg。

32.根据权利要求10-30中任一项所述的方法，其中阿特利珠单抗的有效量为约1200mg。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中在三周周期的第1天递送包含所述AAC的所述组合物。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中进一步在第一个三周周期的第2天施用包含所述AAC的所述组合物。

35.根据权利要求33或34所述的方法，其中在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个细胞/kg至约1×10⁹个细胞/kg。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中在每个三周周期的第1天施用约0.5×10⁸个细胞/kg、约2.5×10⁸个细胞/kg、约5.0×10⁸个细胞/kg或约7.5×10⁸个细胞/kg。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中在每个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个细胞/kg至约1×10⁹个细胞/kg。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中在所述第一个三周周期的第2天施用约0.5×10⁸个细胞/kg、约2.5×10⁸个细胞/kg、约5.0×10⁸个细胞/kg或约7.5×10⁸个细胞/kg。

39.根据权利要求33-38中任一项所述的方法，其中每三周周期施用一次结合CTLA-4的抗体和/或结合PD-1的抗体和/或结合PD-L1的抗体。

40.根据权利要求33-38中任一项所述的方法，其中每两个三周周期施用一次结合CTLA-4的抗体。

41.根据权利要求33-40中任一项所述的方法，其中在每个三周周期的第1天或两个三周周期的第1天施用结合CTLA-4的抗体。

42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗以约3mg/kg的剂量施用。

43.根据权利要求33-42中任一项所述的方法，其中在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用结合PD-1的抗体。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述结合PD-1的抗体是纳武单抗，其中将所述纳武单抗以约360mg的剂量施用。

45.根据权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述结合CTLA-4的抗体是伊匹单抗，其中将所述伊匹单抗在两个三周周期的第一个三周周期的第1天以约1mg/kg的剂量施用，并且将所述结合PD-1的抗体在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天以约360mg的剂量施用。

46.根据权利要求33-39中任一项所述的方法，其中在所述第一个三周周期的第8天和每个后续周期的第1天施用结合PD-L1的抗体。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述结合PD-L1的抗体是阿特利珠单抗，其中将所述阿特利珠单抗以约1200mg的剂量施用。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中将包含PBMC的组合物施用于所述个体持续至少约三个月、六个月、九个月或一年。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中包含AAC的所述组合物包含在冷冻保存介质中的约1×10⁹个AAC至约1×10¹⁰个AAC。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中包含AAC的所述组合物包含在约10mL冷冻保存介质中的约7×10⁹个PBMC。

51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述冷冻保存介质是CS2。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中通过包括以下步骤的方法制备包含所述至少一种HPV抗原和佐剂的所述AAC：

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述缩窄部的直径是约1.6μm至约2.4μm或约1.8μm至约2.2μm。

54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述输入无核细胞是红细胞。

55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含源自HPVE6的肽和源自HPV E7的肽。

56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含SEQ IDNO:1-4中任何一个的氨基酸序列。

57.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述至少一种HPV抗原包含SEQ IDNO:18-25中任何一个的氨基酸序列。

58.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中所述AAC包含含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的抗原和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的抗原。

59.根据权利要求52-58中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚I:C、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR 9激动剂。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909寡脱氧核苷酸(ODN)。