JP5060292B2 - 血清学的分析法 - Google Patents
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Description
過去数年間、生物学的試料と接触したときの生化学的反応のサポートである一連の整列した付着物を含む、顕微鏡スライド又はより一般的には平らな支持体上の多重試験装置が開発されてきた。蛍光顕色試薬との最終的な反応ののち、装置は読み取られ、すなわち、各スポット上の反応が定量化される。
本発明は、血清学又は分子生物学的ハイブリダイゼーション用スライドのための蛍光読み取り装置に関する。本発明はまた、一つのそのような装置を含む機器ならびに分析法又は診断法における前記機器及び/又は装置の使用に関する。以下、術語「照明」及び「照射」は、蛍光励起光を指すために互換的に使用する。
反応ゾーンを照射するための手段が、光軸、すなわち微小付着物によって発せられる蛍光が集光光学部品によって捕捉されるところの軸に対して斜めの照射を可能にするようにチャネル中に配設された発光ダイオード(LED)を含み、
装置が、それぞれが特定の励起光を発するダイオードの少なくとも二つのチャネルを含み、
集光光学部品が、微小付着物の画像をセンサ上に形成する対物レンズを含むことを特徴とする装置に基づく。
ダイオードチャネルの軸は、光軸に対し、15°以上、好ましくは20°以上の角度で斜めである、及び/又は
装置は、少なくとも2個のダイオードを含み、各ダイオードは、近UV又は可視領域の波長を有する特定の照射光を発し、それらの波長は、蛍光分子の選択的励起を可能にするために十分に離れており、好ましくは、励起波長は100nm以上の間隔によって離れており、及び/又は
各ダイオードによって発せられる照射光は別個の経路をたどり、及び/又は
装置は、スライド上の付着物のゾーンの照射を均一化する要素を含み、及び/又は
各チャネルは、少なくとも一つのダイオード、コリメータ、前記ダイオードによって発せられる励起光のスペクトルを制限するためのフィルタならびに、任意には、光の空間的分布を均一化するための光学素子及び/又は光をスライドの反応ゾーンに向ける集光素子を連続的に含み、及び/又は
集光光学部品は、スライドの反応ゾーンと合致する一つの焦点を有する第一の対物レンズ、フィルタホルダ、好ましくはフィルタホイール及び画像を形成する第二の対物レンズを含み、及び/又は
装置は、スライドを配置する手段、反応ゾーンを照射する手段及び集光光学部品をいっしょに保持する強固なベース及び/又はコンソールをさらに含む。
装置は、一般にはすべての摂動原因、すなわちスポッティングのランダムさ、照射の不規則さ及び蛍光試薬の品質のばらつきを考慮してシグナルを修正する専用ソフトウェアによって命令又は操作される。好ましくは、ソフトウェアは、同じスポットの蛍光レベルを異なる波長で比較し、異なるスポットの蛍光レベルを同じ波長で比較することができる。好ましくは、ソフトウェアは、異なる波長でのスポットの蛍光の微修正を計算するために、均一な表面、蛍光性表面、又は単純拡散性の表面の予め記録された画像を使用して、及び/又は、
装置は、種々の染料の選択的な励起を可能にするのに十分な程度に波長どうしが離れている励起光の三つのチャネルを含み、好ましくは、一つは365nmを中心とし、第二のものは470nmを中心とし、第三のものは594nmを中心とする励起光の三つのチャネルを含む。近UVから赤外線まで波長の他の組み合わせが可能であり、及び/又は
励起光均一化装置は、光の多重反射を可能にするのに適当な直径の導光管又はケーラータイプの装置である。好ましくは、光均一化装置はケーラータイプである。そのうえ、均一化は、ディフューザ、たとえばホログラフィータイプのディフューザを加えることによって改善することができ、及び/又は
支持体が顕微鏡スライド又は平行面を有する他の支持体である場合、励起光はスライドを透過して試料に達し、及び/又は
センサ側の集光光学部品の対物レンズは、被写体側の対物レンズの焦点距離以下の焦点距離を有して、使用されるセンサにしたがって1未満又は1を超える倍率を生じさせ、及び/又は
フィルタホイールは電動化され、励起波長の変化に結合され、及び/又は
集光光学部品は、スポットの画像をたとえばCCD(「電荷結合素子」)タイプのマトリックスセンサ上に形成し、及び/又は
装置はスライド識別情報リーダを含み、及び/又は
装置は自動スライドフィーダを含む。
スポット中の量を示す蛍光1、タイプG免疫グロブリンを計測する蛍光2及びタイプM免疫グロブリンを計測する蛍光3にそれぞれ対応する三つの波長における3枚のデジタル画像を含み、及び/又は
スポッティングのランダムさ、照射の不均一さ及び顕色試薬のばらつきに関する蛍光の正規化、及び/又は
フランス国出願FR2,864,624に記載されているような血清コントロールに基づく又は内部コントロールに基づく陽性度についてのシグナルの比較
を含むソフトウェアの機能に関する。
上記のように、本発明は、スライドの分析に適合された装置に関する。その主要な構成要素が図1に示されている。装置は、有利には、プレート(2)を担持する強固なベース(1)を含み、その目的は、種々の要素を互いに対して定位置に保持することである。
この実施態様は、図1に関連して記載する。
UV励起用のNichia-NCCU001又はNCCU0033、Semrock FF 409-Ex02フィルタ付き。
470nm励起用のLumileds LXHL-MB1D、Semrock FF 506-Ex03 Aフィルタ付き。
594nm励起用のLumileds LXHL-ML1D、Chroma Technologies HG590/40フィルタ付き。
無限大修正Fujinon f=25mm対物レンズ。
フィルタ3枚:Semrock FF 409-Em02-B、Semrock FF 506-Em02-B及びChroma HQ655/40、黒アルマイト製線形フィルタホルダに装填。
無限大修正Fujinon f=25mm対物レンズ。
血清学用スライドは、0.5mm間隔の3列×4行に配設した12個のスポットを担持するものであった。第一列の最初2個のスポットがそれぞれIgG及びIgM免疫グロブリン対照であった。他のスポットは感染性作用物質であった。
アルゴリズムは、スポッティングのランダムさ、照射のばらつき及び試薬のばらつきを考慮してスポットの蛍光を修正するように設計されたものであった。
Si:スポットiの面積
指数iはスポット数1〜nの範囲である。
数値i=gはIgG対照スポットに対応し、数値i=mはIgM対照スポットに対応する。
Fij:バックグラウンド差し引き後の波長jにおけるスポットiの蛍光。
j=1:UV照射(参照)
j=2:470nmの照射
j=3:594nmの照射
Eij:波長jにおける面積Siの照射
zi2及びzi3は相対蛍光と呼ばれる。これらは、試料中の、抗原iに特異的なIgG及びIgM抗体含有量を定量化するために使用される。
他のすべてが等しいならば(スポットサイズ、照射、蛍光試薬)、相対蛍光zi2は、血清学的反応又はハイブリッド形成反応の強さを表す特異的シグナルFi2に比例する。
Claims (21)
- 反応要素の微小付着物を担持する反応ゾーンを含む血清学用スライドを読み取り及び/又は分析するための装置によって実施される血清学的分析法であって、
前記装置は、前記スライドを配置するための手段と、反応ゾーンを照射するための手段及び集光光学部品を備え、
前記反応ゾーンを照射するための手段が、光軸、すなわち前記微小付着物によって発せられる蛍光が前記集光光学部品によって捕捉されるところの軸に対して斜めの照射を可能にするようにチャネル中に配設された少なくとも3個の発光ダイオードを含み、
前記装置が、それぞれが特定の励起光を発する各発光ダイオードの少なくとも三つのチャネルを含み、
前記集光光学部品が、前記微小付着物の画像をセンサ上に形成する対物レンズを含み、
各発光ダイオードの励起光は、3種の染料、すなわち、血清学的反応の前の、生物学的作用物質の前記微小付着物に対応する第一の染料、タイプG免疫グロブリンの顕色試薬に対応する第二の染料及びタイプM免疫グロブリンの顕色試薬に対応する第三の染料を選択的に励起させる三つの分析波長を含み、
前記装置によって、
生物学的作用物質の一連の前記微小付着物を含む反応ゾーンを含む前記スライドを患者からの血清試料又はその希釈物とともにインキュベートしたのち、前記微小付着物に結合した試料中の抗体を標識試薬によって顕色させ、標識の読み取り及び分析を実施する、
血清学的分析法。 - 前記装置の各チャネルの軸が、光軸に対し、15°以上の角度で斜めである、請求項1記載の血清学的分析法。
- 前記装置の各チャネルの軸が、光軸に対し、20°以上の角度で斜めである、請求項1記載の血清学的分析法。
- 各発光ダイオードが、近UV又は可視領域の波長を有する特定の照射を発し、それらの分析波長が、蛍光分子の選択的励起を可能にするために十分に離れている、請求項1〜3のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 各発光ダイオードの分析波長が100nm以上の間隔によって離れている、請求項4記載の血清学的分析法。
- 各発光ダイオードによって発せられる照射光が別個の経路をたどる、請求項4記載の血清学的分析法。
- 前記装置が前記スライド上の前記微小付着物の反応ゾーンの照射を均一化する要素を含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置がケーラータイプの光均一化装置を含む、請求項7記載の血清学的分析法。
- 前記装置の各チャネルが、少なくとも一つの前記発光ダイオードによって発せられる励起光のスペクトルを制限するためのフィルタを含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置の各チャネルが、さらに光の空間的分布を均一化するための光学素子及び/又は光を前記スライドの反応ゾーンに向ける集光素子を連続的に含む、請求項9記載の血清学的分析法。
- 前記装置が光の空間的分布を均一化するための光学素子がホログラフィーディフューザを含む、請求項10記載の血清学的分析法。
- 前記装置の前記集光光学部品が前記微小付着物の画像をCCDセンサ上に形成する、請求項1〜11のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置の前記集光光学部品が、前記スライドの反応ゾーンと合致する一つの焦点を有する第一の対物レンズ、フィルタホイール及び画像を形成する第二の対物レンズを含む、請求項1〜12のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置が、自動スライド送り機構を含む、請求項1〜13のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置が、さらにスライド識別情報リーダを含む、請求項14記載の血清学的分析法。
- 前記装置が前記スライドを配置する手段、前記反応ゾーンを照射する手段及び前記集光光学部品をいっしょに保持する強固なベース及び/又はコンソールをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置が一つは365nmを中心とし、第二のものは470nmを中心とし、第三のものは594nmを中心とする励起光を発する三つの前記チャネルを含む、請求項1〜16のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置が同じスポットの蛍光レベルを異なる波長で比較し、異なるスポットの蛍光レベルを同じ波長で比較することができるソフトウェアによって操作又は命令される、請求項1〜17のいずれか1項記載の血清学的分析法。
- 前記装置のソフトウェアが、均一な表面、蛍光性表面、又は単純拡散性の表面の予め記録された画像を使用して、異なる波長でのスポットの蛍光の微修正を計算する、請求項18記載の血清学的分析法。
- 生物学的作用物質の前記微小付着物に対応する染料を約365nmで励起することができ、タイプG免疫グロブリンの顕色試薬に対応する染料を約470nmで励起することができ、タイプM免疫グロブリンの顕色試薬に対応する染料を約594nmで励起することができる、請求項19記載の血清学的分析法。
- 血清学的分析又は分子生物学における生物学的試料のリボ核酸又はデオキシリボ核酸の分析のために使用される、請求項1〜20のいずれか1項記載の血清学的分析法。
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