CN117017963A - 一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用。通过研究发现，所述绰奇烷二萜类化合物对寨卡病毒具有显著的抑制效果，并且细胞毒性较低，选择指数较好，非常适于应用在抗病毒药物的制备中。另外的，本发明所述绰奇烷二萜类化合物可以从来源较为丰富的海漆中提取得到，制备方法简单、成本低。

Description

一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus)于1947年首次在欧洲乌干达寨卡森林发现，它寄生于恒河猴体内，主要通过蚊虫叮咬传播，在全世界范围内均有传播。目前约有80％的寨卡病毒感染个体并没有表现出明显的临床症状，少数有临床症状的感染个体表现为发热、皮疹、关节痛、肌肉痛、头痛、呕吐和眼结膜炎，这些临床症状通常会持续1周以上且表现较为温和。但是最为令人担心的是，寨卡病毒能够经胎盘屏障由孕妇垂直传播给胎儿并给胎儿造成严重后果，如导致胎儿大脑结构异常，包括脑干和小脑发育不全、延迟髓鞘形成、脑室扩大、大脑薄壁组织严重钙化以及少数的无脑回症状等不可挽回后果(谌章舟,李津,谢铎源等.寨卡病毒研究进展[J].中国病毒病杂志,2016,6(05):391-397.DOI:10.16505/j.2095-0136.2016.05.014.)。
目前对于寨卡病毒尚无特效治疗方法，主要是通过提前预防(特别是疾病流行地区)蚊虫叮咬来避免感染。除此以外，疫苗和抗病毒药物的研发是2个预防和治疗寨卡病毒的较好方向，但是目前寨卡病毒疫苗还未研发出来；而对于抗病毒药的研发，现有技术也有相关的研发，如中国专利申请CN110859833A公开了一种化合物ZP10在制备以寨卡病毒蛋白酶为靶点的抗寨卡病毒药物中的应用，在与寨卡病毒蛋白酶的亲和力进行研究发现，化合物ZP10具有较高的抗寨卡病毒活性，其IC50为2.3μM，EC50为7.65μM，同时ZP10自身细胞毒性较低，与寨卡病毒蛋白酶有较高的亲和力以及在转录和翻译水平抑制寨卡病毒的复制进而具备显著的抗寨卡病毒效果，可用于制备预防或治疗寨卡病毒的药物。但该药物目前仅处于研究阶段，临床效果未知，因此，仍需提供更多抗寨卡病毒药物以供研究或临床使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有抗寨卡病毒药物较少的缺陷和不足，提供一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用，所述绰奇烷二萜类化合物具有式I结构：
绰奇烷二萜类化合物属于自然界比较稀少的一类二萜，本发明中的绰奇烷二萜类化合物与文献(Bioorg.Chem.,2020,104,104206.)中报道的化合物agallolide M结构一致，但其生物活性仍未有研究报道。
进一步地，所述病毒为寨卡病毒ZIKV SMGC-1(Zika virus SMGC-1strain)。
本发明通过研究发现，所述绰奇烷二萜类化合物对寨卡病毒具有显著的抑制活性，并且细胞毒性较低，选择指数较好。
本发明要求保护的绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用，但不限于，使用本发明的化合物的有效量对患者给药来制备用于预防或治疗病毒引发的疾病，减轻病毒引发的疾病症状或者延缓新病毒引发的疾病的发展或发作的药品的用途。
本发明要求保护的化合物新应用除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物，啮齿类，禽类动物等等。另外一些动物的实例包括马、狗、猫、猪等。
更进一步地，根据药学结构相似效果接近的原则，所述绰奇烷二萜类化合物还可以为其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体。
进一步地，所述绰奇烷二萜类化合物由海漆提取得到。红树林属于海陆过渡类型的生态系统，其独特的生态环境造就了红树植物次生代谢产物丰富的结构多样性和独特生物活性，使其成为新药先导化合物发现的重要宝库。本申请所述绰奇烷二萜类化合物提取自海漆，而海漆采集自海南文昌清澜港红树林湿地，海漆的次级代谢产物主要包括二萜、三萜、黄酮和单宁等，这些化合物表现出抗肿瘤、抗炎、抗HIV、抗氧化等活性。本发明绰奇烷二萜类化合物以海漆作为原料进行提取，来源广泛，成本低。
更进一步地，所述绰奇烷二萜类化合物的制备方法具体包括以下步骤：
S1、将海漆干燥粉碎，用乙醇提取，提取液用正己烷和乙酸乙酯进行萃取，收集正己烷萃取物；
S2、将步骤S1所得正己烷萃取物进行正相硅胶柱层析，以正己烷-丙酮作为洗脱液进行梯度洗脱，收集正己烷-丙酮体积比为5:1的流份；
S3、将步骤S2所得正己烷-丙酮体积比为5:1的流份进行ODS柱层析，以丙酮-水作为洗脱液进行梯度洗脱，得到丙酮体积分数为40％的组分；
S4、将步骤S3所得到丙酮体积分数为40％的组分经高效液相进行分离纯化，得到绰奇烷二萜类化合物。
更进一步地，步骤S1中，所述乙醇提取3～5次，过滤后合并滤液进行后续的萃取反应。
进一步地，步骤S2中，所述梯度洗脱为以正己烷-丙酮作为洗脱液，按照100:0到0:100，v/v进行梯度洗脱。优选地，所述洗脱梯度依次为100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1。
更进一步，步骤S3中，以丙酮-水作为洗脱液，依次以丙酮：水＝30:70，40:60，55:45，70:30，85:15，100:0为溶剂进行梯度洗脱。
进一步地，步骤S4中，所述高效液相的流动相为55％乙腈/水，流速为1～3mL/min，检测波长为195nm。
更进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。所述辅料根据要制备的剂型进行选择。
进一步地，所述药物为口服剂、注射剂、外用剂或吸入剂。
优选地，所述口服剂包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液等剂型。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用，通过研究发现，所述绰奇烷二萜类化合物对寨卡病毒具有显著的抑制效果，并且细胞毒性较低，选择指数较好，非常适于应用在抗病毒药物的制备中。另外的，本发明所述绰奇烷二萜类化合物可以从来源较为丰富的海漆中提取得到，制备方法简单、成本低。
附图说明
图1为本发明实施例1所得绰奇烷二萜类化合物I的氢谱图。
图2为本发明实施例1所得绰奇烷二萜类化合物I的碳谱图。
图3为本发明实施例1所得绰奇烷二萜类化合物I的质谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1一种绰奇烷二萜类化合物I的制备方法
所述绰奇烷二萜类化合物I的制备方法具体包括以下步骤：
S1、海漆样品采集：采集海漆茎皮和嫩枝条(采集自海南文昌清澜港红树林湿地)，晒干后共16kg；
S2、样品提取：将晒干后的样品粉碎，用工业乙醇浸泡提取，共5次，得到乙醇提取物；
S3、柱层析分离：将乙醇提取物分别用正己烷和乙酸乙酯进行萃取，分别得到正己烷和乙酸乙酯萃取物；将正己烷萃取物进行正相硅胶柱层析，洗脱剂为正己烷-丙酮溶剂(100:0--0:100，v/v)，依次进行梯度洗脱(100:0、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、0:1)，按每次约0.5L收集馏分，通过TLC检测合并相似流分，分成15个组分，即组分Fr.1～Fr.15；其中正己烷-丙酮(体积比5:1)的组分Fr.8(24g)进一步运用ODS柱层析，以丙酮：水＝30:70、40:60、55:45、70:30、85:15、100:0为溶剂进行梯度洗脱，依次得到6个组分(Fr.8-1～Fr.8-6)；
S4、单体化合物制备：将组分Fr.8-2经高效液相洗脱纯化，流动相为55％乙腈/水，流速3mL/min，检测波长为195nm，保留时间为25.5分钟，得到化合物I。
所述化合物I的结构如下所示：
实施例2绰奇烷二萜类化合物I的结构确认
对实施例1所得化合物进行氢谱、碳谱、质谱测定，结果参见图1～3。由结果可见，所得化合物的氢谱、碳谱、质谱数据与其结构式一一对应，可以确认其结构为式I结构。
实施例3绰奇烷二萜类化合物I抗塞卡病毒活性测试
1、细胞与病毒：
BHK(Baby Hamster Syrian Kidney)细胞，寨卡病毒ZIKV SMGC-1(Zika virusSMGC-1strain)，由军事医学研究院毒物药物研究所提供和保存。
2、主要试剂的配置：
2-1、含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基：将50ml胎牛血清(FBS)、双抗(含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)与500ml DMEM培养基充分混匀，即得。
2-2、含2％胎牛血清的DMEM高糖培养基(维持培养基)：将10ml胎牛血清(FBS)、双抗(含100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)与500ml DMEM培养基充分混匀，即得。
2-3、细胞活力检测试剂盒(Promega，G7572)工作液配制：将检测液与PBS按1:1稀释混匀，即得。
3、病毒滴度(TCID50)测定
S1、将BHK细胞按照5×103/孔接种于白壁底透96孔板中，贴壁培养过夜；
S2、取待滴定病毒，用2％维持培养基依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，于4℃保存待用；
S3、取出步骤S1中预先接种的96孔板，弃上清，病毒滴定组每孔加入150μl 2％维持培养基，对照组每孔加入200μl 2％维持培养基；
S4、将步骤S2中稀释好的病毒取出，由低浓度至高浓度依次接入步骤S3中的96孔板，每孔50μl，每个浓度设8个复孔；
S5、将接种好病毒的96孔板放回培养箱中继续培养，每天观察病毒孔病变情况，记录病变孔数量及病变程度，连续观察7天，50％孔完全病变浓度为TCID50(50％tissueculture infective dose)。
4、化合物抗寨卡病毒活性体外评价
4-1、细胞计数与铺板
(1)向长满BHK细胞的75cm2培养瓶中加入2ml胰酶，37℃消化2min，补加5ml 10％DMEM并将细胞吹散，2000rpm离心5min；
(2)弃上清，用5ml 10％ DMEM重悬浮细胞，混匀后吸取20μl至细胞计数板上，用细胞计数器计数；
(3)计算所需细胞数，用10％DMEM稀释，之后用排枪将细胞稀释液吹打混匀，以5×103个细胞/100μl/孔，加入白壁底透96孔板中；将细胞接种板置于湿盒中，于CO2培养箱孵育过夜，24h后接入已稀释好的病毒和待测化合物。
4.2化合物稀释
涡旋混匀化合物母液，取一定体积的母液至2％DMEM中，之后用排枪以3倍稀释梯度将待测化合物进行倍比稀释，共8个浓度，起始浓度为100μM；同时以Selleck生物公司购买的NITD008作为阳性化合物。
4.3换液及给药
(1)弃去96孔细胞接种板中的培养液，每孔加入100μl 2％DMEM；
(2)将稀释好的化合物按从低到高浓度依次加入96孔板细胞中，每孔50μl。细胞对照组及病毒对照组均加入等体积的2％DMEM，此时每孔体积为150μl；
(3)将待测毒种从-80℃冰箱中取出，平衡至室温；
(4)利用2％DMEM将待测毒种稀释至100TCID50，加入上述96孔板细胞中，每孔50μl；细胞对照组加入等体积的2％ DMEM，最终每孔体积为200μl；
(5)将96孔板放入湿盒，置于37℃、5％ CO2培养箱中，每天观察细胞病变情况。
4.4细胞活性检测
(1)将化学发光细胞活力检测试剂的Buffer和底物避光混合，配制为工作液后，-80℃保存；检测时，将工作液取出避光融化，与PBS按1:1比例混合，待用；
(2)当病毒对照孔完全病变时(BHK为8天)，吸弃96孔板中培养液，每孔加入100μl检测试剂，利用轨道振荡器将96孔板震荡5min，以诱导细胞裂解；避光稳定信号2min后，测定化学发光单位，使用酶标仪读板，程序为CellTiter-Glo预设程序。
5、结果分析
(1)按照以下公式计算待测药物各稀释度的抑制率：
其中，μSample、μvirus、μcell分别代表给药组、病毒对照组、细胞对照组的平均细胞活力。
(2)利用origin8.0软件对抑制率-浓度进行S型曲线拟合，计算待测化合物的EC50值。利用同样方法计算CC50值，并根据EC50及CC50按照公式SI＝CC50/EC50，计算选择指数(SI)。
(3)实验结果：
化合物I的EC50＝19.98±14.85μM，CC50>100μM，SI>5.01；阳性化合物NITD008的EC50＝1.86±1.48μM，CC50>10μM，SI>5.38。
可见，本发明绰奇烷二萜类化合物I对塞卡病毒具有显著的抑制作用，并且具有较好的安全性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种绰奇烷二萜类化合物在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于，所述绰奇烷二萜类化合物具有式I结构：
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述病毒为寨卡病毒。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述绰奇烷二萜类化合物还可以为其药学上可接受的盐、溶剂化物或立体异构体。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述绰奇烷二萜类化合物由海漆提取得到。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述绰奇烷二萜类化合物的制备方法具体包括以下步骤：
S1、将海漆干燥粉碎，用乙醇提取，提取液用正己烷和乙酸乙酯进行萃取，收集正己烷萃取物；
S2、将步骤S1所得正己烷萃取物进行正相硅胶柱层析，以正己烷-丙酮作为洗脱液进行梯度洗脱，收集正己烷-丙酮体积比为5:1的流份；
S3、将步骤S2所得正己烷-丙酮体积比为5:1的流份进行ODS柱层析，以丙酮-水作为洗脱液进行梯度洗脱，得到丙酮体积分数为40％的组分；
S4、将步骤S3所得到丙酮体积分数为40％的组分经高效液相进行分离纯化，得到绰奇烷二萜类化合物。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤S2中，所述梯度洗脱为以正己烷-丙酮作为洗脱液，按照100:0到0:100，v/v进行梯度洗脱。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤S3中，以丙酮-水作为洗脱液，依次以丙酮：水体积比＝30:70，40:60，55:45，70:30，85:15，100:0为溶剂进行梯度洗脱。
8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，步骤S4中，所述高效液相的流动相为55％乙腈/水，流速为1～3mL/min，检测波长为195nm。
9.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
10.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为口服剂、注射剂、外用剂或吸入剂。
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