CN117015394A - 结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子及其应用 - Google Patents
结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
提供一种能够结合人转化生长因子β(TGFβ)和人程序性死亡配体1(PD‑L1)的双功能分子、其药物组合物以及其在治疗癌症过程中的应用。该双功能分子具有对PD‑L1的高亲和力，能够显著促进IL‑2和IFN‑γ的分泌，增强T细胞免疫反应，并且能够以高特异性阻断TGFβ，而可被应用于治疗癌症。还提供一种结合人PD‑L1的单克隆抗体或其抗原结合片段。
Description
本发明涉及能够结合人转化生长因子β(TGFβ)和人程序性死亡配体1(PD-L1)的双功能分子、其药物组合物以及其在治疗癌症中的应用。本发明还涉及结合PD-L1的单克隆抗体、其抗原结合片段、其药物组合物以及其在治疗癌症中的应用。
以程序性死亡受体1(PD-1)/程序性死亡受体配体1(PD-L1)等免疫检查点为靶点的免疫治疗是当前肿瘤免疫治疗的研究热点。由于PD-1/PD-L1单抗在单药使用时的客观缓解率(objective response rate，ORR)不高，或是需要筛选PD-L1表达人群，现在PD-1/PD-L1单抗基本上都需要联合化疗或是放疗的方法使用，而这样的联合又可能带来毒性的增加和患者依从性降低，并且某些患者对于治疗仍没有应答。
M7824(MSB0011359C)是由Merck开发的一种创新的双功能融合蛋白，分别靶向PD-L1/TGF-β，临床前研究已经证实了PD-L1和TGFβ途径之间可能存在互补相互作用，还显示出M7824具有逆转癌细胞的间充质化和增强对化疗反应的能力，它的双重抑制可增强抗肿瘤活性。重要的是，在肿瘤微环境中同时靶向PD-L1和TGFβ对那些免疫排斥和免疫冷肿瘤也有效果。在临床前研究中，与单独使用抗PD-L1单抗或同时使用抗PD-L1和TGF-β单抗相比，M7824具有更强的抗肿瘤活性。
虽然M7824在肿瘤治疗的研究中取得了令人瞩目的进展，但临床上仍需要提供更多的能够结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子以满足市场需求。
发明内容
本发明提供一种结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子，其中，所述双功能分子包含：(a)人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；和(ii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人TGFβRII的能够结合人TGFβ的功能性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
另一方面，本发明提供一种结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子，其中，所述双功能分子包含：(a)人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；(ii)重链框架区FR1、FR2、FR3和FR4，所述FR1包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体；(iii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(iv)轻链框架区FR1’、FR2’、FR3’和FR4’，所述FR1’包含选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变 体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人TGFβRII的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
另一方面，本发明提供一种结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子，其中，所述双功能分子包含：(a)人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区包含选自SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含选自SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人TGFβRII能够结合人TGFβ的功能性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
另一方面，本发明提供一种结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子，其中，所述双功能分子包含：(a)人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人 TGFβRII的功能性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
另一方面，本发明还提供一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含本发明所述的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明还提供一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含本发明所述的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子以及第二治疗剂。
另一方面，本发明还提供本发明所述的TGFβ和PD-L1的双功能分子在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
另一方面，本发明还提供一种编码前述的双功能分子的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供一种包含前述核苷酸序列的载体。
另一方面，本发明还提供一种包含前述载体的非人类的宿主细胞。此外，本发明还提供生成本发明的双功能分子的细胞系，包含本发明的核苷酸的重组表达载体，以及通过培养抗体生产细胞系来制备抗体的方法。
另一方面，本发明还提供一种治疗对象中癌症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的双功能分子中的任一个或本发明的药物组合物中任一个施用至该对象。
本发明提供的双功能分子以高度亲和力结合人PD-L1，显著促进IL-2和IFN-γ的分泌，增强T细胞免疫反应，并且以高度特异性阻断TGFβ，实验证实这些双功能分子能够延长其在血液中存在的时间，并且显著抑制肿瘤的生长。
另一方面，本发明还提供一种结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；和(ii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明还提供一种结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段， 其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；(ii)重链框架区FR1、FR2、FR3和FR4，所述FR1包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体；(iii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(iv)轻链框架区FR1’、FR2’、FR3’和FR4’，所述FR1’包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明提供一种结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中重链可变区包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO48:所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链可变区包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明提供一种结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明还提供一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含本发明所述的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明还提供一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含本发明所述的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段以及第二治疗剂。
另一方面，本发明还提供本发明所述的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
另一方面，本发明还提供一种编码前述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
另一方面，本发明还提供一种包含前述核苷酸序列的载体。
另一方面，本发明还提供一种包含前述载体的非人类的宿主细胞。此外，本发明还提供生成本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的细胞系，包含本发明的核苷酸的重组表达载体，以及通过培养抗体生产细胞系来制备抗体的方法。
另一方面，本发明还提供一种治疗对象中癌症的方法，其包括将治疗有效量的本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段中的任一个或本发明的药物组合物中任一个施用至该对象。
本发明提供的单克隆抗体以高度亲和力结合人PD-L1，显著促进IL-2和IFN-γ的分泌，增强T细胞免疫反应。这些抗体可以被用作抗肿瘤剂、免疫增强剂，或被用作诊断试剂，用于检测癌症或其他疾病患者的血液或组织中的人PD-L1，或作为双功能分子(例如本发明所述的靶向PD-L1和人TGFβ的双功能分子)的一部分结合至人PD-L1
图1：纯化的双功能分子的凝胶电泳图。
图2：CP-ab1(BJ-007)、CP-ab2(14H2/14L2)、CP-ab3(BJ-005-P2)和CP-ab4(BJ-005-P5)均促进了IL-2的释放。
图3：CP-ab1(BJ-007)、CP-ab2(14H2/14L2)、CP-ab3(BJ-005-P2)和CP-ab4(BJ-005-P5)均促进了IFN-γ的释放。
图4：BJ-005-P1、BJ-005-P2、BJ-005-P3和BJ-005-P4的特异性显著强于对照。
图5：1mg/kg BJ-005-P5在大鼠体内的浓度变化。
图6：5mg/kg BJ-005-P5在大鼠体内的浓度变化。
图7：1mg/kg BJ-007在大鼠体内的浓度变化。
图8：5mg/kg BJ-007在大鼠体内的浓度变化。
图9：BJ-005-P5对肿瘤生长的影响。
PD-L1
程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，PD-L1)，又可称为分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或者B7同源蛋白1(B7homolog1，B7-H1)，属于肿瘤坏死因子超家族，是由290个氨基酸残基组成的I型跨膜糖蛋白，包含一个lgV样区、一个lgC样区、一个跨膜疏水区和一个30个氨基酸的胞内尾部，完整分子量为40kDa。与其他B7家族成员一样，PD-L1也能够向T细胞提供共刺激信号。PD-L1mRNA在几乎所有组织中都有表达，但PD-L1蛋白只在少部分组织中持续表达，包括肝脏、肺、扁桃体以及免疫特赦组织如眼、胎盘等。PD-L1也表达于活化的T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。在正常生理条件下，PD-L1mRNA处于严格的转录后调节之下，但PD-L1蛋白在各种人类癌症的细胞表面上大量表达。
PD-L1的受体为PD-1。程序性死亡受体1(programmed death-1,PD-1)是CD28超家族一员，该家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1是免疫球蛋白超家族中的I型跨膜蛋白，有288个氨基酸，是已知的主要免疫检查点之一，主要表达于CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞、B细胞和活化的单核细胞等免疫细胞表面。PD-L1与PD-1的结合可以限制抗原递呈细胞或者树突状细胞与T细胞的相互作用，进一步抑制T细胞的代谢，抑制抗凋亡细胞Bcl-X2的分泌，减少效应细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌，诱导T细胞耗竭和凋亡，从而降低免疫T细胞参与的免疫应答，行使负性调节功能。
肿瘤部位PD-L1的表达可以通过多种途径保护肿瘤细胞免受伤害。研究表明，肿瘤细胞相关PD-L1可以增加肿瘤特异性T细胞的凋亡，而PD-L1单克隆抗体可以减弱这种作用。在癌症中，PD-L1和PD-1/PD-L1途径可以保护肿瘤免受细胞毒性T细胞的侵害，最终通过使肿瘤微环境中的细胞毒性T细胞失活来抑制抗肿瘤免疫应答，并且防止淋巴结中新的T细胞的激发和活化以及随后招募至肿瘤。PD-L1不仅仅是PD-1的配体，它也可以作为受体传递反向的信号保护肿瘤细胞免受FAS-FASL等其他抗肿瘤途径诱导的凋亡。
PD-L1通过增加抗原特异性T细胞克隆的凋亡而在肿瘤免疫中发挥重要作用。PD-L1被发现表达于各种肿瘤病人的组织中，包括非小细胞肺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、肝内胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫颈癌、头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌、 食管癌、膀胱癌、皮肤癌、肾细胞癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌等。细胞恶变过程中，由于基因突变等原因会产生新的蛋白分子，这些蛋白在细胞内降解后的某些肽段可以在细胞表面表达而成为肿瘤抗原。免疫系统可以通过免疫监察识别肿瘤抗原并清除肿瘤细胞，而肿瘤细胞可以利用PD-L1逃避免疫攻击。
TGFβ
转化生长因子β(transforming growth factor,TGFβ)是一种有效的抑制免疫的细胞因子，对多数免疫细胞(树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、CD4+、CD8+细胞)有作用。TGFβ也刺激免疫抑制调节性T细胞的分化。TGFβ存在三个亚型，分别为TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，均可以与2型TGFβ受体(TGFβRII)结合。
TGFβ在肿瘤发生和发展中都扮演着非常重要的作用，TGFβ在肿瘤后期是一个肿瘤促进因子。在肿瘤晚期，大多数肿瘤细胞均可以分泌TGFβ，一旦TGFβ水平升高便会阻断未成熟的T细胞向Th1细胞分化，促进其向Treg亚群的转化，并抑制树突状细胞的抗原递呈功能，从而导致肿瘤细胞的免疫逃逸。随着肿瘤的发展，肿瘤细胞内TGFβ受体或其下游的Smad基因突变积累，其抑制作用减弱。并且TGFβ信号促进上皮细胞间质转型，这个过程使具有极性的上皮细胞转化为具有活动能力的间质细胞，从而获得侵袭和迁移的能力，而肿瘤迁移是导致癌症病人死亡的重要原因之一。
TGFβ配体和受体均作为治疗剂靶标而被集中研究。存在三种配体同种型，TGFβ1、2和3，其均以同源二聚体的形式存在。还存在三种TGFβ受体(TGFβR)，其称为TGFβR I、II和III型。TGFβRI是信号转导链，无法结合配体。TGFβRII以高亲和力结合配体TGFβ1和3，但不结合TGFβ2。TGFβRII/TGFβ复合物招募TGFβRI以形成信号转导复合物。TGFβRIII是TGFβ与其信号转导受体结合的正调节物，并且以高亲和力结合全部3种TGFβ同种型。在细胞表面上，TGFβ/TGFβRIII复合物结合TGFβRII，然后招募TGFβRI，其替代TGFβRIII以形成信号转导复合物。
尽管这三种不同的TGFβ同种型均通过相同受体信号转导，但已知其具有差异表达模式，并且体内功能不重叠。研究显示，TGFβ1和TGFβ2分别在肿瘤微环境和心脏生理学中起主要作用。中和TGFβ1但非TGFβ2的治疗剂可使心脏毒性最小化但不影响抗肿瘤活性，从而提供最优的治疗指数。因此，如已经为现有技术所证实的，抗PD-L1/TGFβ融合蛋白缺乏毒性，包括心脏毒性。
用于中和TGFβ的治疗方式包括采用TGFβ受体的胞外结构域和中和抗体。可溶TGFβRIII似乎是明显的选择，因为它结合全部三种TGFβ配体。然而，TGFβRIII， 其以280-330kD葡糖胺聚糖(GAG)-糖蛋白形式天然产生，具有762个氨基酸残基的胞外结构域，对于生物治疗剂开发而言是非常复杂的蛋白质。缺乏GAG的可溶TGFβRIII能在昆虫细胞中产生，并且显示为有力的TGFβ中和剂。TGFβRIII的两个单独的结合结构域(内皮糖蛋白相关和尿调素相关)能被独立表达，但显示其亲和力比可溶TGFβRIII低20-100倍，并且具有很少的中和活性。另一方面，TGFβRII的胞外结构域仅长136个氨基酸残基，并且可以25-35kD的糖基化的蛋白质形式产生。研究显示，重组可溶TGFβRII以200pM的KD结合TGFβ1，这与对于细胞上的全长TGFβRII的50pM KD基本类似。
而中和全部三种TGFβ配体同种型的另一种方法是筛选全中和性(pan-neutralizing)抗TGFβ抗体，或阻滞受体不与TGFβ1、2和3结合的抗受体抗体。但是，迄今绝大多数对于TGFβ靶向的抗癌治疗的研究，包括通常剧毒的TGFβ信号转导的小分子抑制剂，大部分处于临床前阶段，并且获得的抗肿瘤功效有限。
本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子，其包含能够结合TGFβ的人TGFβ受体II(TGFβRII)或其功能性片段。在一个实施方式中，所述功能性片段是人TGFβ受体2型同种型A的可溶部分，其能够结合TGFβ。在另一个实施方式中，所述功能性片段包含人TGFβ受体2型同种型A的氨基酸73-184。在另一个实施方式中，所述功能性片段包含人TGFβ受体2型同种型A的氨基酸24-184。在另一个实施方式中，所述功能性片段是人TGFβ受体2型同种型B的可溶部分，其能够结合TGFβ。在另一个实施方式中，所述功能性片段包含人TGFβ受体2型同种型B的氨基酸48-159。在另一个实施方式中，所述功能性片段包含人TGFβ受体2型同种型B的氨基酸23-159(SEQ ID NO.71)。在另一个实施方式中，所述功能性片段包含人TGFβ受体2型同种型B的氨基酸24-159。在另一个实施方式中，所述功能性片段包含人TGFβ受体2型同种型B的氨基酸24-105。
抗体片段
如本文中使用的，术语“抗体”是指表现所需生物学活性(例如抑制配体与其受体的结合或通过抑制配体诱导的受体信号转导)的抗体的任何形式。“抗体片段”和“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。因此，如本文使用的，抗体片段的例子包括但不限于：Fab、Fab′、 F(ab′)
2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；纳米抗体；结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)
2分子。
“F(ab′)
2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)
2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体”(或“scFv抗体”)是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。一般而言，Fv多肽在VH和VL结构域之间包含额外的多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
如本文所用，术语“人源化的抗体”是指包含衍生自除人以外的哺乳动物的抗体的CDR、以及人抗体的框架区(FR)和恒定区的抗体。
抗PD-L1抗体
本发明的抗体或其抗原结合片段可以是本领域中已知的任何抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一个方面中，所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；和(ii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57 所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体部分的CDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体部分的CDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体部分的CDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体。
在本发明的另一方面中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；(ii)重链框架区FR1、FR2、FR3和FR4，所述FR1包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体；(iii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示 的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(iv)轻链框架区FR1’、FR2’、FR3’和FR4’，所述FR1’包含选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。
在一些实施方案中，所述FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述FR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR1’包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变 体，所述FR2’包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述FR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR1’包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR1’包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:49所示的氨 基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在本发明的另一方面，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其等同片段；以及(ii)轻链，其包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其等同片段。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述双功能分子的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
抗PD-L1单克隆抗体
本文所用术语“单克隆抗体”是指从基本上同种抗体群中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能的天然突变体外，构成所述群的各个抗体是一致的。单克隆抗体具有高度特异性，可针对单个的抗原位点。此外，与通常包括针对多个不同的决定簇(表位)的多种不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体仅针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”表示从基本上同种抗体群获得的抗体的特性，不能理解为需要通过任何特定方法来制备所述抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可通过杂交瘤或重组DNA方法制备。单克隆抗体可以包括“嵌合”抗体。
在本发明的一个方面，本发明的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；和(ii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。
在一些实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体CDR1’包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(i) 重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；(ii)重链框架区FR1、FR2、FR3和FR4，所述FR1包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体；(iii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’、CDR3’，所述CDR1’包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(iv)轻链框架区FR1’、FR2’、FR3’和FR4’，所述FR1’包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2’包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2’包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其 等同变体，FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链可变区，其包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(ii)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。
在一些实施方式中，所述结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在本发明的另一个方面，本发明的结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链，其包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
“特异性结合”是指本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性地与靶标分子的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多氨基酸相互作用。抗体的“特异性结合”主要由两个参数来表征：定性参数(结合表位或抗体结合位置)和定量参数(结合亲和力或结合强度)。抗体结合表位可通过FACS法、肽点表位作图法、质谱法或肽ELISA法测定。Biacore法和/或ELISA法可测定抗体与特定表位的结合强度。通常将信噪比作为结合特异性的代表性测定计算方法。在这样的信噪比中，信号代表抗体结 合目标表位的强度，而噪声代表抗体与其他非目标表位结合的强度。优选地，对于目标表位的信噪比为约50时可以认为所评估的抗体以特异性方式结合目标表位，即“特异性结合”。
如果抗原结合蛋白(包括抗体)以如通过解离常数(KD，或对应的Kb，如以下定义的)值确定的高结合亲和力与抗原结合，则抗原结合蛋白(包括抗体)与抗原“特异性地结合”。如本文使用的术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
变体
如本文中使用的，序列“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性的序列。
“保守修饰的变体”或“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性。
本文所用的两个序列之间的“％同一性”是指所述序列共有的等同位置的数目的函数(即％同源性＝等同位置数/总位置数x 100)，其中会考虑到空位数目及各空位长度，所述空位需要在进行两个序列最佳比对时引入。序列比较和两个序列之间％同一性的确定可用数学算法来完成。例如，两个氨基酸序列之间的％同一性可用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))的算法来确定，该算法业已被引入到ALIGN程序(2.0版)中，其使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的％同一性可用Needleman和Wunsch(J.MoI.Biol.48：444-453(1970))算法来确定，该算法已被引入到GCG软件包的GAP程序(可在
www.gcg.com中得到)中，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
“等同变体”是指在生物学活性和功能上与所示序列(如氨基酸序列)相同或实质性相似但序列上与所示序列具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的序列。
抗体纯化
当使用重组技术时，抗体可产生在细胞内、周质空间或直接分泌到培养基中。若抗体在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解的片段)。当抗体分泌到培养基中时，通常首先用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自所述表达系统的上清液。可在任何前述步骤中使用蛋白酶抑制剂(例如PMSF)以抑制蛋白水解，可使用抗生素以防止外来污染物生长。
根据待回收的抗体，还可利用其它蛋白质纯化技术，例如离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱法、阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)色谱法、色谱聚焦法、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在一个实施方式中，糖蛋白可通过以下方法来纯化：使糖蛋白吸附到凝集素基底上(例如凝集素亲和柱)，以从制备物中去除含岩藻糖的糖蛋白并由此富集无岩藻糖的糖蛋白。
连接子
本发明双功能分子中的抗体或其抗原结合片段的C末端与人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端可以通过连接子连接。所所述连接子可以是本领域已知的任何连接子。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:70)。
结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子
一方面，本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含：(a)人TGFβRII或能够结合人TGFβ的片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；和(ii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案 中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人TGFβRII的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
在一些实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR1’包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3’包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体。
另一方面，本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含：(a)人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(i)重链互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；(ii)重链框架区FR1、FR2、FR3和FR4，所述FR1包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2包含自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3包含选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体；(iii)轻链互补决定区CDR1’、CDR2’和CDR3’，所述CDR1’包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR2’包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，所述CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体；以及(iv)轻链框架区FR1’、FR2’、FR3’和FR4’，所述FR1’包含选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR2’包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR3’包含选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体，所述FR4’包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人TGFβRII的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，区FR2’包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2’包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同 变体，FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2’包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2’包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4’包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体，FR1’包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，FR2’包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其等同变体，FR3’包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体，FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如 SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或其等同变体的重链可变区和如SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链可变区。
另一方面，本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含：(a)人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人PD-L1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含选自SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其等同变体。在一些实施方案中，所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)
2、Fab、Fab′或F(ab′)
2。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。在一些实施方案中，所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。在一些实施方案中，所述人TGFβRII的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。在一些实施方案中，所述双功能分子具有三维空间结构。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
在一些实施方案中，所述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子包含的抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其等同变体的重链和如SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列或其等同变体的轻链。
药物组合物
“药物组合物”是指用于人的药物制剂。该药物组合物包含本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段以及载体、稳定剂和/或赋形剂的合适制剂。本发明提供包含本发明的双功能分子或单克隆抗体或其抗原结合片段的药物制剂。为了制备药物组合物或无菌组合物，让双功能分子或抗体或其抗原结合片段与可药用载体或赋形剂混合。可通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备呈例如冻干粉、浆液、水溶液剂或混悬剂形式的治疗及诊断药物的制剂。
可通过标准药物方法，在细胞培养物或实验动物中测定单独给予或与免疫抑制剂联合给予的组合物的毒性和治疗功效，所述方法例如为用于测定LD50(使群体的50％致死的剂量)和ED50(有效治疗群体的50％的剂量)的方法。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可表示为LD50与ED50之比。从这些细胞培养物测定及动物研究中获得的数据可用于调配用于人的剂量范围。所述化合物的剂量优选在包括毒性极少或无毒性的ED50的循环浓度范围内。可根据采用的剂型及所用的给药途径，使剂量在该范围内变化。
合适的给药途径包括胃肠外给药(例如肌内、静脉内或皮下给药)及口服给药。可按多种常规方式给予用于药物组合物或用于实践本发明方法的抗体，这些方法例如有经口摄取、吸入、局部施用或经皮肤、皮下、腹膜内、胃肠外、动脉内或静脉内注射。在一个实施方式中，静脉内给予本发明的结合化合物。在另一个实施方式中，皮下给予本发明的结合化合物。或者，人们可以以局部而非全身方式(通常为长效制剂或缓释制剂)给予抗体，例如经由将抗体直接注射到作用位点。此外，人们可以在靶向药物递送系统中给予抗体。
由临床医生例如用本领域已知或怀疑影响治疗或预期影响治疗的参数或因子来测定合适的剂量。通常，开始剂量比最佳剂量稍低，此后少量增加直到达到相对于任何 不良副作用所要的或最佳的作用效果。重要的诊断测量包括测量例如炎性症状或所产生的炎性细胞因子的水平。
可通过连续输注或通过以一定间隔(例如一天、一周或每周1-7次)给药来提供抗体、抗体片段和细胞因子。可通过静脉内、皮下、腹膜内、经皮肤、局部、经口、经鼻、经直肠、肌内、大脑内、脊柱内或通过吸入来提供剂量。优选剂量方案是包括避免显著的不合乎需要的副作用的最大剂量或给药频率的方案。周总剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常为至少0.2μg/kg，最通常为至少0.5μg/kg，典型地为至少1μg/kg，更典型地为至少10μg/kg，最典型地为至少109μg/kg，优选为至少0.2mg/kg，更优选为至少1.0mg/kg，最优选为至少2.0mg/kg，理想地为至少10mg/kg，更理想地为至少25mg/kg，而最理想地为至少50mg/kg。基于摩尔/kg计算，小分子治疗剂例如肽模拟物、天然产物或有机化学药剂的所需剂量与抗体或多肽的剂量接近相同。
本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物缀合的抗体。也可与其它治疗形式(例如手术、化疗及放射)一起施用所述药物组合物。典型的兽医、实验或研究对象包括猴、狗、猫、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、马和人。
具体地，本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段可与第二治疗剂组合使用。在具体实施例中，第二治疗剂及本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或单克隆抗体或其抗原结合片段于实质上相同的时间施用。个体有时会同时使用第二治疗剂及本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或单克隆抗体或其抗原结合片段。在一种实施方式中，该第二治疗剂或其他典型施用至癌症病患的药剂及本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或单克隆抗体或其抗原结合片段可组合成药物组合物；在其他具体实施例中，两者分别施用。
术语“第二治疗剂”是有利地与抗PD-L1抗体组合的任一试剂。可有利地与抗PD-L1抗体组合的示例性试剂包括但不限于抑制PD-L1活性的其他试剂(包括其他抗体或其抗原结合片段、肽抑制剂、小分子拮抗剂等)和/或干扰PD-L1上游或下游信号转导的试剂。“第二治疗剂”还可以是有利地与人TGFβ结合的任一试剂。
本发明的一方面提供了用本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段治疗癌症的方法。更具体地，本发明提供了增强T细胞功能、恢复抗肿瘤反应和控制肿瘤生长的方法，包含施用治疗有效量的任何上 述结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
增强T细胞功能、恢复抗肿瘤反应和控制肿瘤生长为治疗癌症提供了广谱方法。因此，可以通过施用本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段或药物组合物来治疗多种类型的癌症。
治疗
当用“给予”和“治疗”提及动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液时，是指将外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受治疗者、细胞、组织、器官或生物液接触。“给予”和“治疗”可指例如治疗方法、药动学方法、诊断方法、研究方法和实验方法。治疗细胞包括让试剂与细胞接触以及让试剂与流液接触，其中所述流液与细胞接触。“给予”和“治疗”还意味着例如通过试剂、诊断剂、结合组合物或通过其他细胞对细胞进行体外和离体治疗。
如本文中所使用的，术语“抑制”或“治疗”包括延缓与疾病有关的症状的发展和/或减轻所述疾病将要或预期发展的这些症状的严重程度。所述术语还包括减缓已有症状、防止另外的症状和减缓或防止这些症状的潜在原因。因此，所述术语表示已将有益结果赋予患有疾病的脊椎动物对象。
治疗有效量
如本文中所使用的，术语“治疗有效量”或“有效量”是指当将本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段单独给予或与另外的治疗剂联合给予细胞、组织或受治疗者时，其有效防止或减缓待治疗的疾病或病症的量。治疗有效剂量进一步指所述化合物足以导致症状减缓的量，所述减缓症状例如为治疗、治愈、防止或减缓相关医学状态，或提高对所述病征的治疗率、治愈率、防止率或减缓率。当施用给个体单独给予的活性成分时，治疗有效量是指该单独的成分。当施用组合时，治疗有效量是指产生治疗效果的活性成分的联合的量，而不论其是联合给予、连续给予还是同时给予。治疗有效量将减轻症状通常至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％和最优选至少50％。
在本发明中，“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味 着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
癌症
本发明的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子或结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段可以用于治疗癌症。所述癌症包括但不限于：胃癌、肺癌、肝癌、肝内胆管癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、肾癌、尿道上皮细胞癌、乳腺癌、子宫颈癌、头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌、食管癌、膀胱癌、肾细胞癌、甲状腺癌、皮肤癌和口腔鳞状细胞癌。在一些实施方式中，所述癌症是高度免疫原性癌。在一些实施方案中，所述癌症是表达PD-L1和/或TGFβ水平升高的癌症。
实施例
实施例1:双功能分子的构建及表达
准备转染细胞：取悬浮培养的HEK-293细胞，确定其细胞密度及存活率。为确保转染效果，使用生长处于指数期(密度约为6～8×10
6个/毫升)，存活率大于97％的细胞悬液；细胞无需离心，直接兑入KOP293培养液(黄色橙明，含F-68)，使其密度为3×10
6个/毫升；摇瓶置于5％的CO
2恒温摇床中，37℃、120rpm恒温震荡培养24小时(5-6×10
6个/毫升)。
瞬时转染(使用珠海恺瑞生物科技有限公司转染系统，以转染100ml细胞悬液为例)：准备两支规格为15ml的无菌离心管。在其中一支离心管中加入5ml KRM和100μg质粒(按标准基因工程操作获得，重链和轻链各50μg)，轻轻吹打混匀；取另一支离心管，加入5ml KRM和500μg PEI(1μg/μl水溶液)转染试剂，轻轻吹打混匀(质量比：质粒:PEI＝1:5)；吸取含转染试剂的离心管中所有液体与含质粒的离心管液体混合，轻轻吹打混匀，室温下静置10分钟；从恒温摇床中取出准备好的HEK-293细胞，将质粒-载体复合物均匀加入细胞悬液中，摇匀放回CO
2恒温摇床中培养(37℃,120rpm)。转染3小时后可根据需要加入适量抗生素(100×P/S)。
产物表达与检测：转染24小时后可加入表达增强剂(Kairui Protein Expression Enhancer，KPEEn)至终浓度为3mmol/L，以增加蛋白表达量；转染三天后测定产物表达情况；转染时限为6天(细胞活率低于70％)。上清使用Protein A亲和柱进行纯化。跑SDS-PAGE(如图1)和考马氏亮蓝染色分析结果。
纯化的产物进行测序，测序结果如下表所示。 表1 双功能分子的序列
实施例2:与人和猴的PD-L1的亲和力分析
本发明涉及的结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子和结合人PD-L1的单克隆抗体或其抗原结合片段的示例性序列如下表2-6所示。
表2 双功能分子中结合人PD-L1的抗体的CDR序列
表3 双功能分子中结合人PD-L1的抗体的框架区序列
表4 双功能分子中结合人PD-L1的抗体的可变区序列
表5 双功能分子中结合人PD-L1的抗体的恒定区序列
表6 双功能分子中结合人PD-L1的抗体的序列
对照BJ-007分子(等同于M7824Bintrafusp alfa)的全序列如下所示，其中重链部分的序列以下划线示出，TGFbetaRII以斜体示出：
使用Gator仪器(
https://probelife.com/gator.html)，对不同的双功能分子与人(human)和猴(Cynomolgus Macaque)的PD-L1的亲和力进行测量，结果如下表所示。
表7 不同分子与人和猴的亲和力
由表7可知，BJ-005-P1的平衡解离常数与BJ-007的平衡解离常数相当，而BJ-005-P2、BJ-005-P3、BJ-005-P4和BJ-005-P5的平衡解离常数均显著小于BJ-007的平衡解离常数，说明BJ-005-P2、BJ-005-P3、BJ-005-P4和BJ-005-P5比BJ-007具有更高的结合亲和力。
实施例3：混合淋巴细胞反应(MLR)
通过MLR测试不同分子对T细胞活化的影响。
方法：新鲜的PBMC购买自Allcells，并被用于诱导单核细胞衍生的树突状细胞(mo-DC)。从另一个供体的新鲜PBMC中分离出CD3
+T细胞。将CD3
+T(应答者)细胞和mo-DC(刺激剂)分配到96孔板中，然后将四种分子(终浓度0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10μg/mL)或Atezolizumab(作为阳性对照，终浓度10μg/mL)的十倍 系列稀释液添加到指定的孔中，并在37℃5％CO
2下共培养。收集上清液通过ELISA分别检测培养3天后的IL-2浓度和培养5天后的IFN-γ。
具体实验步骤：新鲜的PBMC从Allcells购买；用1640培养基(无血清)将PBMC以2.5E6/mL的密度接种到100mm细胞培养皿(10mL/皿)中，并在37℃5％CO
2培养箱中孵育2小时以收集单核细胞；然后弃去上清液，然后用DPBS洗涤细胞两次；将10mL含50ng/mL IL-4和100ng/mL GM-CSF的1640完全培养基添加到细胞培养皿中，然后在37℃5％CO
2培养箱中孵育细胞(第0天)。在第3天，用新鲜的含有IL-4和GM-CSF的1640完全培养基代替一半体积的细胞培养基。在第6天用1μg/mL LPS处理未成熟的mo-DC。第7天，从细胞培养皿中收集成熟的mo-DC，并在37℃下用10μg/mL的丝裂霉素C以1E6/mL的密度处理1.5小时，然后用1640将mo-DC洗涤3次。然后重悬于1640完全培养基。从另一个供体中分离出CD3+T细胞，并重悬于1640培养基。将DC(5E4/孔/50μL)和CD3+T细胞(2E5/孔/100μL)分配到96孔板中。将50μL系列稀释分子(终浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10μg/mL)或50μL Atezoluzumab(终浓度为10μg/mL)加入孔板中。分别在孵育3天后收集上清液用于检测IL-2，并在孵育5天后通过ELISA检测IFN-γ。
结果：如图2-3所示，Atezolizumab如预期的那样增加了IL-2和IFN-γ的释放。与对照组相比，浓度分别为0.1、1和10μg/mL的CP-ab1(BJ-007)、CP-ab2(14H2/14L2)、CP-ab3(BJ-005-P2)和CP-ab4(BJ-005-P5)均促进了IL-2和IFN-γ的释放。
实施例4：TGFβ阻断实验
细胞：HEK-Blue
TM TGF-β细胞，购买自InvivoGen。
实验过程：第一天，孔板中每孔加入150ul细胞悬浮液(约50000个细胞)；将起始浓度为58nM的不同分子，稀释3倍，浓度梯度为10，重复两次；然后每孔添加50ul分子，每孔添加0.04nm TGF-β1；每孔总容积200ul；将板在37℃的CO
2培养箱中孵育20-24小时。第二天，每孔添加160μl QUANTI-Blue
TM溶液和40μl SEAP表达细胞上清液。在37℃下孵育1小时。在620nm下测量SEAP水平。
结果：由下表8和图4可知，BJ-005-P1、BJ-005-P2、BJ-005-P3和BJ-005-P4的IC
50显著小于对照组，说明BJ-005-P1、BJ-005-P2、BJ-005-P3和BJ-005-P4的特异性和灵敏度显著强于对照组。
表8 不同分子的IC
50
实施例5：药物代谢动力学分析
实验动物：雄性SD大鼠，240g～260g。
实验设备：赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)的Microplate Reader 51119080；其林贝尔(Kylin-Bell)的Shaker TS-2；Bioscience的Microplate dehydrator BIOS-401；佰腾(BioTek)的Automatic washer Elx405Select CW。
试剂/材料：R&D的山羊抗人TGFβRII；英杰公司(Invitrogen)的山羊抗人Fc cross absorbed HRP共轭标签；索莱宝(Solarbio)的TMB；终止溶液2M H2SO4；PBS(pH7.4)；PBS-0.05％Tween20(PBST)。
实验方法：
(1)动物操作：称重大鼠，并编号为R01至R12。按体重将BJ-005-P5或BJ-007(1mg/kg或5mg/kg)通过尾静脉注射入大鼠体内，其中，R01、R02和R03号大鼠以1mg/kg注射BJ-005-P5，R04、R05和R06号大鼠以5mg/kg注射BJ-005-P5，R07、R08和R09号大鼠以1mg/kg注射BJ-007，R010、R11和R12号大鼠以5mg/kg注射BJ-007。按照以下时间点从颈静脉取血：4、24、48、72、120、168、336小时。3000×g 4℃离心10min后分离血浆，于-80℃保存。在所有时间点准备血浆后进行ELISA检测。
(2)样品稀释：按照下表对样品进行稀释。标准曲线：从125ng/mL开始，用血浆/PBS缓冲液稀释2倍。
(3)ELISA检测：用PBS将山羊抗人TGFβRII稀释至0.5μg/mL。在96孔板 中加入100μL稀释的抗体溶液，在黑暗中于4℃孵育过夜。丢弃抗原溶液。用300μL PBST洗涤孔并重复3次。在96孔板的每个孔中加入100μL封闭缓冲液(PBST+1％BSA，w/v)。在25℃±3℃，220±20rpm的平板振荡器上摇板1小时±20分钟。丢弃封闭缓冲液(PBST+1％BSA，w/v)。用300μL PBST洗涤孔并重复3次。对于每个孔，添加100μL稀释的血浆。在25℃±3℃，220±20rpm的平板振荡器上摇板1小时±20分钟。丢弃血浆样品。用300μL PBST洗涤孔并重复3次。向每个孔中添加100μL第二抗体(山羊抗人Fc cross absorbed HRP 1：2000稀释)。在25℃±3℃，220±20rpm的平板振荡器上摇板1小时±20分钟。标记第二抗体。用300μL PBST洗涤孔并重复3次。在每个孔中加入100μL新鲜制得的TMB底物。在25℃±3℃下孵育5-20分钟。向每个孔中加入50μL 2N H
2SO
4以终止反应。在OD
450nm处读板。
(4)绘制血药时间曲线：在以时间为横坐标，血药浓度为纵坐标的坐标图中，将测算的浓度值作点连线，即得到血药时间曲线，如图5至8所示，其中predict max为预测最大值，predict min为预测最小值。在曲线上找出血药浓度下降一半所对应的时间即为该药的平均药物清除半衰期(half life，t
1/2)。
结果：由图5-8可知，1mg/kg剂量水平下，BJ-005-P5的平均药物清除半衰期为5.8天(图5)，而BJ-007的平均药物清除半衰期为1.2天(图7)；5mg/kg剂量水平下，BJ-005-P5的平均药物清除半衰期为6.1天(图6)，而BJ-007的平均药物清除半衰期为1.7天(图8)，说明血液中BJ-005-P5浓度下降一半所需要的时间显著长于BJ-007。
实施例6：BJ-005-P5对肿瘤生长的影响
实验动物：人PD-L1和PD-1双敲入小鼠，6周龄，体重约20g。
实验过程：在第0天，将100万个MC38-hPD-L1细胞移植到每只小鼠中。当肿瘤达到约50-100mm
3时，进行以下治疗(n＝6)：PBS；每三天10ug BJ-005-P5；每三天66ug BJ-005-P5；每三天200ug BJ-005-P5；每三天66ug BJ-007。每3天测量一次肿瘤体积和体重。
结果：由图9可知，BJ-005-P5和BJ-007均可抑制肿瘤的生长，且抑制效果呈剂量依赖式增强。
应该理解的是，尽管已经通过优选实施方式和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改、改进和变化，这些修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法和实施例是优选的实施方式的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。
Claims (34)
- 一种结合人TGFβ和人PD-L1的双功能分子，其包含(a)人转化生长因子β受体II(TGFβRII)或其能够结合人TGFβ的功能性片段，和(b)结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：重链互补决定区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体；重链互补决定区CDR2，其包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体；重链互补决定区CDR3，其包含选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区CDR1’，其包含选自SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区CDR2’，其包含选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区CDR3’，其包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中互补决定区选自以下组合：(1)重链互补决定区CDR1包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其等同变体，重链互补决定区CDR2包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其等同变体，重链互补决定区CDR3包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR1’包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR2’包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体；(2)重链互补决定区CDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其等同变体，重链互补决定区CDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其等同变体，重链互补决定区CDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR1’包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR2’包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体；和(3)重链互补决定区CDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，重链互补决定区CDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，重链互补决定区CDR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR1’包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR2’包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链互补决定区CDR3’包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：重链框架区FR1，其包含选自SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体；重链框架区FR2，其包含选自SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体；重链框架区FR3，其包含选自SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体；重链框架区FR4，其包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链框架区FR1’，其包含选自SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链框架区FR2’，其包含选自SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链框架区FR3’，其包含选自SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体；和轻链框架区FR4’，其包含选自SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段的框架区选自以下组合：(1)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链 框架区FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体；(2)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体；(3)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR3’包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体；(4)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR3’包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其等同变体；和(5)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR3’包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段的可变区选自以下组合：(1)重链可变区包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列或其等同变体；(2)重链可变区包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列或其等同变体；(3)重链可变区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其等同变体；(4)重链可变区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体；(5)重链可变区包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列或其等同变体；和(6)重链可变区包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列选自以下组合：(1)重链包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列或其等同变体；(2)重链包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列或其等同变体；(3)重链包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或其等同变体；(4)重链包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体；(5)重链包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:68所示的氨基酸序列或其等同变体；和(6)重链包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:69 所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其中所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv) 2、Fab、Fab′或F(ab′) 2。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，所述抗体或其抗原结合片段的C末端与所述人TGFβRII或其能够结合人TGFβ的功能性片段的N末端通过连接子相连。
- 根据权利要求9所述的双功能分子，其中所述连接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:70所示。
- 根据权利要求1至10中任一项所述的双功能分子，其中所述人TGFβRII的氨基酸序列如SEQ ID NO:71所示。
- 根据权利要求1所述的双功能分子，其具有三维空间结构。
- 一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的双功能分子以及药学上可接受的载体。
- 一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的双功能分子以及第二治疗剂。
- 根据权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述癌症选自胃癌、肺癌、肝癌、肝内胆管癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、肾癌、尿道上皮细胞癌、乳腺癌、子宫颈癌、头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌、食管癌、膀胱癌、肾细胞癌、甲状腺癌、皮肤癌和口腔鳞状细胞癌。
- 一种核酸，其包含编码权利要求1至12中任一项所述的双功能分子的核苷酸序列。
- 一种包含权利要求16所述的核苷酸序列的载体。
- 一种含有权利要求17所述载体的非人类的宿主细胞。
- 一种结合人程序性死亡配体1(PD-L1)的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链互补决定区CDR1包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体；重链互补决定区CDR2包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体；重链互补决定区CDR3包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区CDR1’包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区CDR2’包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区CDR3’包含SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链互补决定区选自以下组合：(1)CDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其等同变体；和(2)CDR1包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR3包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链互补决定区选自以下组合：(1)CDR1’包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其等同变体，以及CDR3’包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或其等同变体，和(2)CDR1’包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其等同变体，CDR2’包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或其等同变体，以及CDR3’包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其进一步包含：重链框架区FR1，其包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体；重链框架区FR2，其包含SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体；重链框架区FR3，其包含SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体；重链框架区FR4，其包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链框架区FR1’，其包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链框架区FR2’，其包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同 变体；轻链框架区FR3’，其包含SEQ ID NO:39或SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体；和轻链框架区FR4’，其包含SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的双功能分子，其中所述抗体或其抗原结合片段的框架区选自以下组合：(1)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR3’包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其等同变体；和(2)重链框架区FR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR2包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR3包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其等同变体，重链框架区FR4包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR1’包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR2’包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR3’包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链框架区FR4’包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体；轻链可变区包含SEQ ID NO:53或SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中可变区选自以下组合：(1)重链可变区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列或其等同变体；和(2)重链可变区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链可变区包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链恒定区包含SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链恒定区包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO:60或SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其序列选自以下组合：(1)重链包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列或其等同变体；和(2)重链包含SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列或其等同变体，轻链包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列或其等同变体。
- 根据权利要求19所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自PD-L1抗体的scFv、(scFv)2、Fab、Fab′或F(ab′)2。
- 一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含权利要求19至28中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
- 一种治疗对象中的癌症的药物组合物，其包含权利要求19至28中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段以及第二治疗剂。
- 根据权利要求29或30所述的药物组合物，其中所述癌症选自胃癌、肺癌、肝癌、肝内胆管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、肾癌、尿道上皮细胞癌、乳腺癌、子宫颈癌、头颈鳞状细胞癌、鼻咽癌、食管癌、膀胱癌、肾细胞癌、皮肤癌和口腔鳞状细胞癌。
- 一种编码权利要求19至28中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
- 一种包含权利要求32所述的核苷酸序列的载体。
- 一种含有权利要求33所述载体的非人类的宿主细胞。
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