CN116983322A - 用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌和结直肠癌的小核酸干扰药物 - Google Patents
用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌和结直肠癌的小核酸干扰药物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌和结直肠癌的小核酸干扰药物。本发明针对肿瘤相关的2个靶点(GPC3和TGF‑β1)，设计并筛选出双靶点GPC3/TGF‑β1小核酸干扰药物组合物，其包括活性成分和药学上可接受的递送载体，所述的活性成分包括靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF‑β1基因的siRNA分子或其组合物。实验数据表明，靶向GPC3单药或GPC3和TGF‑β1联合的小核酸药物可以有效敲降多类肿瘤细胞中相关靶基因的表达水平，并在体内肿瘤模型(肺癌，胰腺癌)中显示出相应的抑制肿瘤生长的效果，在肿瘤治疗领域表现出潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌和结直肠癌的小核酸干扰药物。
背景技术
肺癌、胰腺癌、肝癌和结直肠癌:发病率和治疗
肺癌(Lung cancer,LC)是一类世界范围常见的癌症类型。肺癌主要分为小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)，其中约85％为NSCLC；而NSCLC中约55％为肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUAD)，约25％为肺鳞癌(Lung Squamous Cell Carcinoma，LUSC)，其余为大细胞癌。
早期的NSCLC主要依靠手术治疗，但多数NSCLC患者初诊时已是中晚期，只能以化疗药物或放疗为主；SCLC主要依靠联合化疗或者结合放疗。以酪氨酸激酶抑制剂(TyrosineKinase Inhibitor，TKI)为代表的靶向药物正在逐渐取代传统化疗药物成为一线药物，但是此类药物最大的问题就是其耐药性，目前已知的靶向EGFR的第一、二、三代TKI均出现了耐药性；2021年FDA批准的三款药物也只针对有限的病人类型，如MET外显子突变的晚期NSCLC患者，或PD-L1高表达(肿瘤比例评分[TPS]>50％)，且无EGFR，ALK或ROS1突变的晚期NSCLC患者，或ALK阳性的转移性非小细胞肺癌患者；2022年3月份，FDA首次批准了一个新辅助治疗疗法，Nivolumab(Opdivo，百时美施贵宝公司，中文名为：纳武利尤单抗，PD-1单抗)联合铂类双药化疗，用于新辅助治疗中可手术切除的NSCLC成年患者。目前鉴于靶向治疗的耐药性及传统放化疗疗法对患者生活质量影响巨大等缺点，急需开发新类型药物用于治疗NSCLC患者，并不会影响患者生活质量。
胰腺癌是常见消化道恶性肿瘤之一，有“癌症之王”的称号，有数据表明，胰腺癌患者确诊后的五年生存率仅为约10％，是预后最差的肿瘤之一。2021年统计数据显示，在美国所有癌症中，胰腺癌发病率占男性第10位，女性第9位，死亡率为第4位。虽然随着近年来医学、影像学、病理学等学科的发展，胰腺癌诊断水平有所提高，但是目前治疗手段仍极其有限，主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、介入治疗和最佳支持治疗等。手术仍是目前治疗胰腺癌的首选治疗技术，也是普遍认为最为有效的治疗手段，如胰十二指肠切除术；非手术治疗技术以放疗、化疗、靶向治疗等为主，是临床治疗胰腺癌的常用手段。目前针对胰腺癌治疗的特殊挑战在于它对常规放射疗法、化学疗法和其他局部区域疗法具有天然抗性。而新兴免疫治疗手段包括过继性T细胞疗法(ACT)、免疫检查点抑制剂(ICIs)和癌症疫苗虽然也有巨大潜力，但是由于技术规模扩大和标准化的挑战，其应用也受到严重限制。
肝癌一般分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是高发癌种且危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵袭至肝脏。目前的主要治疗手段为手术、放化疗、生物治疗及中医中药治疗。
结直肠癌在2020年全球各种恶性肿瘤的发病率中位居第三位，全世界有超过193万人被新确诊为结直肠癌，占全球新确诊癌症人数的9.7％。导致患者发生死亡的主要原因就是癌症发生侵袭和转移。由于缺乏早期诊断与高效的筛查方法，大多数患者确诊时已发展至晚期或局部晚期，预后较差。肿瘤转移的步骤比较多，而且是多阶段性的，涉及的基因也比较多，其过程比较复杂。比如肿瘤在原发部位发生了脱离，和周围的基质相互融合，肿瘤细胞进入循环系统以及淋巴系统，在内皮细胞壁处粘附，逐渐外延至血管，发生了血管增生的现象，最终导致新的转移灶的形成。而根据2021年中国临床肿瘤学会(CSCO)发布的结直肠癌临床诊疗指南2021，目前针对结直肠癌的治疗，仍是以比较传统的手术治疗为主，并行辅助化疗，单抗治疗(如西妥昔单抗(靶向EGFR)，贝伐珠单抗(靶向VEGF))等，而针对术后复发型病人只能采用奥沙利铂等化疗或姑息治疗。目前尚无较好的双靶点联合靶向治疗手段。
TGFβ
转化生长因子-β(transforming growth factorβ，TGF-β)信号通路在体内有着复杂的机制作用，在晚期癌症中，TGF-β和癌细胞增殖、免疫抑制、血管生成及肿瘤微环境均有关联。在一项肺癌研究中，研究者发现腺泡型肿瘤中TGF-β通路高度激活，抑制该信号通路可抑制腺泡细胞肿瘤的形成。也有研究表名，非同源末端连接(NHEJ)通路1(nonhomologousend joining(NHEJ)pathway 1，LINP1)中lncRNA的转录被TGF-β1以SMAD4依赖性方式抑制，且LINP1抑制肺癌细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，是癌症转移过程中肿瘤细胞迁移、侵袭和干性获得的关键细胞内在特性)，从而控制癌细胞的迁移、侵袭和无干细胞化。此外还有研究表明，在KRAS突变的NSCLC中，KRAS G12V突变可通过TGF-β/EMT信号通路诱导PD-L1表达并促进免疫逃逸，因此靶向TGF-β/EMT信号通路为携带KRAS突变的NSCLC患者提供潜在的治疗方法。
在包括HCC在内的多种癌症中，TGF-β均同时扮演着肿瘤抑制因子和肿瘤促进因子的双重作用。配体与TGF-β受体的结合激活其激酶活性，导致SMAD蛋白和衔接蛋白(如b2-Spectrin)的磷酸化。一旦被磷酸化，SMAD蛋白就会形成异二聚体，这些异二聚体易位到细胞核中，即会调节纤维化相关基因(E-钙粘蛋白、整合素和胶原蛋白)的表达。除了SMAD级联反应，TGF-β还可以激活多种途径，例如MAPK或PI3K等。对488例病患HCC队列基因组分析中，40％的病例显示了TGF-β信号通路的基因组改变。随后对与呈现激活TGF-β的患者相关的通路的评估表明，激活的特征富含调节胶原合成、生长因子、细胞因子和基质金属蛋白酶的基因，展示出微环境的激活反应。
目前已有多项阻断TGF-β信号转导的治疗策略已开展临床试验，GSK、默克、辉瑞、礼来、赛诺菲、诺华等国际制药巨头纷纷布局，相关临床试验结果也表明，阻断TGF-β在治疗晚期非小细胞肺癌、胃癌、HPV相关宫颈癌、三阴性乳腺癌、前列腺癌和胆管癌等难治性癌症安全有效。
GPC3
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Gypican-3，GPC3)是硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparansulfate proteoglycan，HSPG)家族中的一员。是一种由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定在细胞膜上的HSPG糖蛋白。GPC3在正常胚胎组织中(包括肝脏和胎盘)高表达，而在成年人正常组织中表达非常低或不表达。大量研究发现，GPC3在肝癌组织中特异性高表达，与肝癌的预后有密切关系。相关研究表明，GPC3在卵巢癌、间皮瘤和乳腺癌中低表达；GPC3的上调显著抑制了乳腺癌细胞的增殖和转移，说明GPC3在乳腺癌中起到抑癌基因的作用。相反，GPC3在其他肿瘤中高度表达，例如HCC、Wilms肿瘤和神经母细胞瘤、肝母细胞瘤和黑色素瘤，以及肺SCC。然而，目前关于GPC3在肺癌中的表达模式尚有争议，有些研究认为NSCLC中的GPC3低于癌旁组织或正常肺组织；另外的研究则认为GPC3在肺腺癌(Lung adenocarcinoma，LUSC)中过度表达，但在肺鳞状细胞癌(Lung squamous cell carcinoma，LUAD)中低表达或无表达。目前的通路研究表明，β-catenin、GOLM1及FOXM1和GPC3通路有直接关系，且和NSCLC患者化疗敏感性、不良预后及肿瘤细胞侵袭有关。
总体来说，GPC3对肺癌发生发展的作用尚不明了，全球范围内尚无GPC3的靶向药物上市。针对GPC3蛋白的靶向治疗主要包括抗体、抗体-药物偶联物(ADC)、免疫毒素、肿瘤疫苗、靶向肽、嵌合抗原受体、基因治疗等。近年来，研究者们以GPC3为靶点进行了大量药物的研发和细胞治疗研究，其中有一些已经进入了临床试验，如GPC3人源化单克隆抗体GC33、GPC3多肽疫苗、以GPC3为靶点的嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)等。2021年美国临床肿瘤学会ASCO公布了首个靶向GPC3的4代CART疗法后线治疗肝癌的摘要，其疾病控制率为50％。这项研究首次报道了4G-CAR-GPC3 T细胞单独或与TKIs联合治疗具有可管理的安全性，同时对接受过多种治疗的晚期HCC患者显示了潜在的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌或结直肠癌中的一种或多种的小核酸干扰药物。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌或结直肠癌中的一种或多种的小核酸干扰药物，所述的小核酸干扰药物包括能够靶向GPC3单靶点的小核酸分子，或所述的小核酸干扰药物包括能够靶向GPC3和TGF-β1双靶点的小核酸分子组合物。
优选地，所述的小核酸分子或所述的小核酸分子组合物中的小核酸分子的类型包括shRNA，ASO，siRNA，miRNA或lncRNA中的一种或多种。
进一步优选地，所述的能够靶向GPC3单靶点的小核酸分子为能够靶向并结合编码GPC3蛋白的mRNA并抑制其表达的siRNA分子。
进一步优选地，所述的能够靶向GPC3和TGF-β1双靶点的小核酸分子组合物包括能够靶向并结合编码GPC3蛋白的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够靶向并结合编码TGF-β1蛋白的mRNA并抑制其表达的siRNA分子。
优选地，所述的肺癌包括肺鳞癌、肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌；所述的胰腺癌包括胰头癌、胰体癌、胰尾癌、全胰癌、导管腺癌、腺泡细胞癌、浆液性囊腺癌、胰母细胞瘤、粘液性囊腺癌；所述的肝癌包括肝细胞肝癌、肝内胆管细胞癌、混合型肝癌及转移性肝癌；所述的结直肠癌包括升结肠癌、降结肠癌、横结肠癌、乙状结肠及直肠癌。
根据一些实施方式，靶向GPC3基因的siRNA分子为下列寡聚核苷酸中的一组或多组：靶向GPC3基因的siRNA分子为下列寡聚核苷酸中的一组或多组：
GPC3-009#正义链：GACGUGACCUGAAAGUAUU
GPC3-009#反义链：AAUACUUUCAGGUCACGUC；
GPC3-019#正义链：GAGCAAGACGUGACCUGAAAGUAUU
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GPC3-050#正义链：GACGUGACCUGAAAGUAUU
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GPC3-051#正义链：GACGUGACCUGAAAGUAUU
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GPC3-057#正义链：AGCAAGACGUGACCUGAAAGU
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GPC3-065#反义链：
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GPC3-067#正义链：GmAmCmGmUmGmAfCfCfUmGmAmAmAmGmUmAmUmUm
GPC3-067#反义链：AmAfUmAmCmUmUmUmCmAmGmGmUmCfAmCmGmUmCm。
根据一些实施方式，靶向TGF-β1基因的siRNA分子为下列寡聚核苷酸中的一组或多组：
TF1-013#正义链：CCCAAGGGCUACCAUGCCAACUUCU
TF1-013#反义链：AGAAGUUGGCAUGGUAGCCCUUGGG；
TF1-029#正义链：AACUAUUGCUUCAGCUCCAdTdT
TF1-029#反义链：UGGAGCUGAAGCAAUAGUUdTdT；
TF1-043#正义链：AmAmCmUmAmUmUfGfCfUmUmCmAmGmCmUmCmCmAmdTdT
TF1-043#反义链：UmGfGmAmGmCmUmGmAmAmGmCmAmAfUmAmGmUmUmdTdT；TF1-039#正义链：AmGmGmGmCmUmAmCmCfAfUfGmCmCmAmAmCmUmUmCmUm TF1-039#反义链：
AmGfAmAmGmUmUmGmGmCmAmUmGmGfUmAmGmCmCmCmUmUmGm。
其中，m表示碱基2'-OME修饰，f表示碱基2'-F修饰。
优选地，所述的小核酸干扰药物还包括药学上可接受的递送载体。
进一步优选地，所述的递送载体为药学上可接受的多肽聚合物、脂质载体或阳离子聚合物种的一种或多种。
再进一步优选地，所述的多肽聚合物包括组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物。
具体地，所述的递送载体为H3K4b类组氨酸-赖氨酸聚合物。
根据一些实施方式，所述的多肽聚合物包括为具有四个分子R的H3K4b，R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，简称HKP。
根据一些实施方式，所述的多肽聚合物包括具有四个分枝R1的H3K(+H)4b，R1＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK，简称HKP(+H)。
优选地，靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF-β1基因的siRNA分子的投料质量比为1:(0.8～1.2)，例如1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2。
优选地，所述的递送载体和所述的小核酸分子或所述的小核酸分子组合物中的小核酸分子的N/P值为2/1～6/1，例如2/1、3/1、4/1、5/1、6/1。
优选地，所述的小核酸干扰药物为纳米颗粒。
进一步地，所述的纳米颗粒的尺寸为50～200nm，例如50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm、150nm、155nm、160nm、165nm、170nm、175nm、180nm、185nm、190nm、195nm、200nm。
优选地，所述的小核酸干扰药物的剂型为冻干剂。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
本发明开发的GPC3单靶点小核酸干扰药物及GPC3和TGF-β1小核酸干扰药物能够有效抑制肿瘤生长且无明显毒副作用，可用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌和结直肠癌，具有很大的应用前景。
附图说明
图1为GPC3基因在人源细胞系和鼠源细胞系中的表达，其中A图显示了GPC3基因在人源细胞系中的表达，B图显示了GPC3基因在鼠源细胞系中的表达；
图2为siGPC3药物制剂的制备，左图为冻干制剂，右图为复溶制剂；
图3为不同递送载体包载siRNA后对靶基因的沉默效果；
图4为siGPC3药物制剂对小鼠肺癌细胞(A549)移植瘤体积增长的抑制效果；
图5为siGPC3药物制剂对小鼠肺癌细胞(A549)移植瘤重量增长的抑制效果；
图6为siGPC3药物制剂对A549荷瘤小鼠体重的影响；
图7为siGPC3+siTGF-β1药物制剂对小鼠肺癌细胞(A549)移植瘤体积增长的抑制效果；
图8为siGPC3+siTGF-β1药物制剂对小鼠肺癌细胞(A549)移植瘤重量增长的抑制效果；
图9为siGPC3+siTGF-β1药物制剂对A549荷瘤小鼠体重的影响；
图10为siGPC3+siTGF-β1药物制剂对小鼠胰腺癌细胞(PANC-1)移植瘤体积增长的抑制效果；
图11为siGPC3+siTGF-β1药物制剂对小鼠胰腺癌细胞(PANC-1)移植瘤重量增长的抑制效果；
图12为siGPC3+siTGF-β1药物制剂对PANC-1荷瘤小鼠体重的影响；
图13为siGPC3-212/siTGFβ1药物制剂对小鼠胰腺癌细胞(PANC-1)移植瘤体积增长的抑制效果；
图14为siGPC3-212/siTGFβ1药物制剂对PANC-1荷瘤小鼠体重的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
发明人经过大量的研究和实验验证，提出一种能够靶向肿瘤微环境靶点(GPC3)的单靶点小核酸干扰药物和同时靶向肿瘤微环境靶点(GPC3)和肿瘤转化转移相关靶点(TGF-β1)的双靶点小核酸干扰药物。
具体地，所述的小核酸干扰药物组合物包括活性成分和药学上可接受的递送载体，所述的活性成分包括靶向GPC3基因的siRNA分子，或同时包括靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF-β1基因的siRNA分子。
其中，靶向GPC3基因的siRNA序列，理论上是可以通过RNAi机制结合并降解靶细胞中的GPC3 mRNA，从而阻断其蛋白水平的翻译水平，进而起到抑制GPC3的蛋白表达情况。
靶向TGF-β1基因的siRNA序列，理论上是可以通过RNAi机制结合并降解靶细胞中的TGF-β1 mRNA，从而阻断蛋白水平的翻译水平，进而起到抑制TGF-β1的蛋白表达情况。
本发明采用一种内含若干参数条件的特定算法和编程，针对靶基因TGF-β1和GPC3，设计了一系列的siRNA序列，所述的靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF-β1基因的siRNA分子分别为长度为19～25个碱基对的寡核苷酸序列。
优选地，所述的靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF-β1基因的siRNA分子的长度分别为21～25个碱基对。
具体地，所述的递送载体为HKP或HKP(+H)。
具体地，通过PNP技术，将靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF-β1基因的siRNA分子包裹进HKP或HKP+H(组氨酸-赖氨酸多聚物)载体，制成纳米颗粒制剂。
具体地，所述的靶向GPC3基因的siRNA分子和所述的靶向TGF-β1基因的siRNA分子的投料摩尔比为1:0.8～1.2，活性成分和递送载体的N/P值为1/3～1/2。
本发明采用PNP技术包裹并导入靶向GPC3的siRNA的用药或导入联合靶向GPC3和TGF-β1(TF1)的siRNA联合用药能够显著抑制小鼠肺癌肿瘤和胰腺癌肿瘤生长，在治疗肺癌和胰腺癌方面显示出潜在的应用前景。
以下通过实施例具体阐述本发明的技术方案和技术效果。
本发明中，递送载体PNP技术参见专利：用于核酸治疗的可控偶联多肽纳米颗粒导入系统的组合物及方法(专利号：CN 112703196 A)。
实施例1：
针对两个靶点(GPC3和TGF-β1)设计siRNA序列
采用一种内含若干参数条件的特定算法和编程，针对靶基因GPC3和TGF-β1，设计了一系列的siRNA序列，包括25个碱基对、21个碱基对和19个碱基对长度的siRNA序列，具体见表1。这些序列的特征包括但不限于：针对基因编码序列、合理的热力学稳定性、较低的预期毒副作用等。靶向GPC3基因的siRNA序列，理论上是可以通过RNAi机制结合并降解靶细胞中的GPC3 mRNA，从而阻断其蛋白的翻译水平，进而起到抑制GPC3的蛋白表达情况。靶向TGF-β1基因的siRNA序列，理论上是可以通过RNAi机制结合并降解靶细胞中的TGF-β1mRNA，从而阻断蛋白的翻译水平，进而起到抑制TGF-β1的蛋白表达情况。
表1.靶向GPC3和TGF-β1的siRNA序列
实施例2：
体外筛选GPC3基因高表达的细胞系
利用QPCR方法对多种人源和鼠源细胞系进行GPC3基因表达情况的鉴定，GPC3基因在细胞系中的表达结果见图1，具体选用的候选细胞系包括人源(Homo，图1-A)：BxPC3，PANC-1，HepG2，Hep3B，SK-Hep-1，Huh7，A549，H292，H460，U87，Hela，KU7，MCF7，MDA-MB-231，HeyA8，sk-ov-3，ES-2，A431，DLD-1；鼠源(Mus，图1-B)：B16F0，B16F10，RM-1，DC24，PANC-02，MC38，4T1，RM-1，Hepa 1-6，LLC，ID8。选择Ct值小于30的候选细胞系用于进行后续体外筛选，根据图1所示结果，最终用于后续筛选的细胞系有：肝癌细胞系(HepG2，Hep3B和Hepa1-6)、乳腺癌细胞系(MCF7，MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(A549，H292)、人结直肠癌细胞系(DLD-1)和人胰腺癌细胞系(PANC-1，BxPC3)，图1中部分细胞系无柱形图标识，表明该细胞系中GPC3基因表达量极低，未达到QPCR检测范围。
实施例3：
体外筛选靶向GPC3基因的siRNA序列(细胞水平筛选)
针对GPC3靶基因，选用实施例2中筛选出的部分细胞系(Hep3B，Hepa1-6，MCF7，A549，DLD-1，PANC-1)进行siRNA的体外筛选工作。具体为采用转染试剂(Lipo2000)将20nM的GPC3 siRNA转染至细胞内，24h后收集细胞总RNA进行反转录并采用QPCR技术检测靶基因的mRNA表达水平，GPC3 siRNA对靶基因GPC3 mRNA表达水平初筛的敲低效果见表2。
表2.相关实验GPC3 siRNA初步筛选(GPC3 mRNA相对表达水平检测)
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备注：Hepa1-6为鼠源细胞系，仅进行人鼠同源序列的筛选。
根据表2，GPC3-006#和GPC3-007#对肝癌细胞系Hep3B中GPC3 mRNA的敲低效果超过80％；GPC3-009#，GPC3-029#和GPC3-032#对肝癌细胞系Hepa1-6中GPC3 mRNA的敲低效果也接近80％；而在肺癌A549细胞系和胰腺癌PANC-1细胞系中，大部分GPC3 siRNA序列都具有相似的较好的敲低效果；GPC3-019#、GPC3-023#和GPC3-028#对结直肠癌细胞系DLD-1中GPC3 mRNA的敲低效果超过70％；GPC3-003#和GPC3-009#对人源乳腺癌细胞系MCF7中GPC3mRNA的敲低效果超过70％。最终，根据敲低效果筛选获得了不同长度的GPC3siRNA作为候选序列，针对鼠源肝癌细胞系Hepa1-6筛选出序列为GPC3-009#、GPC3-029#和GPC3-032#；针对人肝癌细胞系Hep3B筛选出的序列为GPC3-006#、GPC3-007#和GPC3-019#；针对人源肺癌细胞系A549筛选出的序列为GPC3-002#、GPC3-006#、GPC3-009#、GPC3-017#、GPC3-019#、GPC3-020#、GPC3-023#、GPC3-027#、GPC3-031#、GPC3-032#、GPC3-039#和GPC3-043#；针对人胰腺癌细胞系PANC-1筛选出的序列为GPC3-007#、GPC3-008#、GPC3-009#、GPC3-019#、GPC3-020#、GPC3-031#和GPC3-032#；针对人结肠癌细胞系DLD-1筛选出的序列为GPC3-019#、GPC3-023#和GPC3-028#；针对人源乳腺癌细胞系MCF7筛选出的序列为GPC3-003#和GPC3-009#。
针对上述候选GPC3 siRNA进行EC50检测，以100nM作为高浓度实验组，进行5倍梯度稀释，设定7个浓度梯度实验组进行细胞转染，24h后收集细胞总RNA并进行反转录及QPCR检测，获取半数靶基因敲低效果的作用浓度(EC50)，结果见表3。
表3.不同细胞系中EC50的数据
表3结果显示，在6种细胞系中，所有候选序列的EC50均小于等于10nM。其中GPC3-009#和GPC3-019#的EC50值在肝癌细胞中最佳，GPC3-009#在Hepa1-6中的EC50值为2.19nM，GPC3-019#在Hep3B中的EC50值为2.64nM；同时发现GPC3-009#和GPC3-019#在其余4个细胞系中均体现出较好的敲低效果；而GPC3-019#在MCF7细胞系中未检测到EC50值，该细胞系将不用于后续检测。
实施例4：
优化及修饰后GPC3 siRNA和TGF-β1 siRNA序列的EC50检测
选取在多种细胞系(Hepa1-6、Hep3B、A549、PANC-1和DLD-1)中，均能体现出较好的敲低效果的siRNA序列(GPC3-009#和GPC3-019#)，对其进行序列优化(optimizesequences)和修饰。对于TGF-β1 siRNA，针对前期实验筛选出的序列(21mer的TF1-029#和25mer的TF1-013#)，进行了相应的具体见表4。其中，针对GPC3-009#，修饰序列为(GPC3-067#)；针对GPC3-019#，优化序列包括GPC3-(050#-057#)，优化并修饰序列包括GPC3-(058#-066#)；针对TF1-029#，修饰序列为TF1-039#，针对TF1-013#，修饰序列为TF1-043#。
表4.优化及修饰后GPC3 siRNA和TGF-β1 siRNA
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注：m表示碱基2'-OME修饰，f表示碱基2'-F修饰。
上述优化及修饰的GPC3 siRNA序列对A549细胞的EC50值(GPC3 mRNA沉默效果达到50％的siRNA浓度)见表5。
表5.GPC3优化及修饰前后序列EC50值
表5结果显示，多条优化或修饰序列的EC50值均小于原序列的EC50值，表现出更好的敲低效果。其中，GPC050#和GPC3-051#在5个细胞中的EC50值均小于原序列的EC50值，并且GPC3-059#、GPC3-060#、GPC3-063#和GPC3-064#的EC50均小于1nM。GPC3-062#和GPC3-066#的基因敲低效果不佳，未在表5中记录EC50值。
上述筛选及修饰的TGF-β1 siRNA序列对SK-Hep1的EC50值(TGF-β1 mRNA沉默效果达到50％的siRNA浓度)见表6。
表6.TGF-β1优化及修饰前后序列EC50值
| 编号 | SK-Hep1中的EC50值(nM) |
| TF1-013# | 2.11 |
| TF1-039#(TF1-013#的修饰序列) | 3.84 |
| TF1-029# | 0.24 |
| TF1-043#(TF1-029#的修饰序列) | 0.3 |
表6结果显示两条序列修饰前后的靶基因敲低效果相当，所以优先选择未修饰的siRNA(TF1-029#或TF1-013#)与GPC3 siRNA组合，进行后续的动物体内实验研究。
实施例5：
纳米药物制剂的制备与鉴定
选择GPC3-019#与多肽载体(HKP(+H))形成稳定的纳米颗粒制剂，记为siGPC3；选择GPC3-019#和TF1-013#，按照1：1的比例(质量比)混合并与多肽载体(HKP(+H))形成稳定的纳米颗粒制剂，记为siGPC3+siTGF-β1；选择GPC3-051#和TF1-029#，按照1：1的比例(质量比)混合并与多肽载体(HKP(+H))形成稳定的纳米颗粒制剂，记为siGPC3-212/siTGF-β1，用于体内的药效学验证工作。本实施例中，有关原辅料信息及制剂参数见表7和表8。成品见图2，图片为GPC3 siRNA冻干制剂(左图)和复溶制剂(右图)。
表7.体内药效学验证所用的小核酸及载体信息
表8.体内药效学验证所用到的小核酸药物制剂的关键参数信息
实施例6：
不同递送载体包载siRNA后对靶基因的沉默效果(细胞水平)
图3检测了在肺癌A549细胞中，不同递送载体对GPC3基因的敲低效果。我们使用了lipo2000作为阳性对照递送载体，lipo2000仅用于体外细胞转染，不可用于体内；脂质体LNP和多肽载体HKP(+H)作为两种不同递送系统，将siRNA递送至细胞内。24h后，收集细胞总RNA，QPCR结果见图3。LNP/siGPC3与HKP(+H)/siGPC3+siTGF-β1组的GPC3基因表达水平均有明显敲低效果，其中100nM LNP/siGPC3组的GPC3基因达到90％的敲低，400nM HKP(+H)/siGPC3+siTGF-β1组的GPC3基因有70％的敲低。
实施例7：
体内药效学验证工作(肺癌A549细胞异种移植瘤小鼠模型)
通过小鼠移植瘤模型(肺癌细胞A549)的药效学实验来验证siGPC3的抑制肿瘤生长的活性，实验采用BALB/c nude小鼠皮下接种A549细胞(5×106)建模，每组8只，尾静脉注射给药(i.v.)，2mg/kg，每3天给药一次，给药8次。结果发现，与对照组相比，多次给药后，siGPC3纳米颗粒药物单药可以明显抑制小鼠肺癌移植瘤的生长，相对于模型对照组(vehicle)，单药给药组肿瘤体积(肿瘤体积＝1/2×长径×短径2)有减小(图4-)；单药给药组瘤重减少，具有显著统计学差异(**P＜0.01)(图5)。小鼠自身体重在试验过程中相对于对照组(vehicle)无明显差异，显示siGPC3纳米颗粒药物无明显毒副作用(图6)。
实施例8：
体内药效学验证工作(肺癌A549细胞异种移植瘤小鼠模型)
通过小鼠移植瘤模型(肺癌细胞A549)的药效学实验来验证siGPC3+siTGF-β1的抑制肿瘤生长的活性，实验采用BALB/c nude小鼠皮下接种A549细胞(5×106)建模，每组8只，尾静脉注射给药(i.v.)，2mg/kg，每3天给药一次，给药8次。结果发现，与对照组相比，多次给药后，siGPC3+siTGFβ1纳米颗粒药物可以显著抑制小鼠肺癌移植瘤的生长，相对于模型对照组(vehicle)，siGPC3+siTGFβ1给药组肿瘤体积明显减小(图7)，且明显优于阳性药物吉西他滨(GemZar)，且在肿瘤体积生长抑制率(TGItv)上，从第9天开始就达到40％以上(表9)；siGPC3+siTGFβ1给药组瘤重量减少，具有显著统计学差异(*P＜0.05)(图8)，在肿瘤瘤重抑制率(TGItw)达到40％(表10)。小鼠自身体重在试验过程中相对于对照组(vehicle)无明显差异，显示siGPC3+siTGFβ1纳米颗粒药物无明显毒副作用(图9)。相关计算公式：
Vnt：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤体积；
Vn0：编号为n的小鼠在第0天的肿瘤体积；
RTVn：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤相对体积；
meanRTVtreat：给药组RTV平均值；
meanRTVvehicle：Vehicle组RTV平均值。
meanTW treat:给药组小鼠终点处理时肿瘤重量的平均值；
meanTW vehicle:Vehicle组小鼠终点处理时肿瘤重量的平均值。
表9.药物对A549肿瘤体积抑制率
/>
表10.药物对A549肿瘤重量抑制率
实施例9：
体内药效学验证工作(胰腺癌PANC-1细胞异种移植瘤小鼠模型)
通过小鼠移植瘤模型(胰腺癌细胞PANC-1)的药效学实验来验证siGPC3和siGPC3+siTGFβ1的抑制肿瘤生长的活性，实验采用BALB/c nude小鼠皮下接种PANC-1细胞(1×107)建模，每组8只，尾静脉注射给药(i.v.)，3mg/kg，每3天给药一次，给药8次后继续观察一段时间。结果发现，与对照组相比，多次给药后，siGPC3+siTGFβ1纳米颗粒药物可以显著抑制小鼠胰腺癌移植瘤的生长，相对于模型对照组(vehicle)，siGPC3单药和siGPC3+siTGFβ1给药组肿瘤生长较缓慢(图10)，在第22天最后一次给药后开始停药，停药后6天(第28天)siGPC3单药肿瘤体积生长抑制率达到35％和siGPC3+siTGFβ1组肿瘤体积生长抑制率达到40％，停药后9天(第31天)和停药后12天(第34天)的药效有所降低(表11)，但还是有抑制效果；siGPC3单药和siGPC3+siTGFβ1给药组平均瘤重低于对照组(图11)，在停药12天后siGPC3+siTGFβ1组肿瘤瘤重抑制率为31％(表12)。小鼠自身体重在试验过程中相对于对照组(vehicle)无明显差异，显示siGPC3+siTGFβ1纳米颗粒药物无明显毒副作用(图12)。
表11.药物对PANC-1肿瘤体积生长抑制率
表12.药物对PANC-1肿瘤重量抑制率
实施例10：
体内药效学验证工作(胰腺癌PANC-1细胞异种移植瘤小鼠模型)
通过小鼠移植瘤模型(胰腺癌细胞PANC-1)的药效学实验来验证siGPC3-212/siTGFβ1的抑制肿瘤生长的活性，实验采用BALB/c nude小鼠皮下接种PANC-1细胞(5×106)建模，每组8只，待肿瘤生长至平均体积为150mm3左右时，尾静脉注射siGPC3-212/siTGFβ1和siNC，剂量3mg/kg，siNC为不会引起任何基因沉默的序列，siNC序列的正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT，反义链为ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT，阳性对照吉西他滨(GemZar)为腹腔注射(i.p.)给药，剂量60mg/kg，药品均为每3天给药一次，给药8次。结果发现，与对照组相比，多次给药后，siGPC3-212/siTGFβ1纳米颗粒药物可以抑制小鼠胰腺癌移植瘤的生长。相对于模型对照组(vehicle)和阴性对照组(siNC)，siGPC3-212/siTGFβ1给药组和GemZar给药组肿瘤生长较缓慢(图13)，siGPC3-212/siTGFβ1对PANC-1肿瘤的抑制作用与GemZar相当。小鼠自身体重在试验过程中相对于对照组(vehicle)无明显差异，而GemZar组相对体重有所下降。结果显示siGPC3-212/siTGFβ1纳米颗粒药物无明显毒副作用(图14)。
综合以上实验数据，可以看出，采用PNP技术包裹并导入单靶向(siGPC3)或双靶向(siGPC3+siTGFβ1、siGPC3-212/siTGFβ1)小核酸药物在治疗多种实体瘤方面具有潜在的应用前景。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种用于治疗肺癌、胰腺癌、肝癌或结直肠癌中的一种或多种的小核酸干扰药物，所述的小核酸干扰药物包括能够靶向GPC3单靶点的小核酸分子，或所述的小核酸干扰药物包括能够靶向GPC3和TGF-β1双靶点的小核酸分子组合物。
2.根据权利要求1所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的小核酸分子或所述的小核酸分子组合物中的小核酸分子的类型包括shRNA，ASO，siRNA，miRNA或lncRNA中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的能够靶向GPC3单靶点的小核酸分子为能够靶向并结合编码GPC3蛋白的mRNA并抑制其表达的siRNA分子；
所述的能够靶向GPC3和TGF-β1双靶点的小核酸分子组合物包括能够靶向并结合编码GPC3蛋白的mRNA并抑制其表达的siRNA分子和能够靶向并结合编码TGF-β1蛋白的mRNA并抑制其表达的siRNA分子。
4.根据权利要求1所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的肺癌包括肺鳞癌、肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌；所述的胰腺癌包括胰头癌、胰体癌、胰尾癌、全胰癌、导管腺癌、腺泡细胞癌、浆液性囊腺癌、胰母细胞瘤、粘液性囊腺癌；所述的肝癌包括肝细胞肝癌、肝内胆管细胞癌、混合型肝癌及转移性肝癌；所述的结直肠癌包括升结肠癌、降结肠癌、横结肠癌、乙状结肠及直肠癌。
5.根据权利要求3所述的小核酸干扰药物，其特征在于，靶向GPC3基因的siRNA分子包括正义链和反义链，正义链为SEQ ID No.1～SEQ ID No.46所示核苷酸序列中的一条或多条，反义链为SEQ ID No.49～SEQ ID No.94所示的一条或多条与正义链相互补配对的核苷酸序列；
和/或，靶向TGF-β1基因的siRNA分子包括正义链和反义链，正义链为SEQ ID No.47和/或SEQ ID No.48所示核苷酸序列，反义链为SEQ ID No.95和/或SEQ ID No.96所示的与正义链相互补配对的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述靶向GPC3基因的siRNA分子的正义链和反义链分别为优化或修饰后的序列，优化后的正义链为SEQ ID No.97～SEQID No.104所示核苷酸序列中的一条或多条，优化后的反义链为SEQ ID No.117～SEQIDNo.124所示的一条或多条与优化后的正义链相互补配对的核苷酸序列；修饰后的序列为SEQ ID No.105～SEQ ID No.114所示核苷酸序列中的一条或多条，修饰后的反义链为SEQIDNo.125～SEQ ID No.134所示的一条或多条与优化后的正义链相互补配对的核苷酸序列；
和/或，所述靶向TGF-β1基因的siRNA分子的正义链和反义链分别为修饰后的序列，修饰后的序列为SEQ ID No.115和/或SEQ ID No.116所示核苷酸序列，修饰后的反义链为SEQID No.135和/或SEQ ID No.136所示的与修饰后的正义链相互补配对的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的小核酸干扰药物还包括药学上可接受的递送载体。
8.根据权利要求7所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的递送载体为药学上可接受的多肽聚合物、脂质载体或阳离子聚合物种的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的多肽聚合物包括组氨酸-赖氨酸分支状多肽聚合物。
10.根据权利要求9所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的多肽聚合物包括具有四个分子R的H3K4b，R＝KHHHKHHHKHHHKHHHK，和/或，具有四个分枝R1的H3K(+H)4b，R1＝KHHHKHHHKHHHHKHHHK。
11.根据权利要求3所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的小核酸干扰药物包括能够靶向GPC3和TGF-β1双靶点的小核酸分子组合物，靶向GPC3基因的siRNA分子和靶向TGF-β1基因的siRNA分子的投料质量比为1:(0.8～1.2)。
12.根据权利要求7所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的递送载体和所述的小核酸分子或所述的小核酸分子组合物中的小核酸分子的N/P值为2/1～6/1。
13.根据权利要求1所述的小核酸干扰药物，其特征在于，所述的小核酸干扰药物为纳米颗粒，和/或，所述的小核酸干扰药物的剂型为冻干剂。
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