CN116997650A - 用于脂肪酶固定化的聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了酶颗粒，这些酶颗粒包含固定化1,3特异性脂肪酶和苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。这些颗粒适于甘油三酯的酶促酯交换，以及通过过滤对该酶和甘油三酯的后续分离。

Description

用于脂肪酶固定化的聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒
序列表的引用
本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于对位置上是1,3位点特异性的脂肪酶进行固定化的聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒。所得脂肪酶颗粒可用于在酶促酯化/酯交换中制备对称的甘油三酯。
背景技术
脂肪分解酶的固定化已知多年。固定化酶产品可用于有机化合物的酶促改性，例如有机合成过程、植物油的酯交换、生物柴油生产等。
酶的固定化是酶蛋白附着在载体上，酶固定在该载体上，但仍具有功能，其中酶不会释放到与其接触的液体中(洗出)。最常见的固定化酶是用于异构化反应的葡萄糖异构酶，以及用于例如植物油的酯交换和有机合成的脂肪酶。
对于在非水溶液中使用，脂肪酶可以通过使脂肪酶水溶液吸收到载体的孔隙体积中，或通过吸附到载体表面，或通过吸附和吸收两者的组合然后通过干燥去除水而固定在许多不同的多孔无机载体上。
JP 5-292965A披露了一种固定化脂肪酶及其制备方法。
WO 95/22606描述了基于制粒工艺的固定化方法。
WO 99/33964描述了一种固定化方法，其中将酶施加到微粒状多孔载体上。
已知固定化酶可用于多种工业应用中的连续和分批酶促反应中，这些工业应用包括废水处理、药物生产、高果糖玉米糖浆生产、植物油加工和化学品合成。
发明内容
在第一方面中，本发明提供了(多种)酶颗粒，这些酶颗粒包含
(a)50％-99％w/w的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物；以及
(b)具有1％-20％w/w活性酶蛋白的1,3位点特异性脂肪酶；
其中该1,3特异性脂肪酶与SEQ ID NO:1具有至少80％的氨基酸序列同一性。
在本发明的另一个方面，提供了用于酶促酯化或酯交换的方法，这些方法包括使游离脂肪酸/醇或甘油三酯的混合物与本发明的酶颗粒接触。
本发明的其他方面和实施例从说明书和实例是显而易见的。
除非另外指明，或者从上下文中可以明显看出其他含义，否则所有百分比都是按重量计的百分比(％w/w)。
具体实施方式
已发现苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物提供了用于固定化1,3-特异性脂肪酶(例如米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶)的有利的聚合物支持物。固定化1,3-特异性脂肪酶对于生产对称的甘油三酯具有出乎意料的良好性能。
基于聚甲基丙烯酸酯的颗粒广泛用于通过吸附来固定脂肪酶，因为这些材料对脂肪酶具有高亲和力。同样，聚苯乙烯不被认为是特别适合于这种类型的脂肪酶固定化的材料，因为其具有较低的亲和力，因此对脂肪酶的吸附性较低。这是令人遗憾的，因为与相对昂贵的甲基丙烯酸吸附剂相比，聚苯乙烯是相对便宜的材料。
我们特此建议使用低成本的基于聚苯乙烯的聚合物支持物用于对1,3-特异性脂肪酶进行固定化。这种材料具有较大的孔，允许酶渗透到颗粒中，并且同样为随后的酶促反应提供良好的传质条件，以及由于材料的高疏水性而提供有利的无水条件。在对称的甘油三酯(如硬脂酸-油酸-硬脂酸甘油三酯和油酸-棕榈酸-油酸甘油三酯)的生产过程中，这种益处尤其明显。
脂肪酶催化的脂肪/油的酯交换的用途是成熟的。反应在高度为1-5米，填充有典型粒度为300-1200μm的固定化酶的柱中进行，其中将油泵送通过一组柱，总保持时间是达到一定转化率所需的。
使用本发明的基于聚苯乙烯的聚合物支持物的一个非常理想的特性是固定化脂肪酶颗粒的机械强度提高。当脂肪酶颗粒填充在高的柱中时，柱底部的颗粒将暴露于上面颗粒的累积重量中。这可能导致底部的颗粒坍塌，从而减少通过柱的油流量。与基于甲基丙烯酸酯的聚合物支持物相比，由基于聚苯乙烯的聚合物支持物制成的颗粒特别坚固。由于其疏水性，与亲水性材料如基于甲基丙烯酸酯的聚合物支持物相比，基于聚苯乙烯的聚合物支持物还对溶胀具有高度抗性。固定化脂肪酶颗粒的溶胀也导致通过柱的油流量减少。
除非另外指明，否则贯穿本申请所有的百分比表示为重量百分比(％w/w)。
酶颗粒
本发明的颗粒由固定化的位置上是1,3位点特异性的脂肪酶和聚合物材料组成，该聚合物材料包含苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物或由其组成。这些颗粒可以包封在油或脂肪中；例如以形成油性粉末或浆液/悬浮液。
颗粒优选是多孔的。孔隙体积可以对应于每克颗粒至少0.5克油，特别是每克颗粒至少1克油的吸油量。其表面积可以是5-1000m2/g、10-1000m2/g，特别是10-700m2/g，更特别是10-500m2/g。
颗粒的基于体积的粒度(D50)可以是200-1200μm，优选200-1000μm，且更优选300-900μm。粒度是用激光衍射粒度分析仪测量的。
这些颗粒可包含量超过60％w/w，优选地超过80％w/w的聚合物材料。
为了使成品具有低粉尘特性和/或与使用该产品的过程(例如，酯交换过程)的相容性提高，可以将所得颗粒喷油，或与油掺混以获得将颗粒包封在油中的油性粉末或浆液/悬浮液。油可以是植物来源的油，例如向日葵油或与使用这些颗粒的过程相容的另一种油。如果仅使用少量的油，则颗粒可以聚集成较大颗粒，从而可以大大减少粉尘量。油封颗粒也可以随后干燥。
也可以将颗粒喷洒脂肪或与脂肪掺混，以产生含有脂肪和小颗粒的固体块，或者通过挤出和制粒设备进行加工以获得大团粒，这些大团粒也可以包含添加的脂肪作为“媒介物”。随后可以用防腐剂，例如粉末状防腐剂包覆这样的颗粒。
粉尘定义为空气动力学直径小于50μm的颗粒。在气溶胶科学中，人们一般认为空气动力学直径高于50μm的颗粒通常不会保持在空气中很长时间。在此上下文中，空气动力学直径定义为“在平静的空气中与所讨论的颗粒具有相同的终端沉降速度(不管它的几何尺寸、形状和真密度如何)的密度为1g/cm3的假设球体的直径”(WHO，1997)。
脂肪酶
根据本发明的待固定化的脂肪酶是位置上是1,3位点特异性的脂肪酶(sn-1,3-特异性脂肪酶)，其根据酶分类号EC 3.1.1.3(三酰基甘油脂肪酶)分类。
用于在本发明中使用的位置上是1,3位点特异性的脂肪酶的实例包括米黑根毛霉脂肪酶(还参见WO 2015/181119)、米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶、戴尔根霉(Rhizopusdelemar)脂肪酶、樟绒枝霉(Malbranchea cinnamomea)脂肪酶(还参见Biotechnol ApplBiochem[生物化学生物技术应用],63(4),第471-478页(2016))、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶、及其具有超过80％的氨基酸序列同一性的变体(表现出1,3位点特异性脂肪酶活性)。
在实施例中，脂肪酶是米黑根毛霉脂肪酶，或其与SEQ ID NO:1具有超过80％(或超过90％或95％)的氨基酸序列同一性的变体。在优选的实施例中，脂肪酶是米黑根毛霉脂肪酶，例如SEQ ID NO:1。
在本发明的实施例中，酶颗粒包含量为1％-20％w/w的活性酶蛋白的1,3位点特异性脂肪酶。在另一个实施例中，酶颗粒包含量为1％-20％w/w的活性酶蛋白的1,3位点特异性脂肪酶。在特定实施例中，酶颗粒包含量为1％-10％w/w的活性酶蛋白的1,3位点特异性脂肪酶。
活性酶蛋白在本文定义为表现出脂肪酶活性的一种或多种脂肪酶蛋白的量。这可以使用基于活性的分析酶测定来确定。在这样的测定中，酶典型地催化产生有色化合物的反应。有色化合物的量可以测量且与活性酶蛋白的浓度相关。该技术是本领域熟知的。
1,3位点特异性脂肪酶催化从位置2到位置1或3的自发酰基转移。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。为了使Needle程序报告最长同一性，必须在命令行中指定nobrief选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：
(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。
聚合物材料
本发明的颗粒包含苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，其为1,3位点特异性脂肪酶的吸附提供了疏水性表面。
苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物还可包含其他单体的残基，像甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸十八酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯和丙烯酸十八酯。
在实施例中，共聚物包含超过90％w/w的苯乙烯和二乙烯基苯残基(单元)。优选地，共聚物由苯乙烯和二乙烯基苯残基组成。
在实施例中，苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含比率为100:1至2:1、优选地比率为50:1至3:1；以及更优选地比率为20:1至3:1的苯乙烯和二乙烯基苯残基。
聚合物可以以多孔材料(例如多孔聚合物基质或多孔聚合物珠粒)的形式提供。
这样的多孔材料可以具有至少50％w/w，优选地至少80％w/w，更优选地至少90％w/w的共聚物含量。更优选地，该材料由苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物组成。该材料具有的平均粒度在200至1000μm，例如300至900μm的范围内。
在优选的实施例中，疏水聚合物作为由具有平均粒度范围为200-1000μm的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物组成的多孔颗粒提供。
本发明的酶颗粒可以包含量为50％-99％w/w、优选80％-99％w/w的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
颗粒的用途
根据本发明，包含固定化1,3位点特异性脂肪酶的颗粒在各种酶促过程中，例如在生产药物、特殊商品化学品和植物油加工中具有潜在应用。
在本发明的上下文中制备的固定化酶可以用于有机物质的水解、合成或改性。水解、合成或改性优选在基本上不含游离水的介质中进行。
因此，本发明涵盖对有机化合物进行酶促改性的方法，该方法包括在反应介质中使所述有机化合物与根据本发明的固定化酶产品接触。
本发明的固定化酶可用于有机化合物的酶促改性，包括在反应介质中使所述有机化合物与通过本发明的方法产生的固定化酶接触。
在本发明的特定实施例中，改性是酯化反应，其包括使是羧酸的第一反应物和是醇的第二反应物与本发明的固定化脂肪酶接触。羧酸可以选自但不限于由以下各项组成的组：脂肪酸、乳酸、苯甲酸、丙烯酸和甲基丙烯酸，并且醇可以选自但不限于由以下各项组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、多元醇(例如甘油)、山梨糖醇、异山梨醇、木糖醇、葡糖苷(例如乙基和甲基葡糖苷)、新戊醇和丙二醇。
改性可以是手性拆分，包括羧酸酯或酰胺的对映异构体选择性合成或水解；两种醛之间的羟醛缩合反应；或通过固定化酶原位产生的过氧化羧酸对烯基的环氧化作用。
改性可以是聚酯化反应，其中待改性的有机化合物是羟基羧酸或这样的化合物例如乳酸或3-羟基丙酸的低聚物。或者羧酸是选自由以下各项组成的组的二羧酸：己二酸、琥珀酸、富马酸、2,5-呋喃二羧酸、葡糖二酸、对苯二甲酸和间苯二甲酸，第二反应物选自由以下各项组成的组：多元醇例如1,4-丁二醇、1,6-己二醇、甘油、山梨糖醇、异山梨醇、新戊醇或丙二醇。
在另一个特定实施例中，改性是开环聚合反应，包括使内酯与通过本发明方法产生的固定化脂肪酶接触。制备的聚合物可以是均聚物或杂聚物。
改性可以是酯基转移反应，包括使是羧酸酯的第一反应物和是醇的第二反应物与通过本发明方法产生的固定化脂肪酶接触。
改性可以是酯交换反应，包括使是羧酸酯的第一反应物和是第二羧酸酯的第二反应物与通过本发明方法产生的固定化脂肪酶接触。在更特定实施例中，改性是酯交换反应，包括使是多元羧酸酯的第一反应物和是第二多元羧酸酯的第二反应物与本发明的固定化脂肪酶接触。
通过两种不同的脂肪/油的酯交换，由酯交换引起的脂肪酸位置的变化将会影响油/脂肪混合物的熔融曲线。这是通过NMR测量的并且表示为在10℃-40℃典型范围内的给定温度下固体脂肪的百分比。组分的实例是椰子脂和棕榈硬脂。
羧酸酯可以选自但不限于由脂肪酸、乳酸、葡糖二酸、苯甲酸、丙烯酸、甲基丙烯酸的烷基酯组成的组，其中烷基可以是甲基、乙基、丁基，并且醇可以选自但不限于由以下各项组成的组：甲醇、乙醇、异丙醇、多元醇(例如甘油)、烷基葡糖苷(例如乙基葡糖苷或甲基葡糖苷)、山梨糖醇、硅酮和硅酮衍生物、异山梨醇、新戊醇和丙二醇。
改性可以是产生对映体纯化合物的水解或合成；酰胺化反应，其包括使是羧酸的第一反应物和是胺的第二反应物与本发明的固定化脂肪酶接触。
在特定实施例中，改性是环氧化反应，其包括用本发明方法产生的固定化酶原位产生环氧化剂。
在本发明的实施例中，固定化脂肪酶用于在基本上不含游离水的介质中进行酯化、酯基转移或酯交换过程。酯基转移可用于脂肪酸取代，包括使第一反应物和第二反应物与所述固定化脂肪酶接触，由此发生取代反应。
第一反应物可以是脂肪酸酯，优选甘油三酯或甘油三酯混合物。
第二反应物可以是不同于第一反应物的另一脂肪酸酯，优选甘油三酯或甘油三酯混合物。此外，第二反应物可以是醇或游离脂肪酸。
在本发明的此优选实施例中介质包含有机溶剂，或其可以基本上由甘油三酯组成。
本发明的所述用途可以应用于食品例如人造黄油或可可脂替代品的生产，例如用于生产用于例如化妆品、生物燃料等的酯类。
方法
本发明还提供了进行由本发明的1,3位点特异性脂肪酶颗粒催化的反应的方法，该方法包括：
a)制备包含用于反应的反应物的反应混合物，并且
b)在有效进行反应的条件下使反应混合物与固定化1,3位点特异性脂肪酶颗粒接触。
该接触可以通过使反应混合物通过固定化1,3位点特异性脂肪酶填充床柱、保持固定化脂肪酶的连续搅拌釜反应器、其中固定化酶填充床的移动与反应混合物并流或逆流的移动床反应器，在分批反应器中，任选在搅拌下进行或在任何其他类型的反应器或其中可以进行所需反应的反应器的组合中进行。
反应物可以包含脂肪酰基供体和醇，并且反应可以形成脂肪酸烷基酯。
反应物可以包含至少两种甘油三酯，并且反应可以形成不同的甘油三酯。因此，反应可以进行足以改变甘油三酯混合物的熔融特性的时间。
进一步通过以下编号的实施例来描述本发明：
实施例1.一种(多种)酶颗粒，其包含
(a)50％-99％w/w的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物；以及
(b)来自酶分类EC 3.1.1.3，具有1％-20％w/w活性酶蛋白的1,3特异性脂肪酶。
实施例2.如实施例1所述的酶颗粒，该酶颗粒包含量为80％-99％w/w的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
实施例3.如实施例1-2中任一项所述的酶颗粒，其中苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含比率为100:1至2:1的苯乙烯和二乙烯基苯单元。
实施例4.如实施例1-3中任一项所述的酶颗粒，其中苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含比率为50:1至3:1的苯乙烯和二乙烯基苯单元。
实施例5.如实施例1-4中任一项所述的酶颗粒，其中苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含比率为20:1至3:1的苯乙烯和二乙烯基苯单元。
实施例6.如实施例1-5中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒包含量为1％-15％w/w的活性酶蛋白的1,3特异性脂肪酶。
实施例7.如实施例1-6中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有5-1000m2/g的表面积。
实施例8.如实施例1-7中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有10-750m2/g的表面积。
实施例9.如实施例1-8中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有对应于每克颗粒至少0.5克油，特别是每克颗粒至少1克油的吸油量的孔隙体积。
实施例10.如实施例1-9中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有0.05-0.1μm的平均孔径。
实施例11.如实施例1-10中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有0.1-0.5μm的平均孔径。
实施例12.如实施例1-11中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒的平均直径为200-1200μm。
实施例13.如实施例1-12中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒的平均直径为200-1000μm。
实施例14.如实施例1-13中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒的平均直径为300-900μm。
实施例15.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是根毛霉属(Rhizomucor)脂肪酶。
实施例16.如实施例1-15中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是米黑根毛霉脂肪酶。
实施例17.如实施例1-16中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶与SEQID NO:1具有至少60％的氨基酸序列同一性。
实施例18.如实施例1-17中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶与SEQID NO:1具有至少80％的氨基酸序列同一性。
实施例19.如实施例1-18中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶与SEQID NO:1具有至少90％的氨基酸序列同一性。
实施例20.如实施例1-19中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶与SEQID NO:1具有至少95％的氨基酸序列同一性。
实施例21.如实施例1-20中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
实施例22.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是根霉属(Rhizopus)脂肪酶。
实施例23.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是米根霉脂肪酶。
实施例24.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是嗜热霉属(Thermomyces)脂肪酶。
实施例25.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。
实施例26.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是畸枝霉属(Malbranchea)脂肪酶。
实施例27.如实施例1-14中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是樟绒枝霉脂肪酶。
实施例28.如实施例1-27中任一项所述的酶颗粒，其中该苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含超过90％的苯乙烯和二乙烯基苯单元。
实施例29.如实施例1-28中任一项所述的酶颗粒，其中该苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物由苯乙烯和二乙烯基苯单元组成。
实施例30.一种粉末或浆液/悬浮液，该粉末或浆液/悬浮液包含如实施例1-29中任一项所述的酶颗粒和至少10％的油或脂肪。
实施例31.一种用于酶促酯交换的方法，该方法包括使甘油三酯和一种或多种游离脂肪酸或一种或多种游离脂肪酸酯的混合物与如实施例1-29中任一项所述的酶颗粒接触。
实施例32.一种用于酶促酯化的方法，该方法包括使羧酸和醇与如实施例1-29中任一项所述的酶颗粒接触；优选地该反应在柱中进行。
实施例33.如实施例32所述的方法，该方法是通过酶促酯化生产对称的甘油三酯的方法。
实施例34.如实施例1-29中任一项所述的酶颗粒在酯化反应中的用途，该用途包括使羧酸和醇与酶颗粒接触以生产对称的甘油三酯，优选地该反应在柱中进行。
实例
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应该解释为限制本发明的范围。
化学品是至少试剂级的商品。米黑根毛霉脂肪酶具有SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列。
实例1
米黑根毛霉脂肪酶的固定化通过在吸附步骤使用相同的酶浓度(每克载体材料中添加的活性酶蛋白的克数)吸附在两种类型的颗粒/载体上来进行。该两种类型的颗粒/载体是：
(a)大孔聚苯乙烯树脂/吸附剂(与二乙烯基苯的共聚物)，以及
(b)甲基丙烯酸树脂/吸附剂(与二乙烯基苯的共聚物)。
该方法是本领域技术人员普遍使用和熟知的。简言之，将液体脂肪酶浓缩物与固体载体材料混合并允许与该载体材料保持接触1-2天。
过滤之后，用水洗涤，将产生的固定化酶颗粒(分别在苯乙烯/二乙烯基苯和甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯上的脂肪酶)从含有残余未吸附酶的上清液中分离并干燥。
测量上清液中残余酶的量，并且其表明在甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯颗粒上的固定化明显更有效，在上清液中产生了5-10倍更低浓度的残余酶。因此，吸附在苯乙烯/二乙烯基苯颗粒上的酶的量显著低于吸附在甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯颗粒上的量。将上清液中未吸附的酶回收。
使用该两种类型的固定化酶颗粒来进行甘油三酯(三油酸甘油酯，OOO)和硬脂酸之间的酯交换反应，以产生对称的甘油三酯(硬脂酸-油酸-硬脂酸甘油三酯，SOS)。
该反应通过使固定化酶与反应物在固定床反应器中接触进行。反应在75℃下进行，通过将反应物(55％/45％的硬脂酸：甘油三酯混合物)持续进料至反应器中，并通过气相色谱法测量反应器出口的组合物(产品流)中SOS和SSS的浓度。
简言之，用于制备进料共混物的程序和pH的调整如下：
1.将硬脂酸在瓶中在85℃烘箱/水浴中加热(约3小时)。
2.添加高油酸向日葵油并在盖紧前将瓶用氮气吹扫。
3.在75℃烘箱/水浴中重新孵育油共混物(约1小时)。
4.使用高剪切混合器以24000rpm混合油共混物30秒。
5.在高剪切混合时添加苛性碱(防止凝固)。
6.储存在盖好的瓶中并用氮气覆盖。
发现聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒的性能至少与甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯颗粒的性能一样好，如通过SOS产物和SSS副产物的形成所测量的。使用这两种类型颗粒的酯交换反应产生>25％的SOS和约1％-1.1％的SSS。
由于这两种类型的颗粒的性能相同，苯乙烯/二乙烯基苯固定化脂肪酶的性能优于通常使用的甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯固定化脂肪酶约5-10倍。
实例2
反应使用实例1中使用的两种类型的固定化脂肪酶颗粒进行。反应在75℃下于列模式中(持续的)，在以下条件下进行：
2g的固定化酶(干燥包装)；
由重量比率为55:45的硬脂酸:高油酸向日葵油组成的油共混物；以及
添加水和200ppm NaOH(4N)+0.1％。
测量向SOS(硬脂酸-油酸-硬脂酸)和SSS(硬脂酸-硬脂酸-硬脂酸)的转化率。
在油共混物流速为3g/g/h时，对于聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒，向SOS(希望产物)的转化率保持增高，而SSS(不希望副产物)保持恒定；而对于甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯颗粒，向SSS的转化率以与SOS相同的速率保持增高。
结果显示使用相同类型的固定化脂肪酶，聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒对SOS具有希望的选择性。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 用于脂肪酶固定化的聚苯乙烯/二乙烯基苯颗粒
<130> 15279-WO-PCT
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）
<400> 1
Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu
1 5 10 15
Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val
20 25 30
Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp
35 40 45
Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala
50 55 60
Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg
65 70 75 80
Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro
85 90 95
Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu
100 105 110
Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp
115 120 125
Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser
130 135 140
Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Asp Leu Tyr Gln Arg
145 150 155 160
Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln
165 170 175
Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly
180 185 190
Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu
195 200 205
Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile
210 215 220
Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu
225 230 235 240
Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp
245 250 255
His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr
260 265

Claims (15)

1.一种酶颗粒，该酶颗粒包含：
(a)50％-99％w/w的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物；以及
(b)来自酶分类EC 3.1.1.3，具有1％-20％w/w活性酶蛋白的1,3特异性脂肪酶；
其中该1,3特异性脂肪酶与SEQ ID NO:1具有至少80％的氨基酸序列同一性。
2.如权利要求1所述的酶颗粒，该酶颗粒包含量为80％-99％w/w的该苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物。
3.如权利要求1或2所述的酶颗粒，其中该苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含比率为100:1至2:1、优选地比率为50:1至3:1的苯乙烯和二乙烯基苯单元。
4.如权利要求1-3中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒包含量为1％-15％w/w的活性酶蛋白的1,3特异性脂肪酶。
5.如权利要求1-4中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有5-1000m2/g的表面积；优选地10-750m2/g的表面积。
6.如权利要求1-5中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有0.05-0.1μm的平均孔径；优选地0.1-0.5μm的平均孔径。
7.如权利要求1-6中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒具有对应于每克颗粒至少0.5克油，特别是每克颗粒至少1克油的吸油量的孔隙体积。
8.如权利要求1-7中任一项所述的酶颗粒，该酶颗粒的平均直径为200-1200μm；优选地平均直径为300-900μm。
9.如权利要求1-8中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶是根毛霉属脂肪酶，优选地米黑根毛霉脂肪酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶与SEQ ID NO:1具有至少90％的氨基酸序列同一性；优选地与SEQ ID NO:1具有至少95％的氨基酸序列同一性。
11.如权利要求1-10中任一项所述的酶颗粒，其中该1,3特异性脂肪酶具有如SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列。
12.如权利要求1-11中任一项所述的酶颗粒，其中该苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物包含超过90％的苯乙烯和二乙烯基苯单元；优选地由苯乙烯和二乙烯基苯单元组成。
13.一种粉末或浆液/悬浮液，该粉末或浆液/悬浮液包含如权利要求1-12中任一项所述的酶颗粒和至少10％的油或脂肪。
14.一种用于酶促酯交换的方法，该方法包括使甘油三酯和一种或多种游离脂肪酸或游离脂肪酸酯的混合物与如权利要求1-12中任一项所述的酶颗粒接触。
15.如权利要求1-12中任一项所述的酶颗粒在酯化反应中的用途，该用途包括使羧酸和醇与该酶颗粒接触以生产对称的甘油三酯；优选地该反应在柱中进行。
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