CN116973361A - 一种单分子分析系统及其方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种单分子分析系统及其方法，所述单分子分析系统包括：物镜，所述物镜位于样本的正下方；激发模块，所述激发模块用于将光束通过物镜后聚焦到样本表面上，激发样本产生检测信号；接收模块，所述接收模块用于接收激发模块发射的光束经过样本表面反射后，读取反射回来的检测信号并将检测信号转换为数字信号，对所述数字信号进行定量分析。本发明利用显微放大原理，对固体或液体待测样本进行显微观察，实现所见即所得的同时，将反射回来的检测信号转换为数字信号，对数字信号的检测结果进行定量分析。
Description
技术领域
本申请涉及单分子检测技术领域，特别是涉及一种单分子分析系统及其方法。
背景技术
随着生物医学研究的不断深入，重大疾病的早期诊断和发病机制的研究迫切需要相关科学技术的不断发展。可视化的生物成像技术在生命科学和医学领域扮演着越来越重要的角色。相比于其他的生物成像技术而言，荧光成像具有分子水平的敏感性。单分子荧光检测自从1976年研究人员第一次尝试用全内反射荧光法实现以来，就一直在分析化学、生命科学等领域受到极大重视，但期间发展较慢。随着荧光检测技术的发展，直到1989年研究人员才成功地在低温下首次观察到固体基质中的单个分子的荧光。此后单分子检测由低温条件下发展到可在室温下进行，趋于温和，并且陆续实现液流、微滴和溶液中的单分子荧光检测。1995年，研究人员用共焦荧光显微技术首次测出溶液中自由移动的单个罗丹明分子，这种实时测量使单分子荧光记录不仅反映出特定分子在探测区的停留时间，而且包含特征性间歇信息。自由布朗运动中的单分子检测的实现为以后许多实际生物体系的应用提供了可能性，为生命信息挖掘提供了可能性。
现有技术中的单分子检测技术，通过牺牲灵敏度的形式放弃核酸扩增步骤，同时，检测结果准确性不高。
发明内容
基于此，有必要针对现有技术中的单分子检测技术存在灵敏度底及检测结果准确性不高的问题，提出一种单分子分析系统及其方法。
为了实现上述目的，本申请实施例提供了一种单分子分析系统，包括：
物镜，所述物镜位于样本的正下方；
激发模块，所述激发模块用于将光束通过物镜后聚焦到样本表面上，激发样本产生检测信号；
接收模块，所述接收模块用于接收激发模块发射的光束经过样本表面反射后，读取反射回来的检测信号并将检测信号转换为数字信号，对所述数字信号进行定量分析。
优选地，还包括：
自动对焦模块，所述自动对焦模块用于调整物镜顶部与样本之间的距离，使样本始终保持在物镜焦平面处，从而实现自动对焦。
优选地，所述激发模块包括：第一光源、第一滤光片、光束整形装置以及第一二向色镜；
所述第一滤光片用于对所述第一光源产生的光束进行杂散光处理，并将已过滤掉杂散光的光束投射至光束整形装置；
所述光束整形装置用于对所述第一滤光片投射的光束进行整形，并将整形后的光束投射至第一二向色镜；
所述第一二向色镜用于将光束整形装置投射的光束反射至物镜，通过所述物镜将光束聚焦到样本表面上。
优选地，所述接收模块包括：第二二向色镜、第二滤光片以及第一图像传感器；
所述激发模块发射的光束经过样本表面反射后，依次通过第二二向色镜、第一二向色镜、第二滤光片后投射至第一图像传感器，所述第一图像传感器根据信号的强弱读取检测信号。
优选地，所述接收模块还包括反射镜，所述反射镜接收到第二滤光片投射的光束后，反射至第一图像传感器。
优选地，所述自动对焦模块包括：第二光源、分束镜、第三滤光片以及第二图像传感器；
所述第二光源产生的光源经过分束镜、第三滤光片、第二二向色镜后，由第二二向色镜反射至物镜，通过所述物镜将光源聚焦到样本表面上，然后原路反射，由分束镜将反射回一定比例的光源至第二图像传感器；
通过分析第二图像传感器采集到的光源变化情况，计算出物镜顶部与样本之间的距离并自动调整，以便使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
优选地，所述第一光源为激光器或LED灯，所述第二光源为可发射850nm光源的激光器。
优选地，所述第一二向色镜和第二二向色镜都是短通二向色镜，所述第一滤光片为窄带滤光片，所述第二滤光片和第三滤光片都为带通滤光片。
优选地，所述样本放置在样本架上，所述样本架的底部透明，所述样本为液体或固体。
本发明还提供了一种单分子分析方法，通过上述所述的单分子分析系统实现，其包括如下步骤：
第一光源产生的光束投射至第一滤光片进行杂散光处理后，已过滤掉杂散光的光束投射至光束整形装置，经过整形后的光束投射至第一二向色镜，所述第一二向色镜将光束反射至物镜，通过所述物镜将光束聚焦到样本表面上；
所述第一光源发射的光束经过样本表面反射后，依次通过第二二向色镜、第一二向色镜、第二滤光片后投射至第一图像传感器，所述第一图像传感器根据信号的强弱读取检测信号；
所述第二光源产生的光源经过分束镜、第三滤光片、第二二向色镜后，由第二二向色镜反射至物镜，通过所述物镜将光源聚焦到样本表面上，然后原路反射，由分束镜将反射回一定比例的光源至第二图像传感器，通过分析第二图像传感器采集到的光源变化情况，计算出物镜顶部与样本之间的距离并自动调整，以便使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
本发明所提供的一种单分子分析系统具有如下优点和有益效果：
本申请利用显微放大原理，对固体或液体待测样本进行显微观察，实现所见即所得的同时，将反射回来的检测信号转换为数字信号，对数字信号的检测结果进行定量分析，同时通过自动对焦模块，使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
附图说明
图1为本申请单分子分析系统较佳实施例的模块示意图。
图2为本申请单分子分析方法较佳实施例的流程示意图。
图3为通过本申请单分子分析方法对样本进行线性测试的曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本申请，下面将参照相关附图对本申请进行更全面的描述。附图中给出了本申请的首选实施例。但是，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本申请的公开内容更加透彻全面。
需要说明的是，当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件并与之结合为一体，或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“安装”以及类似的表述只是为了说明的目的。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在一个实施例中，如图1所示，提供了一种单分子分析系统，包括：
物镜100，所述物镜100位于样本的正下方；
激发模块200，所述激发模块200用于将光束通过物镜100后聚焦到样本表面上，激发样本产生检测信号；
接收模块300，所述接收模块300用于接收激发模块200发射的光束经过样本表面反射后，读取反射回来的检测信号并将检测信号转换为数字信号，对所述数字信号进行定量分析；
自动对焦模块400，所述自动对焦模块400用于调整物镜100顶部与样本之间的距离，使样本始终保持在物镜100焦平面处，从而实现自动对焦。
采用本单分子分析系统进行检测，不仅仅可以显著降低分子诊断所需的时间，轻易实现类似于RNA、mRNA等的单链片段核酸分子的检测，更重要的是由于不需要核酸扩增，可以彻底解决目前分子诊断中最为麻烦的问题，也就是气溶胶污染，从而显著降低分子诊断实验室的环境控制要求。
本申请可以有效的提高检测灵敏度，以及兼容细胞检测，因此本申请可以应用在蛋白、分子、细胞三态生物信息。
具体实施时，所述激发模块200包括：第一光源201、第一滤光片202、光束整形装置203以及第一二向色镜204；所述第一滤光片202用于对所述第一光源201产生的光束进行杂散光处理，并将已过滤掉杂散光的光束投射至光束整形装置203；所述光束整形装置203用于对所述第一滤光片202投射的光束进行整形，并将整形后的光束投射至第一二向色镜204；所述第一二向色镜204用于将光束整形装置投射的光束反射至物镜100，通过所述物镜100将光束聚焦到样本表面上。
具体实施时，所述接收模块300包括：第二二向色镜301、第二滤光片302以及第一图像传感器303；所述激发模块200发射的光束经过样本表面反射后，依次通过第二二向色镜301、第一二向色镜204、第二滤光片302后投射至第一图像传感器303，所述第一图像传感器303根据信号的强弱读取检测信号。
具体实施时，所述接收模块300还包括反射镜304，所述反射镜304接收到第二滤光片302投射的光束后，反射至第一图像传感器303。
具体实施时，所述自动对焦模块400包括：第二光源401、分束镜402、第三滤光片403以及第二图像传感器404；所述第二光源401产生的光源经过分束镜402、第三滤光片403、第二二向色镜301后，由第二二向色镜301反射至物镜10，通过所述物镜100将光源聚焦到样本表面上，然后原路反射，由分束镜402将反射回一定比例的光源至第二图像传感器404；通过分析第二图像传感器404采集到的光源变化情况，计算出物镜100顶部与样本之间的距离并自动调整，以便使样本始终保持在物镜100焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
具体实施时，所述第一光源201为激光器或LED灯，所述第二光源401为可发射850nm光源的激光器。所述第一图像传感器303可以为工业相机。
具体实施时，所述第一二向色镜204和第二二向色镜301都是短通二向色镜，所述第一滤光片202为窄带滤光片，所述第二滤光片302和第三滤光片403都为带通滤光片。
具体实施时，所述样本放置在样本架上，所述样本架的底部透明，所述样本为液体或固体。
本申请的原理为：
第一光源201产生光束后经过窄带滤光片对杂散光进行处理，通过光束整形装置对光束进行整形，后由短通二向色镜将光束反射通过物镜后聚焦到样品上；第一光源201发射的光束反射后依次通过两个短通二向色镜、选择收集波长范围的带通滤光片3，后根据信号强弱进入图像传感器被读取检测信号。
当然，物镜的工作距离(即物镜最顶端到需检测样本表面的距离)为一定值或在极小范围内，即在检测过程中，样本应位于物镜焦面处。850nm光源经过分束镜、带通滤光片后由二向色镜反射，后依次通过物镜聚焦至样本表面；之后原路反射，由分束镜将反射回的一定比例的850nm激光反至图像传感器。通过软件分析反射回的光斑变化情况，可以对物镜最顶端到样本的距离进行判断，对数据分析处理后，可实现自动对焦，使样本始终保持在物镜焦平面处，保证检测结果的准确性。
本发明还提供了一种单分子分析方法，如图2所示，通过上述所述的单分子分析系统实现，其包括如下步骤：
S100、第一光源产生的光束投射至第一滤光片进行杂散光处理后，已过滤掉杂散光的光束投射至光束整形装置，经过整形后的光束投射至第一二向色镜，所述第一二向色镜将光束反射至物镜，通过所述物镜将光束聚焦到样本表面上；
S200、所述第一光源发射的光束经过样本表面反射后，依次通过第二二向色镜、第一二向色镜、第二滤光片后投射至第一图像传感器，所述第一图像传感器根据信号的强弱读取检测信号；
S300、所述第二光源产生的光源经过分束镜、第三滤光片、第二二向色镜后，由第二二向色镜反射至物镜，通过所述物镜将光源聚焦到样本表面上，然后原路反射，由分束镜将反射回一定比例的光源至第二图像传感器，通过分析第二图像传感器采集到的光源变化情况，计算出物镜顶部与样本之间的距离并自动调整，以便使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
为进一步验证本申请的灵敏度和重复性，使用均向法，选择新冠N蛋白项目进行测试，经本发明方法进行分析后，将原分析只能做到ng/mL灵敏度的产品，拓宽到1fg/mL灵敏度，以下为测试结果及分析数据：
测试线性：将制定好的样本作为高值样本，然后按照制定的稀释液对线性高值样品按比例稀释成至少7个样品，样品的浓度值覆盖5个数量级，混合均匀后将各个样本用本申请的验证模型检测其发光值，每个样本重复测试3次，计算线性回归相关系数应不小于0.99。
测试重复性：待本申请的验证模型开机处于稳定状态后，使用线性高值和线性低值样本进行测试。每次测试时样本需进/出舱，连续测试10次，每次测试间隔时间为3min，按下列公式计算标准差和变异系数应不超过2％。
式中：s为标准差，为10次测量结果大的算数平均值，xi为每次实测的结果，n为实测的次数。
线性低值如下表：
线性高值如下表：
综上，本申请提供的一种单分子分析系统及其方法，包括：物镜，所述物镜位于样本的正下方；激发模块，所述激发模块用于将光束通过物镜后聚焦到样本表面上，激发样本产生检测信号；接收模块，所述接收模块用于接收激发模块发射的光束经过样本表面反射后，读取反射回来的检测信号并将检测信号转换为数字信号，对所述数字信号进行定量分析，本申请利用显微放大原理，对固体或液体待测样本进行显微观察，实现所见即所得的同时，将反射回来的检测信号转换为数字信号，对数字信号的检测结果进行定量分析，同时通过自动对焦模块，使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种单分子分析系统，其特征在于，包括：
物镜，所述物镜位于样本的正下方；
激发模块，所述激发模块用于将光束通过物镜后聚焦到样本表面上，激发样本产生检测信号；
接收模块，所述接收模块用于接收激发模块发射的光束经过样本表面反射后，读取反射回来的检测信号并将检测信号转换为数字信号，对所述数字信号进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的单分子分析系统，其特征在于，还包括：
自动对焦模块，所述自动对焦模块用于调整物镜顶部与样本之间的距离，使样本始终保持在物镜焦平面处，从而实现自动对焦。
3.根据权利要求2所述的单分子分析系统，其特征在于，所述激发模块包括：第一光源、第一滤光片、光束整形装置以及第一二向色镜；
所述第一滤光片用于对所述第一光源产生的光束进行杂散光处理，并将已过滤掉杂散光的光束投射至光束整形装置；
所述光束整形装置用于对所述第一滤光片投射的光束进行整形，并将整形后的光束投射至第一二向色镜；
所述第一二向色镜用于将光束整形装置投射的光束反射至物镜，通过所述物镜将光束聚焦到样本表面上。
4.根据权利要求3所述的单分子分析系统，其特征在于，所述接收模块包括：第二二向色镜、第二滤光片以及第一图像传感器；
所述激发模块发射的光束经过样本表面反射后，依次通过第二二向色镜、第一二向色镜、第二滤光片后投射至第一图像传感器，所述第一图像传感器根据信号的强弱读取检测信号。
5.根据权利要求4所述的单分子分析系统，其特征在于，所述接收模块还包括反射镜，所述反射镜接收到第二滤光片投射的光束后，反射至第一图像传感器。
6.根据权利要求4所述的单分子分析系统，其特征在于，所述自动对焦模块包括：第二光源、分束镜、第三滤光片以及第二图像传感器；
所述第二光源产生的光源经过分束镜、第三滤光片、第二二向色镜后，由第二二向色镜反射至物镜，通过所述物镜将光源聚焦到样本表面上，然后原路反射，由分束镜将反射回一定比例的光源至第二图像传感器；
通过分析第二图像传感器采集到的光源变化情况，计算出物镜顶部与样本之间的距离并自动调整，以便使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
7.根据权利要求6所述的单分子分析系统，其特征在于，所述第一光源为激光器或LED灯，所述第二光源为可发射850nm光源的激光器。
8.根据权利要求6所述的单分子分析系统，其特征在于，所述第一二向色镜和第二二向色镜都是短通二向色镜，所述第一滤光片为窄带滤光片，所述第二滤光片和第三滤光片都为带通滤光片。
9.根据权利要求1所述的单分子分析系统，其特征在于，所述样本放置在样本架上，所述样本架的底部透明，所述样本为液体或固体。
10.一种单分子分析方法，通过如权利要求1-9任一项所述的单分子分析系统实现，其特征在于，包括如下步骤：
第一光源产生的光束投射至第一滤光片进行杂散光处理后，已过滤掉杂散光的光束投射至光束整形装置，经过整形后的光束投射至第一二向色镜，所述第一二向色镜将光束反射至物镜，通过所述物镜将光束聚焦到样本表面上；
所述第一光源发射的光束经过样本表面反射后，依次通过第二二向色镜、第一二向色镜、第二滤光片后投射至第一图像传感器，所述第一图像传感器根据信号的强弱读取检测信号；
所述第二光源产生的光源经过分束镜、第三滤光片、第二二向色镜后，由第二二向色镜反射至物镜，通过所述物镜将光源聚焦到样本表面上，然后原路反射，由分束镜将反射回一定比例的光源至第二图像传感器，通过分析第二图像传感器采集到的光源变化情况，计算出物镜顶部与样本之间的距离并自动调整，以便使样本始终保持在物镜焦平面处，从而保证检测结果的准确性。
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