CN117025782A - 影响鸡肉色性状的主效基因、分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鸡肉品质遗传改良技术领域，尤其涉及影响鸡肉色性状的主效基因、分子标记及其应用。本发明提供鸡肉色主效基因PPP1CC、与鸡肉色相关的分子标记rs314814054，rs734470897和rs738107044，为实现胸肌肉色的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及鸡肉品质遗传改良技术领域，尤其涉及影响鸡肉色性状的主效基因、分子标记及其应用。
背景技术
鸡肉是世界第一大肉类产品和消费品，其中白羽肉鸡贡献了全球鸡肉总量的70％，具有料重比低、生长速度快、生产效率高等显著优势，在保障肉类供应、粮食安全乃至经济发展和社会稳定方面发挥重要作用。
随着生活水平的增加，消费者对肉品质的要求越来越高。肉色作为重要的肉品质指标之一，直接影响消费者购买意愿，同时影响滴水损失等产肉效率。肉色常用感官评定或色差计测定，如CIE系统中L*值表示亮度(Lightness)，a*值表示红度(Redness)，b*值表示黄度(Yellowness)。
肉色主要由肌肉中色素含量决定，包括红色素和黄色素。肌红蛋白(myoglobin,Mb)和血红蛋白(haemoglobin,Hb)等红色素及其存在状态与肉色深浅密切相关。肉色还受到肌肉中自由水量、肌肉pH值的影响，这也是导致类PSE肉与正常胸肉颜色差异的原因。宰后糖酵解加速使类PSE肉的pH值下降，肌原纤维粗丝与细丝间的水分流失，大量水存在于胞外空间，形成更开放的结构，光的散射增加，肉色苍白(肉色L*值较高)。
快长型肉鸡品种通常存在类PSE的问题，给产业经济带来较大损失。国际上对家禽类PSE肉的判定普遍应用的指标是肉色L*值。一般肉鸡胸肌L*值变化范围大，介于45到67之间。Barbut等人将L*值＞50作为划分类PSE肉的临界值，也有研究将L*值＞54或L*值＞56(PETRACCI et al.,2004)作为判定标准。
SNP(Single Nucleotide Polymorphism)作为第三代遗传标记与其他分子标记相比具有较大的优越性：SNP数量多，分布广泛；SNP适于快速、规模化筛查；SNP等位基因频率的容易估计；易于基因分型。随着育种技术的发展，利用分子标记进行辅助选择成为对屠宰后肉品质性状进行选择的理想方法之一，可以实现目标性状的早期选择，实现与性状相关等位基因的快速纯合，即可提高新品系选育的准确性，又可以提高配套制种的效率。
现有技术中，缺少一种利用SNP分子标记判断鸡胸肌肉色的方案。
发明内容
本发明提供影响鸡肉色性状的主效基因、分子标记及其应用。
本发明提供PPP1CC蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控鸡肉肉色和/或肌纤维含量中的应用。
优选的，所述肌纤维包括快肌肌纤维和慢肌肌纤维。
所述PPP1CC蛋白具有以下任意一种氨基酸序列(>NP_001006190 length＝323)：
1)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
根据所述应用，PPP1CC蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列(>galGal6_refGene_NM_001006190 range＝chr15:6295886-6311096)：
(1)所述核苷酸序列由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7顺序连接组成，其第1-8800bp为SEQ ID NO.6，第8801——15211bp为SEQ ID NO.7；
(2)由(1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；
(3)在严格条件下可以与(1)所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
本发明提供与鸡肉肉色性状相关的SNP分子标记，通过影响PPP1CC蛋白或其编码基因调控肉色。
本发明提供与鸡肉肉色性状相关的SNP分子标记，所述分子标记为rs314814054，rs734470897和rs738107044中的任一个或几个。
优选的，分子标记rs314814054含有鸡15号染色体上第6,303,700bp处多态性为G/T的核苷酸序列。
优选的，分子标记rs734470897含有鸡15号染色体上第6,303,745bp处多态性为T/C的核苷酸序列。
优选的，分子标记rs738107044含有鸡15号染色体上第6,303,794bp处多态性为G/A的核苷酸序列。
以上分子标记的物理位置参考基因组GRCg6a版本。
本发明提供用于扩增所述SNP分子标记的引物。
优选的，所述引物选自SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4至少一种。
优选的，本发明中，扩增分子标记rs314814054的引物如SEQ ID NO.1-2所示。
优选的，扩增分子标记rs734470897的引物如SEQ ID NO.1-2所示。
优选的，扩增分子标记rs738107044的引物如SEQ ID NO.3-4所示。
本发明提供一种试剂或试剂盒，包括所述引物。
根据所述应用、或所述SNP分子标记，所述肉色包括肉色亮度、红度中的至少一种。
优选的，所述肉色是指鸡胸肌肉。
优选的，所述鸡胸肌肉色性状指CIELab颜色系统肉色亮度值L*或红度值a*。肉色L*值反应鸡肉的亮度，a*值反应鸡肉的红度，是衡量肉品质的重要指标，二者之间呈强的负相关。
本发明提供所述分子标记、所述引物、所述试剂或所述试剂盒在以下任一项中的应用：
(1)在鉴定鸡肉色相关性状表型中的应用。
(2)在鸡肉色相关性状早期预测中的应用。
(3)在鸡资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用。
(4)判断类PSE肉中的应用。
优选的，所述鸡肉为鸡胸肌肉。
优选的，鸡分子标记辅助育种方法包括：
(1)提取待测鸡总DNA；
(2)以DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物，判断鸡遗传潜质，留种、繁种。该方法可以筛选出优质鸡。
优选的，步骤(3)包括：对扩增产物进行等位基因检测，根据基因分型结果判定如下：
分子标记rs314814054所含多态性位点的基因型为GG，判断待测鸡的胸肌肉色具有低L*和高a*水平；
分子标记rs734470897所含多态性位点的基因型为TT，判断待测鸡的胸肌肉色具有低L*和高a*水平；
分子标记rs738107044所含多态性位点的基因型为GG，判断待测鸡的胸肌肉色具有低L*和高a*水平。
本发明提供所述分子标记或所述引物在鉴别鸡肉色基因型中的应用。
本发明提供一种判断鸡胸肌肉色的方法，分子标记rs314814054所含多态性位点的基因型为GG，判断待测鸡的胸肌肉色具有低亮度和高红度水平。
和/或，分子标记rs734470897所含多态性位点的基因型为TT，判断待测鸡的胸肌肉色具有低亮度和高红度水平。
和/或，分子标记rs738107044所含多态性位点的基因型为GG，判断待测鸡的胸肌肉色具有低亮度和高红度水平。
优选的，本发明中，分子标记rs314814054所含多态性位点的基因型为GG，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低L*和高a*水平，所含多态性位点的基因型为GT，对应于待测鸡的胸肌肉色具有L*和a*水平居中，所含多态性位点的基因型为TT，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高L*和低a*水平；
分子标记rs734470897所含多态性位点的基因型为TT，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低L*和高a*水平，所含多态性位点的基因型为TC，对应于待测鸡的胸肌肉色的L*和a*水平居中，所含多态性位点的基因型为CC，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高L*和低a*水平；
分子标记rs738107044所含多态性位点的基因型为GG，对应于待测鸡的胸肌肉色具有低L*和高a*水平，所含多态性位点的基因型为GA，对应于待测鸡的胸肌肉色的L*和a*水平居中，所含多态性位点的基因型为AA，对应于待测鸡的胸肌肉色具有高L*和低a*水平。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供肉色主效基因PPP1CC、分子标记及其检测试剂盒。
本发明采用鸡胸肌肉色L*和肉色a*双性状改良分子育种技术，涉及整合利用显著SNP分子标记的基因组选择方法，可同时改良两个肉色指标。通过本发明选育的种系，可降低肉色L*，提高肉色a*，对肉鸡的生产具有重大的指导意义。
针对育种和生产实践需求，本发明使用快速型白羽肉鸡为代表性素材，通过全基因选择性信号分析以及数量性状基因组分析定位与肉色表型相关的候选区域，通过肉色表型和全基因组SNP测定，筛选并获得显著影响鸡肉色的主效基因和SNP标记。为实现胸肌肉色的早期选择和性状相关等位基因的快速纯和，加快遗传选择进展提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。
图1为本发明实施例1GWAS结果的曼哈顿图和QQ图。
图2为本发明实施例2PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠肉色和肌纤维组成指标的变化图；
(A)PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠构建示意图；
(B)PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠和对照小鼠后肢肌肉PPP1CC mRNA的相对表达量(n＝10:10)；
(C)PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠和对照组后肢肌肉L*24h(n＝9:8)；
(D)PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠和对照组上肢肌红蛋白含量(n＝10:10)；
(E)PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠与对照组股四头肌慢肌纤维比值(n＝5:5；比例尺＝40μm)；
(F)PPP1CC骨骼肌特异性敲除和对照组后肢肌肉肌原纤维ATP酶染色结果，标尺＝200μm；
其中，所有表型和检测的样本均来自9周龄的小鼠，这些小鼠在6周龄时注射了他莫昔芬5天用于在骨骼肌中诱导敲除PPP1CC。
图3为本发明实施例3鸡胸肌肉色相关性状L*，a*影响数据图；其中，W为野生型，H为杂合型，M为突变型；*P<0.05,**P<0.01,**P<0.001。
图4为本发明rs314814054的基因分型图。
图5为本发明rs734470897的基因分型图。
图6为本发明rs738107044的基因分型图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
本发明的分子标记详细信息见表1，引物信息见表2。
表1
| Ensembl公共数据库中rs编号 | GGA | 位置(bp) | 等位基因 |
| rs314814054 | 15 | 6,303,700 | G/T |
| rs734470897 | 15 | 6,303,745 | T/C |
| rs738107044 | 15 | 6,303,794 | G/A |
具体包括，鸡15号染色体(GGA15)6,303,657位置上的A/G突变、鸡15号染色体(GGA15)6,303,700位置上的T/A突变、鸡15号染色体(GGA1)6,303,745位置上的C/G突变、鸡15号染色体(GGA1)6,303,794位置上的G/A突变。
SNP位点rs314814054，rs734470897和rs738107044的基因分型图分别参见图4至图6。
表2引物信息
上述分子标记位点基因型的检测，可以待测鸡的基因组为模板，利用表2中的引物进行PCR扩增后，采用直接测序法或其他有效方式对扩增产物进行等位基因检测测序。
肉色的分子标记研发难度在于性状的复杂性，因为肉色受到营养和饲养环境等外部因素影响较大，所以需要大样本的测定和关联等分析后才能有望确定有效的分子标记。本发明利用了大样本的测定和关联等分析才确定了分子标记。
实施例1与鸡胸肌肉色相关的数量性状基因座标记的确定
1、全基因组关联分析(GWAS)与表达数量性状基因组(eQTL)共定位，获得包括PPP1CC在内的QTL区域
1)实验动物与目标性状测定
对230只G7世代白羽肉鸡测定肉色性状。肌肉肉色采用CR-0色彩色差计(柯尼卡美能达公司，日本)测定。参照《NY/T 2793-2015肉的食用品质客观评价方法》的附录B.3，规范测量并分别记录肉样的亮度值(L*)、红度值(a*)、黄度值(b*)。测定时间为宰后15分钟和24小时新鲜肉样。所有表型值，以平均值加减3倍标准差进行质量控制。结果见表1。
表1肉色表型性状的描述性统计分析
对230只白羽肉鸡的9,760,228个常染色体变异的GWAS分析发现，GGA15中胸大肌L*和a*值的QTL位点为3.99kb:6299.84-6303.82kb，在PPP1CC基因周围含有8个全基因组显著的L*15min SNP和14个显著的a*15min SNP。GWAS结果的曼哈顿图和QQ图如图1所示。进行eQTL分析，检测到145个全基因组显著SNP，这些SNP聚集在Chr15:6281.19-6530.58kb区域附近。区域关联分析表明，两个区域的重叠为GGA15:6299.84-6303.824kb，仅包含PPP1CC。
实施例2：利用PPP1CC骨骼肌特异性敲除小鼠中验证肉色和肌纤维类型的变化。
使用Cre/loxP系统在基因型为PPP1CC(fl/fl；ACTA1-creER(Tg))的敲除小鼠和基因型为PPP1CC(fl/fl；ACTA1-creER(0))的对照小鼠中构建PPP1CC的骨骼肌特异性敲除(PPP1CC-SSKO)(图2中A)。在6周龄时连续注射他莫昔芬5天，以激活骨骼肌中的ACTA1-Cre酶，并在9周龄时收集表型和样本。PPP1CC-SSKO小鼠的PPP1CC mRNA表达在9周龄时是对照水平的13.35％(P<0.0001)(图2中B)。这表明，他莫昔芬诱导的PPP1CC敲除是成功的。从表型方面看，PPP1CC-SSKO小鼠的后肢肌肉显示出较高的L*24h(P<0.01)，上肢肌肉显示出肌红蛋白含量下降。(图2中C，D，E)。肌球蛋白ATP酶染色分析结果显示，PPP1CC-SSKO小鼠股四头肌的快肌(Ⅱ型)肌纤维更丰富(P<0.01)，而对照组的股四头肌则含有更多的慢肌(I型)纤维(图2中F，G)。
实施例3：进一步检验标记对白羽肉鸡B系肉色L*，a*性状的影响
本实施例在实施例1的研究基础上，进一步统计显著QTL区域(GGA15:6299.84-6303.824kb)对于230只白羽肉鸡B系(来自于新广农牧育种场)胸肌肉色相关性状L*，a*影响数据(平均值±标准误差)，结果见图3。
本实施例中，以鸡DNA为模板，采用表2中引物和PCR反应进行扩增，采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序，对SNP位点基因型进行分型。
从图3中可知，分子标记QTL区域与PPP1CC mRNA，L*15min，a*15min，表达量的关联性佳，并且不同基因型类PSE肉发生率明显差异，突变型预测类PSE发生率达31.03％，而野生型预测类PSE发生率仅为4.17％。
实施例4：利用本发明的SNP分子标记辅助选择改良肉色的育种方法
1、待选择群体
挑选待检测种鸡500只以上，于20日龄左右翅静脉采血，加入抗凝剂，-20℃保存备用。
2、DNA提取
采用常规酚仿或试剂盒等常用方法提取基因组DNA,溶于TE缓冲液中，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法双重检测DNA的纯度和浓度,然后稀释至浓度50ng/μl。
3、PCR反应及序列测定
采用表2中任一引物和PCR反应进行扩增，PCR反应程序为：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30个循环；72℃5min。PCR反应体系以25μl计为：模板DNA 10pg-1μg，上游引物0.1-1μl，下游引物0.1-1μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl，ddH2O补至25μl。
采用直接测序法测序，对SNP位点rs314814054，rs734470897，rs738107044位点基因型进行分型。采用直接测序法对扩增产物进行等位基因测序。
根据基因分型结果选留满足rs314814054为GG、rs734470897位点为TT基因型、rs738107044位点为GG基因型中任意一项的健康公母鸡，为胸肌肉色红度偏高，亮度偏低的鸡。
根据以上基因分型选留的鸡与实际鸡胸肌肉肉色完全一致，说明本发明SNP分子标记辅助选择改良肉色的育种方法可靠。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.PPP1CC蛋白或其编码基因、或含有其编码基因的生物材料在调控鸡肉肉色和/或肌纤维含量中的应用；
所述PPP1CC蛋白具有以下任意一种氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，PPP1CC蛋白的编码基因具有以下任一种核苷酸序列：
(1)所述核苷酸序列由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7顺序连接组成，其第1-8800bp为SEQID NO.6，第8801——15211bp为SEQ ID NO.7；
(2)由(1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；
(3)在严格条件下可以与(1)所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。
3.与鸡肉肉色性状相关的SNP分子标记，其特征在于，通过影响PPP1CC蛋白或其编码基因调控肉色。
4.与鸡肉肉色性状相关的SNP分子标记，其特征在于，所述分子标记为rs314814054，rs734470897和rs738107044中的任一个或几个；
优选的，分子标记rs314814054含有鸡15号染色体上第6,303,700bp处多态性为G/T的核苷酸序列；
分子标记rs734470897含有鸡15号染色体上第6,303,745bp处多态性为T/C的核苷酸序列；
分子标记rs738107044含有鸡15号染色体上第6,303,794bp处多态性为G/A的核苷酸序列。
5.用于扩增权利要求3-4任一项SNP分子标记的引物；
优选的，所述引物选自SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4至少一种。
6.一种试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述引物。
7.根据权利要求1-2任一种所述应用、或权利要求3-4任一项所述SNP分子标记，其特征在于，所述肉色包括肉色亮度、红度中的至少一种。
8.权利要求3-4任一项所述分子标记、权利要求5所述引物、权利要求6所述试剂或试剂盒在以下任一项中的应用：
(1)在鉴定鸡肉色相关性状表型中的应用；
(2)在鸡肉色相关性状早期预测中的应用；
(3)在鸡资源鉴定、改良或分子标记辅助育种中的应用；
(4)判断类PSE肉中的应用；
优选的，所述鸡肉为鸡胸肌肉；
优选的，鸡分子标记辅助育种方法包括：
(1)提取待测鸡总DNA；
(2)以DNA为模板，利用权利要求5-6任一项所述引物进行PCR扩增；
(3)分析PCR扩增产物，判断鸡遗传潜质，留种、繁种。
9.权利要求3-4任一项所述分子标记或权利要求5-6任一项所述引物在鉴别鸡肉色基因型中的应用。
10.一种判断鸡胸肌肉色的方法，其特征在于，分子标记rs314814054所含多态性位点的基因型为GG，判断待测鸡的胸肌肉色具有低亮度和高红度水平；
和/或，分子标记rs734470897所含多态性位点的基因型为TT，判断待测鸡的胸肌肉色具有低亮度和高红度水平；
和/或，分子标记rs738107044所含多态性位点的基因型为GG，判断待测鸡的胸肌肉色具有低亮度和高红度水平。
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