CN117025554A - 一种慢病毒的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种慢病毒的制备方法，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。本申请还公开上述的制备方法在慢病毒包装中的应用。
Description
技术领域
本说明书涉及生物技术领域，特别涉及一种慢病毒的制备方法及其应用。
背景技术
慢病毒作为一种特殊的逆转录病毒，与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点，并已经应用于多种疾病的基因治疗研究中。
慢病毒载体是一种以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础的基因治疗载体，慢病毒包装系统目前已经过三代的更迭，优化至四质粒系统，有效提高了慢病毒的生物安全性。其主要的四质粒系统包括Gag-Pol基因、ReV基因、VSV-G包膜基因以及载体质粒。前三种为辅助质粒，载体质粒也被称作主质粒。病毒滴度(TU)为病毒的毒力或毒价，其是判定病毒转染效果的主要参考值之一。三种辅助质粒通过不同比例混合，对转染后病毒滴度会产生较大影响。现有的慢病毒转导技术并未对三种辅助质粒的配比进行过多的工艺开发，导致其转染滴度不高。
发明内容
本申请提供一种慢病毒的制备方法，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％ CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。
本申请还提供上述的制备方法在慢病毒包装中的应用。
本说明书提出的慢病毒制备方法，带来的有益效果包括但不限于：(1)降低质粒的用量，优化包装比例，提高病毒出毒量，同时降低物料成本；(2)使用本申请提供的慢病毒制备方法，包装的慢病毒滴度高(≥1E+09TU/ml)，杂质水平低。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的pLVX-Puro载体图谱。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
本申请提供一种慢病毒的制备方法，包括：a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％ CO2摇床培养48h；c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与有待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。
在一些实施例中，所述转染试剂可以为聚阳离子类转染试剂。在一些实施例中，优选的，所述转染试剂可以为聚乙烯亚胺。在一些实施例中，更优选的，所述转染试剂可以为聚乙烯亚胺25000。在一些实施例中，进一步优选的，所述转染试剂可以为聚乙烯亚胺25000的水溶液。在一些实施例中，所述转染试剂的溶度可以为0.8～1.2μg/μL。在一些实施例中，优选的，所述转染试剂的溶度可以为1μg/μL。
在一些实施例中，所述质粒可以包括包装质粒和慢病毒表达载体质粒。在一些实施例中，所述包装质粒可以包括pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒可以为pLVX-CD19 CAR。
在一些实施例中，所述转染试剂工作液可以为转染试剂的Dynamis培养基溶液。在一些实施例中，所述质粒工作液可以为质粒的Dynamis培养基溶液。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为150～210：95～225。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为160～200：105～215。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为165～195：115～205。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为170～190：125～195。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为175～185：135～185。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为175～185：145～175。在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比可以为175～185：155～165。
在一些实施例中，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为160：225。
在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为35～160：10～35：10～25：15～25。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为45～150：12～32：12～22：16～24。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为55～140：14～30：14～20：17～23。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为60～130：16～28：16～18：18～22。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为70～120：18～26：16～18：19～21。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为80～110：20～24：16～18：19～21。在一些实施例中，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为90～100：21～23：16～18：19～21。
在一些实施例中，优选的，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比可以为160：35：15：15。
在一些实施例中，转染混合液与HEK293T细胞悬液的体积比可以为1：10。
在一些实施例中，步骤b中，摇床培养6h时可以加入补料培养基和200mM谷氨酰胺溶液。
在一些实施例中，所述补料培养基的加入量可以为HEK293T细胞悬液体积的20％。在一些实施例中，所述200mM谷氨酰胺溶液的加入量可以为HEK293T细胞悬液体积的2％。
在一些实施例中，所述补料培养基可以为OPM-CHO PFF06。
本申请还提供上述的制备方法在慢病毒包装中的应用。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
(1)配制1mg/ml PEI溶液
取100mg PEI粉末，加入到90mL无菌水中；
搅拌，加热(60-80℃)助溶；
溶解完全后，冷却至室温，用NaOH溶液调pH至6.9-7.1；
定容至100mL，0.22微米滤膜过滤除菌；
分装，-20℃保存。
(2)慢病毒表达载体构建
合成ScFV基因(SEQ ID NO 1)和2代CAR结构基因(SEQ ID NO 2)，两条基因通过重叠PCR进行拼接，得到CD19 CAR基因(SEQ ID NO 3)。
SEQ ID NO 1：
SEQ ID NO 2：
CD19 CAR基因(SEQ ID NO 3)：
通过分子克隆的方法构建以CD19为靶点的慢病毒表达载体pLVX-CD19 CAR，pLVX-Puro载体信息如图1所示，包装质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev以及表达质粒pLVX-CD19 CAR大量抽提。pMD2.G分子量为5822bp，pMDLg/pRRE分子量为8890bp，pRSV-Rev分子量为4180bp。
(2)293TSM细胞复苏
取1支50ml离心管，向离心管中加入预热好的9ml Dynamis基础培养基。从细胞库用预冷的降温盒或干冰快速领取冻存细胞，快速传递到细胞培养间，将冻存管放入已经预热到37℃的水浴锅中迅速解冻，待冻存管内的细胞冻存液融化(不超过2分钟)，从水浴锅中取出。
用75％乙醇消毒冻存管表面，迅速将冻存管中的细胞吸到含有9ml的Dynamis基础培养基的50ml的离心管中。将细胞悬液离心(160g，常温，5分钟)，弃上清，按20ml/支细胞添加Dynamis基础培养基对复苏细胞进行重悬。
按6mM终浓度分别添加200mM谷氨酰胺溶液到3支离心管中，摇匀取样计数。
若细胞悬液计数满足活率大于80％，活细胞密度在(0.2～0.6)×106cells/ml范围内可继续下一步。在培养瓶上写上培养批号，将培养瓶置于二氧化碳摇床中震荡培养3天，培养条件为37℃、8％ CO2转速130rpm±10rpm。
(3)细胞传代
复苏培养3天后，将待传代摇瓶从二氧化碳培养箱中取出，放入生物安全柜中，晃动摇瓶使悬液均匀，取出约0.5ml的细胞悬液用于细胞计数。
计数完成后按0.5×106cells/ml传代密度进行传代。根据计数结果和需传代的总体积计算所需细胞悬液的体积，按照所需的量将新鲜Dynamis基础培养基加入到合适的摇瓶中，加入所需体积的细胞悬液，按照终浓度6mM的浓度添加200mM谷氨酰胺溶液，轻轻摇晃摇瓶使细胞悬液均匀。将传代后的细胞放入二氧化碳培养箱中培养3天。培养条件为：37℃，8％ CO2，摇床转速130rpm±10rpm。
(4)细胞转导
取传代(第5代)的部分细胞进行慢病毒包装。按照此次的实验设计来配制9组DNA和PEI溶液。按照对应量添加对应试剂，加入后各自混匀，静置孵育5min。
将“PEI”管中的液体，缓慢加入“DNA”管中，摇晃混匀。混匀后静置孵育15min。孵育结束后将“PEI”和“DNA”混合后的溶液均匀加入至细胞培养液中，放入细胞培养液后摇晃混匀，放入摇床继续培养，37℃，8％ CO2，记录转染完成时间。
转染后6h补料，每瓶加入转染体积20％的补料培养基，和2％的200mM谷氨酰胺溶液。
(5)病毒收获
转染48h后进行收毒留样，使用现有技术检测p24、TU、HCP，检测结果如表1所示。
表1
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (10)
1.一种慢病毒的制备方法，其特征在于，包括：
a将转染试剂工作液与质粒工作液按体积比1:1混合，得到转染混合液；
b将转染混合液与HEK293T细胞悬液混合，37℃，8％CO2摇床培养48h；
c收集细胞上清，即为慢病毒溶液；
所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为150～210：95～225。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括：
所述转染试剂为聚阳离子类转染试剂，优选的，所述转染试剂为聚乙烯亚胺；更优选的，所述转染试剂为聚乙烯亚胺25000；进一步优选的，所述转染试剂为聚乙烯亚胺25000的水溶液；
和/或，所述转染混合液中转染试剂：质粒的质量比为160：225。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转染试剂的溶度为0.8～1.2μg/μL；优选的，所述转染试剂的溶度为1μg/μL；所述质粒包括包装质粒和慢病毒表达载体质粒，所述包装质粒包括pMD2.G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev；所述慢病毒表达载体质粒为pLVX-CD19CAR。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转染试剂工作液为转染试剂的Dynamis培养基溶液；所述质粒工作液为质粒的Dynamis培养基溶液；所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比为35～160：10～35：10～25：15～25。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体质粒：pMD2.G：pMDLg/pRRE：pRSV-Rev的质量比为160：35：15：15。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，转染混合液与HEK293T细胞悬液的体积比为1：10。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤b中，摇床培养6h时加入补料培养基和200mM谷氨酰胺溶液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述补料培养基的加入量为HEK293T细胞悬液体积的20％；所述200mM谷氨酰胺溶液的加入量为HEK293T细胞悬液体积的2％。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述补料培养基为OPM-CHO PFF06。
10.如权利要求1～9任一项所述的制备方法在慢病毒包装中的应用。
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