CN117031041A - 一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117031041A
CN117031041A CN202311103692.8A CN202311103692A CN117031041A CN 117031041 A CN117031041 A CN 117031041A CN 202311103692 A CN202311103692 A CN 202311103692A CN 117031041 A CN117031041 A CN 117031041A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
myeloperoxidase
alkaline phosphatase
magnetic bead
working solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202311103692.8A
Other languages
English (en)
Inventor
周强
冯俊博
周子明
陈顺俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Anesthesia Medicine Technology Co ltd
Original Assignee
Guangdong Anesthesia Medicine Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Anesthesia Medicine Technology Co ltd filed Critical Guangdong Anesthesia Medicine Technology Co ltd
Priority to CN202311103692.8A priority Critical patent/CN117031041A/zh
Publication of CN117031041A publication Critical patent/CN117031041A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗髓过氧化物酶(MPO)抗体测定试剂盒，包括R1磁珠包被物工作液、R3MPO反应缓冲液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、校准品。所述R1磁珠包被工作液包括髓过氧化物酶抗原‑磁珠包被物；所述磁珠与髓过氧化物酶抗原的包被比例为磁珠：髓过氧化物酶抗原＝1mg：(1‑4)μg。本发明的一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒采用磁珠包被髓过氧化物酶抗原，实现对目标分子的特异性捕获，令抗髓过氧化物酶抗体试剂盒灵敏度更高，可以检测到较低浓度的目标分子，且结果更加准确；本发明还公开了该试剂盒的制备方法和非诊断性检测方法。

Description

一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及检测试剂盒领域，尤其涉及一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
抗髓过氧化物酶抗体是一种特异性针对髓过氧化物酶的免疫球蛋白，主要通过结合抗原来对抗体进行检测。髓过氧化物酶是存在于人体中重要的酶之一，它主要存在于粒细胞和单核细胞中，是一种与细胞内杀菌和激发免疫反应密切相关的酶。
现有市场上常见的抗髓过氧化物酶抗体检测试剂盒通常采用ELISA(酶联免疫吸附试验)方法进行检测。中国专利CN103185797A公开了一种利用检测抗髓过氧化物酶抗体的试剂装置及其方法，该法利用酶联免疫分析原理，通过装置上的多个孔位对抗髓过氧化物酶抗体进行检测。然而以ELISA为原理的检测反应通常面临加样试剂复杂、流程长、存在一定开放时间导致污染，并且成本高的问题。另外，目前也有以化学发光免疫法为原理的试剂盒存在，能够避免酶联免疫法存在的上述问题，并且能够进行定量的检测。
但是目前的抗髓过氧化物酶抗体化学发光免疫法试剂盒同样存在检测灵敏度低、检测的线性范围窄、使用成本高的问题，并且试剂盒的检测时间长，不便于使用。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒，其能解决抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的反应时间长，无法定量和检测结果不精确的问题。
本发明的第二个目的在于提供一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒制备方法，其能解决抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的制备成本高和产品均一性不好的问题。
本发明的第三个目的在于提供一种非诊断和治疗目的抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的检测方法，其能解决抗髓过氧化物酶抗体的检测线性范围窄，检测成本高的问题。
本发明的第一个目的采用以下技术方案实现：
一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒，其特征在于，包括R1磁珠包被物工作液和R2碱性磷酸酶标记物工作液；所述R1磁珠包被物工作液中抗原浓度为0.1-1.2μg/mL。
进一步地，所述R1磁珠包被工作液含髓过氧化物酶抗原-磁珠包被物；所述磁珠与髓过氧化物酶抗原的包被质量比为1：(0.001-0.004)；所述R1磁珠包被物工作液含有髓过氧化物酶抗原-磁珠包被物，浓度为0.1-0.3mg/mL。
进一步地，所述R2碱性磷酸酶标记物工作液包括羊抗人IgG抗体-碱性磷酸酶标记物；所述R2碱性磷酸酶标记物工作液中羊抗人IgG抗体-碱性磷酸酶标记物浓度为0.5-2.0μg/mL。
进一步地，所述抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒还包括校准品、校准品复融液、化学发光底物液和R3MPO反应缓冲液；
所述R3MPO反应缓冲液为PBS溶液、Hepes溶液和Tris溶液中的至少一种，且所述MPO反应缓冲液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述MPO反应缓冲液的浓度为0.03-0.08M，pH值为7.1-7.3。
本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：
一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将磁珠和髓过氧化物酶抗原进行包被结合，封闭清洗后在加入磁珠包被物稀释液，得到R1磁珠包被物工作液；
S2、将碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记结合并超滤纯化，然后加入碱性磷酸酶标记物稀释液进行稀释，稀释得到R2碱性磷酸酶标记物工作液；
S3、将所述R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3MPO反应缓冲液、化学发光底物液、校准品和校准品复融液进行组装，得到抗髓过氧化物酶测定试剂盒。
进一步地，步骤S1中，所述磁珠和髓过氧化物酶抗原包被时间为1-6h；结合缓冲液为0.05-0.15M MES缓冲液，pH为5.0-6.0；磁珠和封闭液的比例为磁珠：封闭液＝1mg：(0.05-0.2)mL；所述封闭液为1-3％BSA溶液，所述封闭时间为0.5-2h。
进一步地，步骤S2中，所述碱性磷酸酶结合缓冲液pH为6.5-7.3，所述碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记结合时间为30-120min；所述超滤次数为4-8次；所述羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶结合的质量比为1：(0.5-5)；
所述碱性磷酸酶标记物稀释液为MES溶液、Tris溶液和TES溶液中的一种，且所述碱性磷酸酶标记物稀释液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述碱性磷酸酶标记物稀释液浓度为0.03-0.08M，pH值为6.4-7.6。
进一步地，还包括校准品的冻干处理步骤，所述冻干处理步骤的冻干程序如下：
冷冻阶段：冷冻温度-60～-40℃，持续10-12h，然后以4-6℃/h的速率升温至主干燥阶段；
主干燥阶段：冷冻温度-35～-0℃，持续10-15h，然后以0.7-10℃/h的速率升温至次干燥阶段；
次干燥阶段：冷冻温度0～20℃，持续1-4h，然后以3-10℃/h的速率升温至完全干燥阶段；
完全干燥阶段：冷冻温度25～30℃，持续2-5h。
本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：
一种非诊断和治疗目的抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
步骤1、将待测样品稀释后与R1磁珠包被物工作液、R3MPO反应缓冲液进行孵育结合，第一次洗涤后加入R2碱性磷酸酶标记物工作液进行标记结合，磁分离并进行第二次洗涤，得到抗髓过氧化物酶抗体免疫复合物；
步骤2、将所述抗髓过氧化物酶抗体免疫复合物加入化学发光底物液中反应，检测RLU发光值；
步骤3、将RLU发光值与校准品构建的发光值标准曲线进行匹配，得到待测样本中的抗髓过氧化物酶抗体的含量。
进一步地，所述待测样品的稀释倍数为10-60倍；
所述稀释后样品、R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3MPO反应缓冲液、化学发光底物液的加入体积比为(20-100)：(20-70)：(20-100)：(20-70)：(100-300)；
所述步骤1中，孵育结合时间为5-15min，第一次洗涤次数为1-5次；标记结合时间为2.5-10min，第二次洗涤次数为1-5次；所述步骤2中，底物反应时间为2.5-10min。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明的一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒采用化学发光免疫法，其中R1磁珠包被物工作液中MPO抗原的含量能够更有效捕获样品中的抗MPO抗体，令抗髓过氧化物酶抗体试剂盒灵敏度更高，可以检测到较低浓度的目标分子。
2.本发明的一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒检测方法，操作流程简单、快速，并且易于自动化，在30min内即可获得均一性和准确度高的结果，大幅提高了样品的处理效率，同时稀释倍数在10-60，降低了使用成本的同时扩大了可报告区间，可报告区间为0.5～9300mg/L。
3.本发明的一种抗髓过氧化物酶抗体试剂盒制备方法，制备方法简单，能够实现批次间和样品间的高度可重复性，产品的批间差变异系数在0.87～0.92％。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1磁珠和抗体包被工艺
1.包被抗原用量优化
按每mg磁珠添加1、2、4μg抗原进行包被，试验结果如下表1：
表1抗原包被用量优化表
试验结果显示，以每mg磁珠包被2μg抗原的检测结果最为理想，信噪比最高，因此在本实施例进行磁珠包被时，使用2μg(抗原)：mg(磁珠)比例进行包被。
2.结合缓冲液pH优化
分别用pH为5.0、5.5和6.0的0.1M MES，进行包被。试验结果如表2：
表2磁珠和抗体结合缓冲液pH优化表
从上表2可知，结合缓冲液为pH5.5时信噪比最高。因此本实施例的结合缓冲液的pH为5.5。
3.封闭液中BSA浓度优化
调整封闭液中BSA的量，使BSA浓度为1％、2％、3％，进行磁珠封闭，按每mg磁珠加封闭液0.1mL进行磁珠封闭。试验结果如下表3：
表3封闭液中BSA含量优化表
从上表3可知，封闭液中BSA含量为2％时，封闭效果最好，信噪比最高。因此本实施例选用封闭液中BSA含量为2％。
4.磁珠包被时间优化
分别设置磁珠包被时间为1h、3h、6h，进行磁珠包被。试验结果如下表4：
表4磁珠和抗原包被时间优化表
从上表4可知，包被时间为3h时，信噪比最高。因此本实施例选择包被时间为3h。
5.磁珠封闭时间优化
分别设置磁珠封闭时间为0.5h、1h、2h，进行磁珠封闭。试验结果如下表5：
表5磁珠和抗原封闭时间优化表
从上表可知，封闭时间为0.5h时，信噪比最高。因此本实施例选择封闭时间为0.5h。
6.磁珠包被物稀释液优化
分别以0.05M Hepes(PH7.2-7.4)体系、0.05M PBS(PH7.2-7.4)体系和0.05M Tris(PH7.2-7.4)体系(均含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300)稀释磁珠包被物，测试样本信噪比。其余试剂稀释液保持不变，使用0.05M Tris(PH7.2-7.4)。试验结果如下表6：
表6磁珠包被物稀释液优化表
从上表6可知，磁珠包被物用Tris体系稀释时，信噪比最好。因此选择Tris体系稀释磁珠包被物。
优选的，本实施例的R1磁珠包被物工作液制备方法如下：
按1mg磁珠包被有2μg髓过氧化物酶抗原的比例，在结合缓冲液中进行包被，结合缓冲液为0.1M的MES缓冲液，pH为5.5。磁珠和抗原包被时间为3h，清洗后加入2％的BSA溶液进行封闭，封闭液添加量为每mg磁珠加封闭液0.1mL，封闭时间为0.5h，获得髓过氧化物酶抗原-磁珠包被物，用磁珠包被物稀释液进行稀释，磁珠包被物稀释液为0.05M Tris，含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin300，pH为7.2-7.4，完成R1磁珠包被工作液的制备，R1浓度为0.1mg/mL。
实施例2碱性磷酸酶标记工艺
1.标记pH优化
分别用PH为6.5和7.3的0.1M TSE进行碱性磷酸标记羊抗人IgG抗体，标记时间均为30min，结果如表7。
表7碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体标记pH优化表
从上表7可以看出，标记pH为7.3时信噪比高。因此本实施例确定碱性磷酸酶标记缓冲液pH为7.3。
2.标记时间优化
以pH7.3的0.1M TSE为标记缓冲液，分别以30、60、120min进行标记。试验结果如下表8。
表8碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体标记时间优化表
从上表8可知，标记时间60min组的信噪比最高。最终确定本实施例碱性磷酸酶标记时间为60min。
3.超滤次数优化
设置碱性磷酸酶标记抗体超滤纯化次数为4、6、8次进行试验，结果如下表9。
表9碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体标记超滤次数优化表
从上表9可知，超滤6次组的信噪比最好，因此确定本实施例超滤纯化次数为6次。
4.抗体与碱性磷酸酶比例优化
设置抗体：碱性磷酸酶(AP)质量比＝1:1、1:2、1:4进行试验，结果如下表10。
表10碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体结合比例优化表
从上表10可知，抗体：碱性磷酸酶(AP)质量比＝1:2的信噪比最好，因此确定本实施例羊抗人IgG抗体与碱性磷酸酶结合比例为质量比＝1:2。
5.碱性磷酸酶标记物稀释液优化
分别以0.05M Mes(PH 6.4-6.5)体系、0.05M Tris(PH7.2-7.4)和0.05M TES(pH7.4-7.6)体系(均含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300)稀释羊抗人IgA抗体碱性磷酸酶标记物母液，测试样本信噪比。其余试剂稀释液保持不变，使用0.05M Tris(PH7.2-7.4)。试验结果如下表11：
表11碱性磷酸酶标记物稀释液优化表
从上表11可知，碱性磷酸酶标记物用TES体系稀释时，信噪比最好。因此选择TES体系稀释碱性磷酸酶标记物。
优选的，本实施例中采用以下方法制备R2碱性磷酸酶标记物工作液：
活化羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶，将碱性磷酸酶与羊抗人IgG抗体在碱性磷酸酶标记缓冲液中进行标记，所述羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶的质量比为1：2，标记时间为30min；所述标记缓冲液为0.1M TSE缓冲液，pH为7.3。随后超滤纯化，超滤次数为6次。使用碱性磷酸酶标记物稀释液进行稀释，稀释液体系为含有1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300的0.05M TES缓冲液，稀释缓冲液pH为7.2-7.4，完成R2碱性磷酸酶标记物工作液的制备，浓度为1.0μg/mL。
实施例3 MPO反应缓冲液体系筛选
分别以0.05M Hepes(PH7.2-7.4)体系、0.05M PBS(PH 7.2-7.4)体系和0.05MTris(PH7.2-7.4)(均含1％BSA、0.1％Tween 20、0.5％Proclin 300)作为MPO反应缓冲液，测试样本信噪比。其余试剂稀释液保持不变，使用0.05M Tris(PH7.2-7.4)。试验结果如下表12。
表12 MPO反应缓冲液体系筛选
从上表12可知，MPO反应缓冲液用Tris体系稀释时，信噪比最好。因此本实施例选择Tris体系作为MPO反应缓冲液。
实施例4校准品制备工艺
1.冻干校准品的制备
对高值血清样本用冻干缓冲液进行5倍稀释，所述冻干缓冲液配方为磷酸二氢钠NaH2PO4 0.168g、磷酸氢二钠Na2HPO4 1.45g、氯化钠NaCl 4.5g、甘氨酸5g、海藻糖25g、BSA25g、Proclin300 2.5mL。先加300～400mL纯化水充分溶解后，补充纯化水至总体积为500mL，随后用0.45μm孔径的滤膜过滤，保存于2～8℃。
对稀释后的样本进行冷冻干燥，冻干程序如表13和表14所示。
表13校准品冻干程序表1
段数 温度/℃ 时间/h 段数 温度/℃ 时间/h
1 -60 6 9 -20 2
2 -55 1 10 -15 1
3 -50 1 11 -10 1
4 -45 1 12 -5 1
5 -40 1 13 0 1
6 -35 1 14 10 1
7 -30 1 15 20 1
8 -25 5 16 30 3
表14校准品冻干程序表2
2.校准品性能测试
(1)热稳定性测试：取上述两种冻干程序制备的冻干品分别置于37℃环境中，分装成约285μL/瓶，于第0、1、3、5、7、9天分别取出1瓶，2-8℃暂存。以2-8℃保存的组作对照，于第9天检测。要求测试组与对照组发光值偏差在±10％以内。
(2)反复冻融测试：选用含0.1％Tween-20和0.5％Proclin 300的水溶液作为冻干品的复融液。取冻干品用复溶液溶解后，200μL/瓶分装后，保存于-20℃环境中，分别做反复冻融。每次室温融解时间>＝1小时，-20℃放置>16小时。于第1、2、3次冻融后分别取出1瓶，2-8℃暂存。以2-8℃保存的组作对照，于第3次检测。要求测试组与对照组发光值偏差在±10％以内。
(3)低温保存测试：取冻干品用复溶液溶解后，置于2-8℃环境，分别于第0、7、14、21天进行检测。
表15校准品热稳定性测试结果
/>
表16校准品复溶-反复冻融测试结果
表17校准品低温保存测试结果
从表15-17结果上看，用冻干程序2制备的校准品热稳定性良好，复融后，反复冻融3次，与新溶解的比对，发光值无显明差异。冻干品溶解后置于2-8℃21天内稳定。因此本实施例选用冻干程序2进行校准品的制备。
实施例5抗髓过氧化物酶抗体试剂盒的使用方法
1.试剂盒检测方法
将待测的样品先进行稀释，与R1磁珠包被物工作液混合，使待测样品中的抗髓过氧化物酶抗体与R1磁珠包被物工作液中的髓过氧化物酶抗原孵育结合(第一次反应)，形成抗髓过氧化物酶抗体-髓过氧化物酶抗原-磁珠结合物。进行第一次洗涤，洗涤未结合的物质。
随后向反应体系中加入R2碱性磷酸酶标记物工作液(第二次反应)，形成磁珠-髓过氧化物酶抗原-抗髓过氧化物酶抗体-羊抗人IgG抗体-碱性磷酸酶的免疫复合物，随后经过磁性分离，第二次洗涤未结合的物质，向免疫复合物中加入发光底物液在波长470nm检测发光值(RLU)，通过与标准曲线比对，从而确定待测样品中抗髓过氧化物酶抗体的含量。
2.试剂盒工作浓度优化
设置磁珠工作液浓度为0.1、0.2、0.3mg/mL，碱性磷酸酶标记物浓度为0.5、1、2μg/mL，使用方阵滴定法(棋盘滴定法)进行优化，试验结果如下表14，其中R1为磁珠包被物工作液(mg/mL)；R2羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记物工作液浓度(μg/mL)。
表18试剂盒工作浓度优化表
从上表18可知，磁珠包被物工作浓度为0.1mg/mL、碱性磷酸酶标记物工作浓度为1μg/mL时，信噪比最高。最终选择磁珠包被物工作浓度为0.1mg/mL、碱性磷酸酶标记物工作浓度为1μg/mL。
3.加样量优化
(1)R1磁珠包被物工作液加样量优化
用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、70μL的R1磁珠包被物工作液试剂加样量进行试验，保持R2反应缓冲液加样量为50μL，R2碱性磷酸酶标记物溶液加样量为50μL，样本加样量为30μL。试验结果如下：
表19R1磁珠包被物工作液加样量优化
从上表19可知，以50μL磁珠包被物工作液的信噪比最好。因此确定本实施例R1磁珠包被物工作液加样量为50μL。
(2)MPO反应缓冲液加样量优化
用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、70μL的MPO反应缓冲液加样量进行试验，保持R1磁珠包被物工作液加样量为50μL，R2碱性磷酸酶标记物工作液加样量为50μL，样本加样量为30μL。试验结果如下表21：
表20MPO反应缓冲液加样量优化
从上表20可知，以50μL MPO反应缓冲液的信噪比最好。因此确定本实施例MPO反应缓冲液加样量为50μL。
(3)R2碱性磷酸酶工作液加样量优化
用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、100μL的R2碱性磷酸酶标记物工作液加样量进行试验，保持磁珠工作液加样量为50μL，MPO反应缓冲液加样量为50μL，样本加样量为30μL。试验结果如下：
表21R2碱性磷酸酶工作液加样量优化表
从上表21可知，以100μL R2碱性磷酸酶标记物工作液的信噪比最好。因此确定实施例中R2碱性磷酸酶工作液加样量为100μL。
(4)样本加样量优化
用高、中、低三个浓度的血清样本分别以20、30、40、50、60、70μL的样本加样量进行试验，保持磁珠工作液、MPO反应缓冲液及碱性磷酸酶标定物溶液加样量不变。试验结果如下表22：
表22样本加样量优化表
从上表22可知，以30μL加样量的信噪比最好。因此确定实施例样本加样量为30μL。
(5)样本稀释比例优化
将高、中、低三个浓度的血清样本分别以10、20、40、60倍数稀释进行试验。试验结果如下表23：
表23样本稀释比例优化
从上表23可知，样本稀释40倍的信噪比最好。因此确定本实施例样本稀释倍数为40倍。
4.反应条件优化
(1)第一步反应时间优化
设置不同第一步反应时间，保持第二步反应时间不变为5min进行试验，结果如下表24：
表24第一步反应时间优化
/>
从上表24可知，反应时间为10min时，信噪比最好。最终确定实施例第一步反应时间为10min。
(2)第二步反应时间优化
设置不同第二步反应时间，保持第一步反应时间不变为10min进行试验，结果如下表25：
表25第二步反应时间优化
/>
从上表25可知，反应时间为5min时，信噪比最好。最终确定本实施例第二步反应时间为5min。
(3)第一步反应洗涤次数优化
双抗夹心法理论上一般采用两步两清洗反应模式，因此通过测试第一步反应不同洗涤次数的信噪比、CV，选取合适的洗涤次数。试验结果如下表26：
表26第一步反应洗涤次数优化
从上表26可知，第一步反应后洗涤3次的信噪比S/N更高，CV更好。因此本实施例中第一步反应后洗涤次数为3次。
(4)第二步反应洗涤次数优化
一般采用两步两清洗反应模式，因此通过测试第一步反应不同洗涤次数的信噪比、CV，选取合适的洗涤次数。试验结果如下表28：
表27第二步反应洗涤次数优化表
从上表27可知，第二步反应后3次洗涤的信噪比S/N更高，CV更好。因此确定本实施例中第二步反应后洗涤次数为3次。
根据上述实验结果优化，本实施例的一种抗髓过氧化物酶抗体试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)第一步反应：在25-30℃的环境温度下，将血液样本用样本稀释液稀释40倍得样本溶液，进行第一步反应。第一步反应检测体系中，稀释后样本加样量30μL、R1磁珠包被物工作液加样量为50μL，MPO反应缓冲液加样量为50μL。第一步反应时间为10min，磁分离收集磁珠后进行第一次洗涤，洗涤次数为3次。
(2)第二步反应：在25-30℃的环境温度下，向上述体系中加入R2碱性磷酸酶工作液进行孵育，加样量为100μL，第二步反应时间为5min，磁分离收集磁珠后进行第二次洗涤，洗涤次数为3次。
(3)将所述酶标免疫复合物加入100μL化学发光底物液中反应5min，在波长470nm下检测得到样本发光值；所述化学发光底物为AMPPD。
(4)将校准品采用冻干稀释液稀释后，采用校准品复溶液复溶，然后加入化学发光底物液中反应并检测发光值，根据校准品的浓度以及发光值绘制标准曲线，将所述样本发光值代入所述标准曲线得到待测样本中的抗髓过氧化物酶抗体的含量。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒，其特征在于，包括R1磁珠包被物工作液和R2碱性磷酸酶标记物工作液；所述R1磁珠包被物工作液中抗原浓度为0.1-1.2μg/mL。
2.如权利要求1所述一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒，其特征在于，所述R1磁珠包被物工作液含有髓过氧化物酶抗原-磁珠包被物，浓度为0.1-0.3mg/mL；所述R1磁珠包被工作液含髓过氧化物酶抗原-磁珠包被物；所述磁珠与髓过氧化物酶抗原的包被质量比为1：(0.001-0.004)。
3.如权利要求1所述一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒，特征在于，所述R2碱性磷酸酶标记物工作液包括羊抗人IgG抗体-碱性磷酸酶标记物；所述R2碱性磷酸酶标记物工作液中羊抗人IgG抗体-碱性磷酸酶标记物浓度为0.5-2.0μg/mL。
4.如权利要求1所述一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒，特征在于，所述抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒还包括R3 MPO反应缓冲液校准品、校准品复融液、化学发光底物液和MPO反应缓冲液；
所述R3 MPO反应缓冲液为PBS溶液、Hepes溶液和Tris溶液中的至少一种，且所述MPO反应缓冲液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述MPO反应缓冲液的浓度为0.03-0.08M，pH值为7.1-7.3。
5.权利要求1-4任一项所述的一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将磁珠和髓过氧化物酶抗原进行包被结合，封闭清洗后在加入磁珠包被物稀释液，得到R1磁珠包被物工作液；
S2、将碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记结合并超滤纯化，然后加入碱性磷酸酶标记物稀释液进行稀释，稀释得到R2碱性磷酸酶标记物工作液；
S3、将所述R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、R3 MPO反应缓冲液、化学发光底物液、校准品和校准品复融液进行组装，得到抗髓过氧化物酶测定试剂盒。
6.如权利要求5所述一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述磁珠和髓过氧化物酶抗原包被时间为1-6h；结合缓冲液为0.05-0.15M MES缓冲液，pH为5.0-6.0；磁珠和封闭液的比例为磁珠：封闭液＝1mg：(0.05-0.2)mL；所述封闭液为1-3％BSA溶液，所述封闭时间为0.5-2h。
7.如权利要求5所述一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述碱性磷酸酶结合缓冲液pH为6.5-7.3，所述碱性磷酸酶和羊抗人IgG抗体碱性磷酸酶标记结合时间为30-120min；所述超滤次数为4-8次；所述羊抗人IgG抗体和碱性磷酸酶结合的质量比为1：(0.5-5)；
所述碱性磷酸酶标记物稀释液为MES溶液、Tris溶液和TES溶液中的一种，且所述碱性磷酸酶标记物稀释液中包括以质量百分比计：0.8-1.5％BSA、0.08-0.15％Tween 20、0.3-0.8％Proclin 300，所述碱性磷酸酶标记物稀释液浓度为0.03-0.08M，pH值为6.4-7.6。
8.如权利要求5所述的一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括校准品的冻干处理步骤，所述冻干处理步骤的冻干程序如下：
冷冻阶段：冷冻温度-60～-40℃，持续10-12h，然后以4-6℃/h的速率升温至主干燥阶段；
主干燥阶段：冷冻温度-35～-0℃，持续10-15h，然后以0.7-10℃/h的速率升温至次干燥阶段；
次干燥阶段：冷冻温度0～20℃，持续1-4h，然后以3-10℃/h的速率升温至完全干燥阶段；
完全干燥阶段：冷冻温度25～30℃，持续2-5h。
9.权利要求1-4任一项所述的一种非诊断和治疗目的抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将待测样品稀释后与R1磁珠包被物工作液、R3 MPO反应缓冲液进行孵育结合，第一次洗涤后加入R2碱性磷酸酶标记物工作液进行标记结合，磁分离并进行第二次洗涤，得到抗髓过氧化物酶抗体免疫复合物；
步骤2、将所述抗髓过氧化物酶抗体免疫复合物加入化学发光底物液中反应，检测RLU发光值；
步骤3、将RLU发光值与校准品构建的发光值标准曲线进行匹配，得到待测样本中的抗髓过氧化物酶抗体的含量。
10.如权利要求9所述的一种非诊断和治疗目的抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒的检测方法，其特征在于，所述待测样品的稀释倍数为10-60倍；
所述稀释后的待测样品、R1磁珠包被物工作液、R2碱性磷酸酶标记物工作液、MPO反应缓冲液、化学发光底物液的加入体积比为(20-100)：(20-70)：(20-100)：(20-70)：(100-300)；
所述步骤1中，孵育结合时间为5-15min，第一次洗涤次数为1-5次；标记结合时间为2.5-10min，第二次洗涤次数为1-5次；所述步骤2中，底物反应时间为2.5-10min。
CN202311103692.8A 2023-08-30 2023-08-30 一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用 Pending CN117031041A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311103692.8A CN117031041A (zh) 2023-08-30 2023-08-30 一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311103692.8A CN117031041A (zh) 2023-08-30 2023-08-30 一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117031041A true CN117031041A (zh) 2023-11-10

Family

ID=88631691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311103692.8A Pending CN117031041A (zh) 2023-08-30 2023-08-30 一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117031041A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK160108C (da) Fremgangsmåde og udstyr til direkte eller indirekte påvisning af reaktion mellem et specifikt bindingsmiddel og den tilsvarende acceptorsubstans
US5051356A (en) Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use
CN108445230B (zh) 基于纳米抗体的降钙素原化学发光检测试剂及检测方法
CN112014577B (zh) 一种提高gpc3检测灵敏度的试剂盒及其制备方法
CN101368953A (zh) 一种环丙沙星的化学发光酶联免疫检测试剂盒
CN113150133B (zh) 针对SARS-CoV-2的单克隆抗体或其抗原结合片段
CN117031041A (zh) 一种抗髓过氧化物酶抗体测定试剂盒及其制备方法和应用
CN110988325A (zh) 封闭剂及包含该封闭剂的试剂盒
KR20010025027A (ko) 면역측정시약 및 면역측정법
CN105974128A (zh) 一种人中性粒细胞载脂蛋白同源二聚体的定量装置
CN110045130A (zh) 一种与IgA肾病相关的多肽的免疫分析检测试剂盒
CN117192102A (zh) 一种抗蛋白酶3抗体测定试剂盒及其制备方法和应用
CN113238055A (zh) 空间邻近化学发光法检测降钙素原的试剂盒及其检测方法和应用
CN101101295B (zh) 酶联免疫体外诊断试剂中酶结合物溶液的制备
CN112129933B (zh) 一种免疫分析系统中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法
CN117192105A (zh) 一种抗核小体抗体IgG测定试剂盒及其制备方法和检测方法
CN105974127A (zh) 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置
CN117269504A (zh) 一种抗dsDNA IgG抗体测定试剂盒及其检测方法和制备方法
CN206002549U (zh) 一种基于酶联免疫吸附技术的人中性粒细胞载脂蛋白异源二聚体定量装置
CN112142756A (zh) 黄曲霉毒素m1半抗原与全抗原制备及其快速转移定量试剂盒制备与应用
CN117169509A (zh) 一种类风湿因子及其亚型的测定试剂盒及其制备方法和检测方法
US6251584B1 (en) Specific binding assays using methyl orange
CN109917124A (zh) 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒
CN117471085A (zh) 一种抗环瓜氨酸肽抗体测定试剂盒及其检测方法和制备方法
CN112834751B (zh) 一种家用型检测芝麻过敏原的高灵敏试剂盒、其检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination