EP1774295A1 - Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique - Google Patents

Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique

Info

Publication number
EP1774295A1
EP1774295A1 EP05793765A EP05793765A EP1774295A1 EP 1774295 A1 EP1774295 A1 EP 1774295A1 EP 05793765 A EP05793765 A EP 05793765A EP 05793765 A EP05793765 A EP 05793765A EP 1774295 A1 EP1774295 A1 EP 1774295A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
deposits
blade
light
analysis
illumination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05793765A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Michel Delaage
Gilles NICOLAÏ
Jean-Michel Decaudin
Pascal Résidence Loubassane - H2 HUGUET-CHANTÔME
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inodiag SA
Original Assignee
Inodiag SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inodiag SA filed Critical Inodiag SA
Publication of EP1774295A1 publication Critical patent/EP1774295A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
    • G01N2201/06—Illumination; Optics
    • G01N2201/062—LED's
    • G01N2201/0627—Use of several LED's for spectral resolution

Definitions

  • the present application relates to a reading device for slides carrying fluorescent deposits, as used in serology or in molecular biology analysis.
  • test devices have appeared on microscope slides, or more generally on a flat support, where a series of deposits are aligned, which are the supports of a biochemical reaction during contact with a biological sample. After a possible reaction with fluorescent developers, the device must be read, that is to say the quantification of the reaction on each spot.
  • the blades can be made of glass or transparent plastic.
  • the number of spots on a blade can range from a few units to several thousand.
  • the diameter of the spots is generally between 50 and 250 microns. These deposits are generally referred to as microarrays, an American term that has become internationally recognized.
  • the deposits consist of nucleic acid sequences (DNA, deoxyribonucleic acid) and the biological sample to be tested contains a mixture of nucleic acid sequences, for example the amplified forms of its RNA (ribonucleic acid). messengers called complementary DNA (cDNA). Each hybrid V cDNA deposit corresponding to it.
  • the hybridization reaction can be visualized and quantified by fluorescence, either that the cDNAs themselves are labeled, or that the hybridization zones are labeled with a specific dye.
  • the biological sample to be tested contains a serum or a plasma, and reacts with a slide carrying reactive elements, for example proteins, cells, sub-cellular fractions, bacteria , virus, etc., previously deposited on the slide. After this first reaction, the slide is brought into contact with a developing reagent.
  • reactive elements for example proteins, cells, sub-cellular fractions, bacteria , virus, etc.
  • This signal may be a radioactivity, a colored reaction resulting from an enzymatic amplification, or a fluorescence signal. It is in the latter case that the resolution required by the increasing density of the deposits can be reached.
  • the present application relates to a fluorescence reading device for serology slides or molecular biology hybridization. It also relates to any device comprising such a device, as well as the use of these devices and / or devices in analysis or diagnostic methods.
  • illumination and “lighting” are synonymous. They refer to the excitatory light of fluorescence.
  • the object of the present invention is in particular to provide a reading device for serology slides or molecular biology hybridization which avoids the disadvantages mentioned above, by ensuring the recording and processing of fluorescence signals, reliably and automatic.
  • a particular feature of the devices of the invention resides in particular in the use of light-emitting diodes to provide a channelized excitation light, and in the arrangement of the excitation source and the recovery optics, giving great reliability to the reading and analysis.
  • a particular object of the invention thus resides in a device for reading and / or analyzing slides comprising a reactive zone carrying micro deposits of reactive elements, said device comprising means for placing a blade, means for illuminating the reactive zone and recovery optics, characterized in that:
  • the illumination means of the reactive zone comprise light-emitting diodes (LEDs) arranged in channels to allow illumination obliquely with respect to the optical axis, that is to say the axis in which the fluorescent light emitted by micro deposits is captured by the recovery optics;
  • LEDs light-emitting diodes
  • the device comprises at least two diode channels each emitting a clean excitation light; and -
  • the recovery optics includes an objective forming the image of micro deposits on a sensor.
  • the axis of the diode channels is oblique with respect to the optical axis with an angle greater than or equal to 15 °; and preferably greater than or equal to 20 ° and / or;
  • the device comprises at least two diodes, each diode emitting a clean illumination light having a wavelength in the near UV or in the visible, the wavelengths being sufficiently spaced to allow the selective excitation of the fluorescent molecules ; preferably, the excitation wavelengths are spaced at intervals equal to or greater than 100 nm; and or
  • each of the diodes follows a distinct direction
  • the device comprises elements homogenizing the illumination of the area of deposits on the blade; and or
  • each channel comprises successively at least one diode, a collimation optics, a filter intended to restrict the spectrum of the exciting light emitted by this diode and, optionally, an optical device intended to standardize the spatial distribution of the light and / or a condenser directing light towards the reactive zone of the blade; and or
  • the recovery optics comprises a first objective having a focus coincides with the reactive zone of the blade, a filter holder, preferably a filter carousel, and a second objective forming the image; and or
  • the device further comprises a solid base and / or a console, ensuring the maintenance of the means for placing the blade, the illumination means of the reactive zone and the recovery optics.
  • three diodes are grouped in the same channel, in the vicinity of the optical axis.
  • the device is controlled or operated by a dedicated software, typically which corrects the signal for all the causes of disturbances: randomness of deposit, irregularities of illumination and variations in the quality of the fluorescent reagents.
  • the software is able to perform comparisons of fluorescence levels of the same deposit at different wavelengths and different deposits at the same wavelength.
  • the software uses pre-recorded images of uniform, fluorescent or simply scattering surfaces to calculate a fine correction of the fluorescence of the deposits at different wavelengths; and or
  • the device comprises three excitation light channels whose wavelengths are sufficiently wide apart to allow the selective excitation of different dyes; preferably, it comprises three excitation light channels, one centered around 365 nm, the second around 470 nm, the third around 594 nm. Other combinations of wavelengths are possible, from the near UV to the infrared; and or
  • the exciter light uniformizing device is an optical guide of diameter adapted to allow multiple reflections of the light, or else a Kohler-type device.
  • the device that homogenizes the illumination is of Kohler type.
  • the homogenization can be improved by adding a diffuser, for example of the holographic type; and or
  • the support is a microscope slide, or any other parallel-faced support
  • the exciter light reaches the sample through the slide
  • the objective of the sensor - side pick - up optic has a focal length equal to or less than that of the object - side lens, achieving a magnification of less than or greater than 1, depending on the sensor used; and or
  • the filter carousel is motorized and coupled to the change of the excitation wavelength
  • the recovery optics form the image of the deposits on a matrix sensor, for example of the CDD (Charge Coupled Device) type; and or
  • the device comprises a blade identifier reader; and or
  • the device comprises an automatic blade feeding device.
  • Another subject of the invention relates to a serological analysis method comprising the incubation of a serology slide comprising a reactive zone comprising a series of deposits of biological agents, for example infectious agents, pathogens, allergens or autoantigens, with a serum sample of a patient, or a dilution thereof, and then revealing the antibodies (eg IgG and / or IgM) of the sample attached to the deposits by means of labeled reagents, characterized in that the reading and the analysis of the labeling (eg, fluorescence) are carried out by means of a device as defined above.
  • biological agents for example infectious agents, pathogens, allergens or autoantigens
  • the analysis method comprises three analysis wavelengths, selectively exciting three dyes: the first associated with the deposits, prior to the serological reaction, the second associated with the G-type immunoglobulin developer, and the third associated with the
  • the dye associated with the deposition is excitable around 365 nm
  • the dye associated with the G-type immunoglobulin developer is excitable around 470 nm
  • the dye associated with the immunoglobulin developer of type M is excitable around 594 nm.
  • Another object of the invention are the functionalities of the software which carries out the analysis and which preferably comprises:
  • the three digital shots at the three wavelengths corresponding respectively to the control fluorescence 1 of the quantity deposited, the fluorescence 2 measuring the immunoglobulins of type G and the fluorescence 3 measuring the immunoglobulins of the M type and / or
  • the invention therefore relates to a medium comprising software for implementing a device according to the present invention, implementing the formulas of Example 3 or other similar formulas.
  • the invention also relates to the use of a device as defined above for serological analysis or in molecular biology.
  • the analysis in molecular biology comprises the analysis of ribonucleic or deoxyribonucleic acids of a biological sample.
  • the glass slide carries, for example, single-stranded DNA deposits intended to capture the fluorescent cDNAs originating from the sample.
  • excitation wavelengths may be chosen in the vicinity of 543 nm for endogenous labeling with cyanine 3, in the vicinity of 635 nm for labeling with cyanine 5, in the vicinity of 488 nm for Hybridized part labeling with Sybr Green ® (Molecular Probes, Eugene, Oregon). The list is not exhaustive.
  • kits including biological analysis, comprising the use of a device as defined above.
  • the invention is applicable in many fields, in particular for histological or serological analysis in a medical, veterinary, environmental, agri-food, etc. context.
  • the invention relates to a device adapted to the analysis of slides.
  • the main components are shown in Figure 1.
  • the device advantageously comprises a solid base (1) carrying a plate (2) for the purpose of maintaining the positioning of the various elements relative to each other.
  • Each light emitting diode (3) is enclosed in a case (4) containing the homogenizing device, the assembly constituting a lighting channel fitted into a support (5) on which is fixed the blade holder chamber (6). Beyond this is screwed the first objective (7) which is itself fitted into a sleeve integral with the case of the filter carousel (8). Symmetrically, beyond the carousel, there is the second objective (9) screwed on the CCD camera (10).
  • the lighting of the diodes by the housing (11), the positioning of the filter holder and the starting of the camera are controlled by a microcomputer, which also contains the interpretation software according to the invention.
  • the optical axis of the recovery optics is horizontal.
  • the light-emitting diodes preferably have an electric power of between 500 and 5000 mW.
  • a set of convergent lenses is placed in order to give the light beam an approximate parallelism. A divergence of less than 10 degrees is preferred.
  • a preferred value of the window is an interval equal to or less than 40 nm.
  • the exciter wavelengths are spaced from each other, one in the near UV, one in the blue, one in the yellow, orange or red.
  • a preferred value of the difference between the excitatory wavelengths is an interval equal to or greater than 100 nm.
  • the homogenizing device consists of a diffusing surface at the inlet of a mixing optical guide consisting of a tube of transparent material with a high refractive index of between 20 and 40 centimeters in length. mm, and preferably between 6 and 10 mm in diameter.
  • a mixing optical guide consisting of a tube of transparent material with a high refractive index of between 20 and 40 centimeters in length. mm, and preferably between 6 and 10 mm in diameter.
  • an input lens concentrates the beam at a suitable angle, ( Figure 2)
  • the homogenizing device is constituted by a diffusing surface placed at the focus of a collimating lens whose image is formed on the object (so-called Kohler assembly) (FIG. 3) .
  • the diffuser is of holographic type, with very high efficiency.
  • the blade to be measured is embedded in a removable support which is itself slid into a slot.
  • the support is provided with an opening to the right of the active zone of the blade.
  • a locking device such as an abutment ball immobilizes said support in the position where its window is in the axis of the optical recovery.
  • the blade to be measured is directly inserted into the device through a slot and positioned by supports on slides, and springs on the opposite face.
  • the blade is provided with a polarizer, for example an indentation on an angle, which prevents an erroneous introduction.
  • the diode holder and the housing of the blade advantageously constitute a rigid assembly that can be made from various materials, possibly mixed. It may in particular be composed of (or based on) plastic material, metal and / or any rigid material at temperatures of 37 ° C or higher.
  • the block is composed of black (delrin, rilsan) black or anodized aluminum alloy or painted to avoid reflections.
  • the housing of the blade, or the removable blade holder are made of metal to prevent any distortion detrimental to maintaining the focus.
  • the lenses have a focal length of between 20 and 40 mm.
  • the camera-side lens has a lower focal length than the objective lens.
  • the photoelectric matrix preferably has a number of pixels greater than 10,000.
  • the CCD sensor can be that of a digital camera such as
  • Nicon's "CoolPix” or preferably on a camera such as Hamamatsu 5885, Qicam Qicam, Sony SVS, or any other brand. It is not necessary to cool the sensor, the oblique orientation of the exciter light provides an excellent signal-to-noise ratio.
  • the optical axis is vertical. In a preferred embodiment, it is horizontal.
  • the blade protrudes from the measuring slot and allows the reading of a bar code or an electronic tag.
  • the device according to the invention therefore comprises a barcode reader or a communication antenna with the electronic tag.
  • a particular object of the present invention relates to blades provided with electronic tags on which the characteristics of the reading and the results of the reading can be recorded.
  • a particular object of the present invention relates to the reading algorithm specific to serology slides.
  • Three images are recorded, with three different fluorescences.
  • the first image which relates to a fluorescence marker systematically attached to the deposit at the time of manufacture of the blades, is analyzed in terms of "clusters", that is to say related elements, which are the deposits.
  • clusters that is to say related elements, which are the deposits.
  • the advantage of doing so is that there is no position to position a grid on the image of the deposits, which would be anyway imprecise due to the inevitable distortions of the optics. It is also freed from the game in the slides of the housing of the blade and an automatic analysis becomes possible.
  • the other two images corresponding to two other fluorescent markers, are respectively associated with the immunoglobulin G and immunoglobulin M responses of the patient.
  • micro deposits being tainted with great uncertainty as to their quantity, it is an element of the invention to use one of the fluorescent labels as a control of the amount of material deposited and to use the corresponding signal to correct the signals representative of the serological reaction. It is another aspect of the invention to use images of a slide carrying a diffusing or fluorescent element to measure local illumination differences and then to use these results to correct the fluorescence of the deposits for the irregularities of illumination. It is another element of the invention to report the fluorescence associated with the antibodies of a subject having fixed on an antigen deposit, to that of a reference deposit of pure imunoglobulins, respectively of type G or type M, made fluorescent by the same fluorescent anti IgG and anti IgM developer respectively. This will be better understood in Example 3.
  • the device of the invention further comprises a means for ensuring a displacement of the blade perpendicularly to the optical axis so as to be able to make images of different areas of the blade and also to be able to measure an increased number deposits.
  • a means for ensuring a displacement of the blade perpendicularly to the optical axis so as to be able to make images of different areas of the blade and also to be able to measure an increased number deposits. According to this mode, up to 40 000 deposits would be readable, this number being an order of magnitude, and can be exceeded according to the techniques of deposits and the number of pixels of the sensor.
  • an automatic blade feeder having a blade magazine, an identifier reading device and a transfer mechanism through the reading device is used.
  • the devices according to the invention are suitable for any type of microscope slide.
  • the term "blade” means any rigid object-holder element that can be used to immobilize a biological deposit, thereby delimiting a reactive zone. It may be for example a solid lamella, a membrane, a filter made transparent, etc.
  • the blade can be made of (or based on) any known and conventional material, such as plastic, glass, nylon, biological polymers, silica, etc.
  • Preferred slides are glass microscope slides. Their dimensions are usually standard, about 26mm x 76mm.
  • the blades are provided with a polarizer, for example in the form of a notch in a corner.
  • the blade (or microarrays) used for the diagnosis does not comprise more than 400 deposits, for example, which makes it possible to form the fluorescence image thereof. only one shot.
  • the installation of the blade can be carried out either by a support, or by sliding the blade in a slot.
  • This slot made of a black material is provided with countersinks avoiding deterioration of the deposits during an introduction, even erroneous.
  • Figure 1 is a general diagram of a device according to the invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram of a mixer guide type diode lighting channel.
  • Figure 3 is a schematic diagram of a diode lighting channel with Kohler type illumination.
  • Figure 4 shows a control screen of the acquisition sequence.
  • Figure 5 shows the result sheet corresponding to Figure 4.
  • the fluorescences of the IgG and IgM controls are arbitrarily standardized to 10,000.
  • the invention can be implemented for the analysis of serology slides.
  • the blade In the serological mode, the blade carries a series of biological deposits ("spots"), for example infectious agents, pathogens, autoantigens or allergens. Deposits are carefully marked, this marking constituting an identification code.
  • the liquid sample to be tested is a patient's serum, usually diluted in a suitable buffer.
  • the treatment of the blade can be carried out by manual means, consisting of dipping in successive baths, or by automatic means as described in the patent application FR0403365.
  • the invention can also be implemented for molecular biology analysis, either in fluorescence mode, as previously described, or in optical density mode.
  • the blades carry a nylon support on which the spots are deposited, the lighting is diffused by the nylon and the spots absorb the light. They are detected and quantified as dark spots on a light background.
  • Example 1 Description of a device according to the invention This embodiment is described in relation to FIG.
  • the light-emitting diodes are:
  • Nichia-NCCUOOl or NCCU0033 for UV excitation associated with Semrock filter FF 409-Ex02; Lumileds LXHL -MBlD for excitation at 470 nm, associated with the filter
  • the homogenizer is of the light guide type.
  • the blade holder is made of black DeMn.
  • Recovery optics include:
  • the image is projected on the sensor of an SVS Vistek SV084 "S” camera with 658x494 pixels.
  • the assembly is controlled by a microcomputer carrying control, reading and analysis software according to the invention.
  • a serology slide carries 12 deposits, arranged in 3 rows and 4 columns at a pitch of 0.5 mm.
  • the first two deposits of the first line are immunoglobulin IgG and IgM controls respectively.
  • Other deposits are infectious agents.
  • the slide is first incubated for thirty minutes with the patient's serum. Then, after rinsing, the slide is incubated for ten minutes with the secondary antibody reagents which are fluorescein-labeled goat anti-human immunoglobulin G antibody, and a human anti-human immunoglobulin goat anti-human Ig antibody. Texas red, mixed. Deposits having fixed IgGs have excitable green fluorescence at 470 nm and IgM-containing deposits have excitable red fluorescence at 594. Only the image excited at 365 nm is shown ( Figure 4).
  • the algorithm aims to correct fluorescence spots: hazards of deposits, irregularities of illumination, and reagents.
  • Zi 2 and Zi 3 are called relative fluorescences. They are used to quantify the IgG and IgM antibody sample concentrations that are specific to the i antigen.
  • Relative fluorescences for example Zj 2 , have the expected properties. Indeed :
  • spot size, illumination, fluorescent reagents, relative fluorescence z; 2 is proportional to the specific signal Fj 2 which represents the intensity of the serological reaction, or the hybridization reaction.
  • Fj 2 represents the intensity of the serological reaction, or the hybridization reaction.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

La présente demande concerne un dispositif de lecture de lames portant des dépôts fluorescents, tels qu'utilisés en sérologie ou en analyse de biologie moléculaire. Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, les logiciels spécifiques de mise en œuvre, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic.

Description

Dispositif de lecture pour lames portant des micro dépôts supports de réaction biologique
La présente demande concerne un dispositif de lecture de lames portant des dépôts fluorescents, tels qu'utilisés en sérologie ou en analyse de biologie moléculaire.
Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, les logiciels spécifiques de mise en œuvre, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic.
Arrière Plan de l'Invention
Depuis quelques années, sont apparus des dispositifs de test multiples sur lames de microscope, ou plus généralement sur support plan, où une série de dépôts sont alignés, qui sont les supports d'une réaction biochimique lors du contact avec un échantillon biologique. Après une éventuelle réaction par des révélateurs fluorescents, on doit procéder à la lecture du dispositif, c'est-à-dire à la quantification de la réaction sur chaque spot.
Les lames peuvent être en verre ou en matière plastique transparente. Le nombre de spots sur une lame peut aller de quelques unités à plusieurs milliers. Le diamètre des spots est généralement compris entre 50 et 250 microns. Ces dépôts sont généralement désignés sous le nom de microarrays, terme américain qui s'est imposé au plan international.
Selon une première variante, les dépôts sont constitués de séquences d'acides nucléiques (ADN, acide désoxyribonucléiques) et l'échantillon biologique à tester contient un mélange de séquences d'acides nucléiques, par exemple les formes amplifiées de ses ARN (acide ribonucléique) messagers appelées ADN complémentaires (ADNc). Chaque dépôt hybride V ADNc qui lui correspond. La réaction d'hybridation peut être visualisée et quantifiée par fluorescence, soit que les ADNc soient eux-même marqués, soit que l'on marque les zones d'hybridation par un colorant spécifique. Dans une seconde variante (telle que par exemple les tests sérologiques), l'échantillon biologique à tester contient un sérum ou un plasma, et réagit avec une lame portant des éléments réactifs, par exemple des protéines, cellules, fractions sub¬ cellulaires, bactéries, virus, etc., déposés au préalable sur la lame. Après cette première réaction, la lame est mise en contact avec un réactif révélateur.
Dans tous les cas, on est confronté à une opération de lecture du signal propre à chaque dépôt. Ce signal peut être une radioactivité, une réaction colorée résultant d'une amplification enzymatique, ou encore un signal de fluorescence. C'est dans ce dernier cas que l'on peut atteindre la résolution exigée par la densité de plus en plus grande des dépôts.
Tandis que les méthodes de dépôt se perfectionnent et l'utilité des mesures multiples se confirme, avec plusieurs applications possibles dans le domaine du diagnostic, on ne dispose pas de lecteur de fluorescence ayant les performances requises à un coût acceptable pour un laboratoire d'analyse médicale. C'est dans cette dernière catégorie que se situe la présente invention.
Les appareils disponibles actuellement utilisent un balayage laser pour sonder la lame. En général, trois lasers différents sont nécessaires pour obtenir les différents signaux issus des spots. Ensuite, l'image est reconstituée sur un écran et l'opérateur déplace visuellement une grille de cadrage, en s 'efforçant de faire coïncider les mailles de la grille avec les images des dépôts. Cette opération est loin d'être parfaitement satisfaisante car les dépôts sont irréguliers. De tels appareils sont évidemment très coûteux, de l'ordre de 100 000 US $. Ils sont conçus pour la recherche où l'on traite un petit nombre de lames portant un très grand nombre de dépôts et ne sont pas adaptés au travail de routine d'un laboratoire d'analyse médicale, où l'on traite de nombreuses lames portant un nombre limité de dépôts.
II existe donc un besoin réel de dispositifs d'analyse de microarrays sur lames permettant une analyse rapide, fiable et automatisée. Dans le domaine sérologique, il y a en particulier un besoin non satisfait de lecteur de lame à accès aléatoire, qui puisse traiter une lame dans des délais courts (typiquement en quelques secondes), et répondre au diagnostic d'urgence en matière de maladies infectieuses. La présente invention apporte une solution à ces besoins.
Résumé de l'Invention
La présente demande concerne un dispositif de lecture de fluorescence pour lames de sérologie ou d'hybridation de biologie moléculaire. Elle concerne également tout appareil comprenant un tel dispositif, ainsi que l'utilisation de ces appareils et/ou dispositifs dans des procédés d'analyse ou de diagnostic. Dans ce qui suit les termes "éclairement" et "éclairage" sont synonymes. Ils font référence à la lumière excitatrice de la fluorescence.
L'objet de la présente invention est notamment de fournir un dispositif de lecture pour lames de sérologie ou d'hybridation de biologie moléculaire qui évite les inconvénients mentionnés précédemment, en assurant l'enregistrement et le traitement des signaux de fluorescence, de manière fiable et automatique. Une caractéristique particulières des dispositifs de l'invention réside notamment dans l'utilisation de diodes électroluminescentes pour fournir une lumière excitatrice canalisée, et dans l'agencement de la source d'excitation et de l'optique de reprise, donnant une grande fiabilité à la lecture et à l'analyse.
Un objet particulier de l'invention réside ainsi dans un dispositif de lecture et/ou d'analyse de lames comportant une zone réactive portant des micro dépôts d'éléments réactifs, ledit dispositif comprenant des moyens de mise en place d'une lame, des moyens d'éclairement de la zone réactive et une optique de reprise, caractérisé en ce que :
- les moyens d'éclairement de la zone réactive comprennent des diodes électroluminescentes (LED) agencées en canaux pour permettre un éclairement de manière oblique par rapport à l'axe optique, c'est-à-dire l'axe selon lequel la lumière fluorescente émise par les micro dépôts est captée par l'optique de reprise;
- le dispositif comprend au moins deux canaux de diodes émettant chacun une lumière d'excitation propre; et - l'optique de reprise comporte un objectif formant l'image des micro dépôts sur un capteur.
De manière avantageuse, - l'axe des canaux de diodes est oblique par rapport à l'axe optique avec un angle supérieur ou égal à 15°; et de préférence supérieur ou égal à 20° et/ou ;
- le dispositif comprend au moins deux diodes, chaque diode émettant une lumière d'éclairement propre ayant une longueur d'onde dans le proche UV ou dans le visible, les longueurs d'onde étant sufisamment écartées pour permettre l'excitation sélective des molécules fluorescentes; de préférence, les longueurs d'onde d'excitation sont écartées d'intervalles égaux ou supérieurs à 100 nm ; et/ou
- la lumière d'éclairement émise par chacune des diodes suit une direction distincte; et/ou
- le dispositif comprend des éléments homogénéisant l'éclairement de la zone des dépôts sur la lame; et/ou
- chaque canal comporte successivement au moins une diode, une optique de collimation, un filtre destiné à restreindre le spectre de la lumière excitatrice émise par cette diode et, éventuellement, un dispositif optique destiné à uniformiser la répartion spatiale de la lumière et/ou un condenseur orientant la lumière vers la zone réactive de la lame; et/ou
- l'optique de reprise comporte un premier objectif dont un foyer coïncide avec la zone réactive de la lame, un porte filtres, de préférence un carousel de filtres, et un deuxième objectif formant l'image; et/ou
- le dispositif comporte en outre une embase solide et/ou une console, assurant le maintien ensemble des moyens de mise en place de lame, des moyens d'éclairement de la zone réactive et de l'optique de reprise.
Dans un mode particulier de l'invention, trois diodes sont regroupées dans le même canal, au voisinage de l'axe optique.
Dans des modes de réalisation particulièrement préférés de l'invention: - Le dispositif est commandé ou exploité par un logiciel dédié, typiquement qui corrige le signal pour toutes les causes de perturbations : aléas de dépôt, irrégularités d'éclairement et variations dans la qualité des réactifs fluorescents. De préférence, le logiciel est capable d'effectuer des comparaisons des niveaux de fluorescence d'un même dépôt à différentes longueurs d'onde et de dépôts différents à la même longueur d'onde. De préférence, le logiciel utilise des images pré-enregistrées de surfaces uniformes, fluorescentes ou simplement diffusantes, pour calculer une correction fine de la fluorescence des dépôts aux différentes longueurs d'onde ; et/ou
- le dispositif comporte trois canaux de lumière excitatrice dont les longueurs d'onde sont suffisament écartées pour permettre l'excitation sélective de colorants différents ; de préférence, il comprend trois canaux de lumière excitatrice, l'un centré autour de 365 nm, le deuxième autour de 470 nm, le troisième autour de 594 nm. D'autres combinaisons de longueur d'onde sont possibles, depuis le proche UV jusqu'à l'infrarouge ; et/ou
- le dispositif d'uniformisation de la lumière excitatrice est un guide optique de diamètre adapté pour permettre des réflexions multiples de la lumière, ou encore un dispositif de type Kôhler. De préférence, le dispositif homogénéisant l'éclairement est de type Kôhler. Par ailleurs, l'homogénéisation peut être améliorée en ajoutant un diffuseur, par exemple de type holographique; et/ou
- Lorsque le support est une lame de microscope, ou tout autre support à faces parallèles, la lumière excitatrice atteint l'échantillon à travers la lame; et/ou
- L' objectif de l'optique de reprise côté capteur présente une distance focale égale ou inférieure à celle de l'objectif côté objet, réalisant un grandissement inférieur ou supérieur à 1, en fonction du capteur utilisé; et/ou
- Le carousel à filtres est motorisé et couplé au changement de la longueur d'onde d'excitation; et/ou
- l'optique de reprise forme l'image des dépôts sur un capteur matriciel, par exemple de type CDD ("Charge Coupled Device") ; et/ou
- le dispositif comporte un lecteur d'identifiant de lames; et/ou
- le dispositif comporte un dispositif d'alimentation automatique en lames.
Ces caractéristiques sont particulièrement avantageuses et permettent la lecture des éléments réactifs de manière fiable et automatique, conduisant à des résultats reproductibles. Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'analyse sérologique comprenant l'incubation d'une lame de sérologie comprenant une zone réactive comportant une série de dépôts d'agents biologiques, par exemple infectieux, pathogènes, allergènes ou autoantigènes, avec un échantillon de sérum d'un patient, ou une dilution de celui-ci, puis la révélation des anticorps (par exemple IgG et/ou IgM) de l'échantillon fixés sur les dépôts au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que la lecture et l'analyse du marquage (e.g., de la fluorescence) sont réalisées au moyen d'un dispositif tel que défini précédemment. De préférence, le procédé d'analyse comporte trois longueurs d'onde d'analyse, excitant sélectivement trois colorants: le premier associé aux dépôts, préalablement à la réaction sérologique, le second associé au révélateur des immunoglobulines de type G et le troisième associé au révélateur des immunoglobulines de type M. Dans un mode de réalisation préféré, le colorant associé aux dépôt est excitable autour de 365 nm, le colorant associé au révélateur des immunoglobulines de type G est excitable autour de 470 nm et le colorant associé au révélateur des immunoglobulines de type M est excitable autour de 594 nm.
Un autre objet de l'invention sont les fonctionnalités du logiciel qui réalise l'analyse et qui comprend de préférence :
- les trois prises de vues digitales aux trois longueurs d'onde, correspondant respectivement à la fluorescence 1 témoin de la quantité déposée, la fluorescence 2 mesurant les immunoglobulines de type G et la fluorescence 3 mesurant les immunoglobulines du type M ;et/ou
- La normalisation de la fluorescence par rapport aux aléas du dépôt, à l'inhomogénéité de l'éclairement et aux variations des réactifs de révélation ; et/ou - La comparaison du signal par rapport à une échelle de positivité basée sur des sérum de contrôle ou basée sur des contrôles internes tels que décrits dans la demande FR2,864,624.
L'invention concerne donc un support comprenant un logiciel pour la mise en œuvre d'un dispositif selon la présente invention, mettant en œuvre les formules de l'exemple 3 ou d'autres formules similaires. L'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif tel que défini précédemment pour l'analyse sérologique ou en biologie moléculaire. De préférence, l'analyse en biologie moléculaire comporte l'analyse des acides ribonucléique ou desoxyribonucléiques d'un échantillon biologique. Dans ce cas, la lame de verre porte par exemple des dépôts d'ADN simple brin, destiné à capter les ADNc fluorescents provenant de l'échantillon. Par exemple, les longueurs d'onde d'excitations peuvent être choisies dans le voisinage de 543 nm pour les marquages endogènes avec la cyanine 3, dans le voisinage de 635 nm pour les marquages avec cyanine 5, dans le voisinage de 488 nm pour les marquages des parties hybridées avec Sybr Green ®(Molecular Probes, Eugène, Oregon). La liste n'est pas limitative.
Un autre aspect de l'invention concerne des kits, notamment d'analyse biologique, comprenant l'utilisation d'un dispositif tel que défini précédemment.
L'invention est applicable dans de nombreux domaines, notamment pour l'analyse histologique ou sérologique dans un contexte médical, vétérinaire, environnemental, agro-alimentaire, etc.
Description détaillée de l'invention
Comme indiqué précédemment, l'invention porte sur un dispositif adapté à l'analyse de lames. Les principaux éléments constitutifs sont présentés sur la figure 1. Le dispositif comporte avantageusement une embase solide (1) portant une plaque (2) ayant pour but de maintenir le positionnement des différents éléments les uns par rapport aux autres.
Chaque diode électroluminescente (3) est enfermée dans un étui (4) contenant le dispositif d'homogénéisation, l'ensemble constituant un canal d'éclairage emboîté dans un support (5) sur lequel est fixé la chambre porte lame (6). Au delà de celle-ci est vissé le premier objectif (7) qui est lui-même emboîté dans un manchon solidaire de l'étui du carousel à filtres (8). Symétriquement, au delà du carousel, on trouve le deuxième objectif (9) vissé sur la caméra CCD (10). L'allumage des diodes par le boîtier (11), le positionnement du porte-filtre et la mise en route de la caméra sont pilotés par un micro¬ ordinateur, qui par ailleurs contient le logiciel d'interpétation selon l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, l'axe optique de l'optique de reprise est horizontal. Les diodes électroluminescentes possèdent de préférence une puissance électrique comprise entre 500 et 5000 mW. Devant les diodes, on place un jeu de lentilles convergentes afin de donne au faisceau lumineux un parallélisme approximatif. Une divergence de moins de 10 degrés est préférée. Puis on place un filtre propre à restreindre la fenêtre spectrale de la lumière excitatrice. Une valeur préférée de la fenêtre est un intervalle égal ou inférieur à 40 nm.
Dans un mode de réalisation préféré, les longueurs d'onde excitatrices sont écartées les unes des autres, l'une dans le proche UV, une seconde dans le bleu, une troisième dans le jaune, l'orangé ou le rouge. Une valeur préférée de l'écart entre les longueurs d'onde excitatrices est un intervalle égal ou supérieur à 100 nm.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif d'homogénéisation est constitué par une surface diffusante à l'entrée d'un guide optique mélangeur constitué d'un tube de matière transparente à fort indice de réfraction d'une longueur comprise entre 20 et 40 mm de préférence, et d'un diamètre compris entre 6 et 10 mm de préférence. Dans ce cas, une lentille d'entrée concentre le faisceau avec un angle convenable, (figure 2)
Dans un autre autre mode de réalisation préféré, le dispositif d'homogénéisation est constitué par une surface diffusante, placée au foyer d'une lentille de collimation dont on forme l'image sur l'objet (montage dit de Kôhler) (figure 3).
Dans un mode de réalisation préféré, le diffuseur est de type holographique, à très grand rendement.
Dans un mode de réalisation particulier, la lame à mesurer est enchâssée dans un support amovible qui est lui-même glissé dans une fente. Le support est muni d'une ouverture au droit de la zone active de la lame. Un dispositif de blocage, tel qu'une butée à bille immobilise le dit support dans la position où sa fenêtre est dans l'axe de l'optique de reprise.
Dans un mode de réalisation préferré, la lame à mesurer est directement introduite dans le dispositif au travers d'une fente et positionnée par des appuis sur glissières, et ressorts sur la face opposée. Dans un mode de réalisation préferré, la lame est munie d'un détrompeur, par exemple une échancrure sur un angle, qui prévient une introduction erronée.
Les étuis porte diode et le logement de la lame constituent avantageusement un ensemble rigide qui peut être réalisé à partir de matériaux variés, éventuellement mélangés. Il peut en particulier être composé (ou à base de) de matériau plastique, de métal et/ou de tout matériau rigide à des températures de 37°C ou plus. Dans un mode de mise en œuvre préféré, le bloc est composé de nylon (delrin, rilsan) noir ou d'alliage d' aluminium anodisé ou peint pour éviter les reflets.
Dans un mode de réalisation préferré, le logement de la lame, ou le porte lame amovible sont réalisés en métal pour éviter toute déformation préjudiciable au maintien de la mise au point.
Dans un mode de réalisation préferré, les objectifs ont une distance focale comprise entre 20 et 40 mm. Dans un autre mode de réalisation préferré, l'objectif côté caméra a une distance focale inférieure à celle de l'objectif côté objet. Ainsi, une réduction est opérée qui augmente la capacité de capter en une seule image un nombre plus élevés de dépôts. La matrice photoélectrique a de préférence un nombre de pixels supérieur à 10 000.
Le capteur CCD peut être celui d'un appareil de photographie numérique tels que
« CoolPix » de Nicon, ou de manière préférée sur une Caméra telle que Hamamatsu 5885, Q-Imaging Qicam, Sony SVS, ou de toute autre marque. Il n'est pas nécessaire de refroidir le capteur, l'orientation oblique de la lumière excitatrice assure un excellent rapport signal/bruit. Dans un mode de réalisation possible, l'axe optique est vertical. Dans un mode de réalisation préféré, il est horizontal.
Dans un mode de mise en œuvre préféré du dispositif de l'invention, la lame fait saillie de la fente de mesure et permet la lecture d'un code à barre ou d'une étiquette électronique. Le dispositif selon l'invention comprend donc un lecteur de code barre ou une antenne de communication avec l'étiquette électronique. Ainsi, un objet particulier de la présente invention concerne des lames munies d'étiquettes électroniques sur lesquelles les caractéristiques de la lecture et les résultats de la lecture peuvent être enregistrées.
Ainsi, un objet particulier de la présente invention concerne l' algorithme de lecture propre aux lames de sérologie. Trois images sont enregistrées, avec trois fluorescences différentes. La première image, qui concerne un marqueur de fluorescence systématiquement attaché au dépôt au moment de la fabrication des lames, est analysée en termes de « clusters », c'est-à-dire d'éléments connexes, qui sont les dépôts. L'avantage de procéder ainsi est qu'il n'y a pas à positionner une grille sur l'image des dépôts, ce qui serait de toute manière imprécis du fait des distorsions inévitables de l'optique. On est également affranchi du jeu dans les glissières du logement de la lame et une analyse automatique devient possible. Les deux autres images, correspondant à deux autres marqueurs fluorescents, sont associées respectivement aux réponses immunoglobuline G et immunoglobuline M du patient. Les micro dépôts étant entachés d'une grande incertitude quant à leur quantité, c'est un élément de l'invention d'utiliser l'un des marqueurs fluorescents comme témoin de la quantité de matière déposée et d'utiliser le signal correspondant pour corriger les signaux représentatifs de la réaction sérologique. C'est un autre élément de l'invention d'utiliser des images d'une lame portant un élément diffusant ou fluorescent pour mesurer les différences locales d'éclairement et ensuite utiliser ces résultats pour corriger la fluorescence des dépôts pour les irrégularités de Féclairement. C'est un autre élément de l'invention que de rapporter la fluorescence associée aux anticorps d'un sujet s'étant fixé sur un dépôt d'antigène, à celle d'un dépôt de référence d'imunoglobulines pure, respectivement de type G ou de type M, rendu fluorescent par le même révélateur fluorescent anti IgG et anti IgM respectivement. Cela se comprendra mieux dans l'exemple 3.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif de l'invention comporte en outre un moyen pour assurer un déplacement de la lame perpendiculairement à l'axe optique pour pouvoir ainsi réaliser des images de différentes zones de la lame et aussi pouvoir mesurer un nombre accru de dépôts. Selon ce mode, jusqu'à 40 000 dépôts seraient lisibles, ce nombre étant un ordre de grandeur, et pouvant être dépassé selon les techniques de dépôts et le nombre de pixels du capteur.
Dans un autre mode de réalisation, on utilise un dispositif d'alimentation automatique en lames comportant un magasin à lames, un dispositif de lecture de l'identifiant et une mécanique de transfert à travers le dispositif de lecture.
Les dispositifs selon l'invention sont adaptés à tout type de lame de microscope.
Dans ce contexte, au sens de la présente demande, on entend par "lame" tout élément rigide porte-objet pouvant être utilisé pour immobiliser un dépôt biologique, délimitant ainsi une zone réactive. H peut s'agir par exemple d'une lamelle solide, d'une membrane, d'un filtre rendu transparent, etc. La lame peut être réalisée en (ou à base de) tout matériau connu et conventionnel, comme du plastique, verre, nylon, des polymères biologiques, de la silice, etc. Des lames préférées sont des lames porte-objet de microscopie en verre. Leurs dimensions sont généralement standard, soit environ 26mm x 76mm. Dans un mode de réalisation préféré, les lames sont munies d'un détrompeur, par exemple sous la forme d'une encoche dans un coin.
D'une manière particulièrement avantageuse, dans le dispositif de l'invention, la lame (ou les microarrays) utilisée pour le diagnostic ne comprend pas plus de 400 dépôts, par exemple, ce qui permet d'en former l'image de fluorescence en une seule prise de vue. Comme indiqué ci-dessus, la mise en place de la lame peut s'effectuer soit par un support, soit en glissant la lame dans une fente. Cette fente ménagée dans un matériau noir, est munie de lamages évitant de détériorer les dépôts lors d'une introduction, même erronée. Différents mode de réalisation et d'utilisation de l'invention sont décrits dans les exemples et dans les figures annexées, dans lesquelles:
La Figure 1 est un schéma général d'un dispositif conforme à l'invention. La Figure 2 est un schéma d'un canal d'éclairage à diode de type à guide mélangeur.
La figure 3 est un schéma d'un canal d'éclairage à diode avec un éclairage de type Kôhler.
La Figure 4 représente un écran de contrôle de la séquence d'acquisition. La Figure 5 représente la feuille de résultats correspondant à la figure 4. Les fluorescences des témoins IgG et IgM sont arbitrairement normalisées à 10 000.
Comme illustré sur les figures, l'invention peut être mise en œuvre pour l'analyse de lames de sérologie. Dans le mode sérologique, la lame porte une série de dépôts biologiques ("spots"), par exemple d'agents infectieux, pathogènes, d'autoantigènes ou d'allergènes. Les dépôts sont soigneusement repérés, ce repérage constituant un code d'identification. L'échantillon liquide à tester est un sérum de patient, généralement dilué dans un tampon approprié. Le traitement de la lame peut être effectué par des moyens manuels, consistant en trempage dans des bains successifs, ou par des moyens automatiques tels que décrits dans la demande de brevet FR0403365.
L'invention peut également être mise en œuvre pour l'analyse de biologie moléculaire, soit en mode fluorescence, comme précédemment décrit, soit en mode densité optique. Dans ce dernier cas, les lames portent un support de nylon sur lequel sont déposés les spots, l'éclairage est diffusé par le nylon et les spots absorbent la lumière. Ils sont détectés et quantifiés comme taches sombres sur fond clair.
D'autres aspects et avantages de le présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Exemple 1 - Description d'un dispositif selon l'invention Ce mode de mise en œuvre est décrit en relation avec la Figure n°l . Les diodes électroluminescentes sont :
Nichia-NCCUOOl ou NCCU0033 pour l'excitation UV, associée au filtre Semrock FF 409-Ex02 ; Lumileds LXHL -MBlD pour l'excitation à 470 nm, associée au filtre
Semrock FF 506-Ex03 A ;
Lumileds LXHL -MLlD pour l'excitation à 594 nm, associée au filtre Chroma Technologies HQ590/40.
Le dispositif d'homogénéisation est du type à guide de lumière. Le porte lame est réalisé en DeMn noir.
L'optique de reprise comprend :
- un objectif Fujinon f=25 mm réglé à l'infini ;
- trois filtres : Semrock FF 409-Em02-B, Semrock FF 506-Em02-B et Chroma HQ655/40 montés dans un porte filtre linéaire en aluminium anodisé noir ; - un objectif Fujinon f=25mm réglé à l'infini.
L'image est projetée sur le capteur d'une caméra SVS Vistek SV084 « S » comportant 658x494 pixels.
L'ensemble est piloté par un micro-ordinateur portant un logiciel de pilotage, de lecture et d'analyse selon l'invention.
Exemple 2 - Description d'une analyse selon l'invention
Une lame de sérologie porte 12 dépôts, arrangés en 3 lignes et 4 colonnes au pas de 0,5 mm. Les deux premiers dépôts de la première ligne sont des témoins d'imunoglobulines IgG et IgM respectivement. Les autres dépôts sont des agents infectieux.
Avant toute incubation, tous les dépôts fluorescent dans le bleu, sous excitation
360-380 nm. La lame est d'abord incubée trente minutes avec le sérum du patient. Ensuite, après un rinçage, la lame est incubée dix minutes avec les réactifs anticorps secondaires qui sont un anticorps de chèvre anti immunoglobuline G humaine marquée à la fluorescéine, et un anticorps de chèvre anti immunoglobuline M humaine marquée au Texas red, en mélange. Les dépôts ayant fixé des IgG ont une fluorescence verte excitable à 470 nm et les dépôts contenant des IgM ont une fluorescence rouge excitable à 594. Seule l'image excitée à 365 nm est présentée (figure 4).
Exemple 3 —Traitement du signal selon l'invention
L'algorithme vise à corriger la fluorescence des spots : des aléas des dépôts, des irrégularités d'éclairement, et des réactifs.
Notation Si : surface du spot i ; l'indice i varie de 1 à n, nombre des spots ; la valeur i=g est associée au spot témoin IgG, la valeur i=m est associée au spot témoin IgM.
Fjj : fluorescence du spot i à la longueur d'onde j, fond déjà soustrait, j = 1 éclairage UV (référence) j = 2 éclairage 470 j = 3 éclairage 594
Eij : éclairement de la surface Sj à la longueur d'onde j
Zi2 et Zi3 sont appelés fluorescences relatives. Elles sont utilisées pour quantifier les teneurs de l'échantillon en anticorps IgG et IgM respectivment, spécifiques de l'antigène i.
Les fluorescences relatives, par exemple Zj2, ont bien les propriétés attendues. En effet :
- Toutes choses égales par ailleurs, taille des spots, éclairement, réactifs fluorescents , la fluorescence relative z;2 est proportionnelle au signal spécifique Fj2 qui représente l'intensité de la réaction sérologique, ou de la réaction d'hybridation. - Les surfaces ne figurent pas dans l'expression de za, elle ne dépend donc pas du plus ou moins grand étalement du dépôt sur la lame.
- Elle ne dépend pas de la quantité du dépôt, qui fait varier dans le même rapport F;2 et Fj1 par exemple, au numérateur et au dénominateur.
- Elle ne dépend pas de l'intensité de Féclairement dans la zone du dépôt, qui fait varier dans le même rapport Fj2 et Ej2 car la fluorescence d'une surface est proportionnelle à son éclairement.
- Elle ne dépend pas de la qualité du réactif qui fait varier dans le même rapport
On peut utiliser les formules simplifiées suivantes, dans la mesure où la densité du marquage UV est constante, ce sont les fluorescences normalisées Fn2(i), Fn3 (i) :
Fn3 (i) = i3 m3 pour les IgM
Ei3Fm3 qui jouissent des mêmes propriétés d'invariance.
La même analyse prévaut pour la fluorescence relative z;3. Les résultats correspondant à l'exemple 3 sont présentés dans la figure 5.

Claims

Revendications
1. Dispositif de lecture et/ou d'analyse de lames comportant une zone réactive portant des micro dépôts d'éléments réactifs, ledit dispositif comprenant des moyens de mise en place d'une lame, des moyens d'éclairement de la zone réactive et une optique de reprise, caractérisé en ce que :
- les moyens d'éclairement de la zone réactive comprennent des diodes électroluminescentes agencées en canaux pour permettre un éclairement de manière oblique par rapport à l'axe optique, c'est-à-dire l'axe selon lequel la lumière fluorescente émise par les micro dépôts est captée par l'optique de reprise ;
- le dispositif comprend au moins deux canaux de diodes émettant chacun une lumière d'excitation propre; et
- l'optique de reprise comporte un objectif formant l'image des micro dépôts sur un capteur.
2. Dispositif selon la revendication I5 caractérisé en ce que l'axe du canal d'éclairage est oblique par rapport à l'axe optique avec un angle supérieur ou égal à 15°.
3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'axe du canal d'éclairage est oblique par rapport à l'axe optique avec un angle supérieur ou égal à 20°.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux diodes, chaque diode émettant une lumière d'éclairage propre ayant une longueur d'onde dans le proche UV ou le visible, les longueurs d'onde étant sufisamment écartées pour permettre l'excitation sélective des molécules fluorescentes.
5. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que les longueurs d'onde d'excitation sont écartées d'intervalles égaux ou supérieurs à 100 nm.
6. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en ce que la lumière d'éclairage émise par chacune des diodes suit une direction distincte.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend des éléments homogénéisant Téclairement de la zone des dépôts sur la lame.
8. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif homogénéisant l'éclairement de type Kôhler.
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que chaque canal comporte successivement au moins une diode, un filtre destiné à restreindre le spectre de la lumière excitatrice émise par cette diode et, éventuellement, un dispositif optique destiné à uniformiser la répartition spatiale de la lumière et/ou un condenseur orientant la lumière vers la zone réactive de la lame.
10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le dispositif optique destiné à uniformiser la répartition spatiale de la lumière comprend un diffuseur holographique.
11. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'optique de reprise forme l'image des dépôts sur un capteur CDD.
12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'optique de reprise comporte un premier objectif dont un foyer coïncide avec la zone réactive de la lame, un carousel de filtres et un deuxième objectif formant l'image.
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens d'alimentation automatique de lames et, éventuellement, un lecteur d'identifiant de lames.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une embase solide et/ou une console, assurant le maintien ensemble des moyens de mise en place de lame, des moyens d'éclairement de la zone réactive et de l'optique de reprise.
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend trois canaux de lumière excitatrice, l'un centré autour de 365 nm, le deuxième autour de 470 nm, le troisième autour de 594 nm.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est exploité ou commandé par un logiciel capable d'effectuer des comparaisons des niveaux de fluorescence d'un même dépôt à différentes longueurs d'onde et de dépôts différents à la même longueur d'onde.
17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce que le logiciel utilise des images pré-enregistrées de surfaces uniformes, fluorescentes ou simplement diffusantes, pour calculer une correction fine de la fluorescence des dépôts aux différentes longueurs d'onde.
18. Procédé d'analyse sérologique comprenant l'incubation d'une lame de sérologie comprenant une zone réactive comportant une série de dépôts d'agents biologiques, par exemple infectieux, pathogènes, allergènes ou autoantigènes, avec un échantillon de sérum d'un patient, ou une dilution de celui-ci, puis la révélation des anticorps de l'échantillon fixés sur les dépôts au moyen de réactifs marqués, caractérisé en ce que la lecture et l'analyse du marquage sont réalisées au moyen d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
19. Procédé d'analyse sérologique selon la revendication 18, comportant trois longueurs d'onde d'analyse, excitant sélectivement trois colorants: le premier associé aux dépôts, préalablement à la réaction sérologique, le second associé au révélateur des immunoglobulines de type G et le troisième associé au révélateur des immunoglobulines de type M.
20. Procédé d'analyse sérologique selon la revendication 19, caractérisé en ce que le colorant associé aux dépôt est excitable autour de 365 nm, le colorant associé au révélateur des immunoglobulines de type G est excitable autour de 470 nm et le colorant associé au révélateur des immunoglobulines de type M est excitable autour de 594 nm.
21. Support comprenant un logiciel pour la mise en œuvre d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 17, mettant en œuvre les formules de l'exemple 3.
22. Utilisation d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour l'analyse sérologique ou l'analyse des acides ribonucléiques ou desoxyribonucléiques d'un échantillon biologique en biologie moléculaire.
EP05793765A 2004-08-02 2005-08-01 Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique Withdrawn EP1774295A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0408520A FR2873815B1 (fr) 2004-08-02 2004-08-02 Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique
PCT/FR2005/002009 WO2006024772A1 (fr) 2004-08-02 2005-08-01 Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1774295A1 true EP1774295A1 (fr) 2007-04-18

Family

ID=34949599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP05793765A Withdrawn EP1774295A1 (fr) 2004-08-02 2005-08-01 Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7812952B2 (fr)
EP (1) EP1774295A1 (fr)
JP (1) JP5060292B2 (fr)
AU (1) AU2005279081A1 (fr)
CA (1) CA2576779A1 (fr)
FR (1) FR2873815B1 (fr)
WO (1) WO2006024772A1 (fr)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110664012A (zh) 2013-12-23 2020-01-10 尤尔实验室有限公司 蒸发装置系统和方法
US10058129B2 (en) 2013-12-23 2018-08-28 Juul Labs, Inc. Vaporization device systems and methods
TW202425830A (zh) 2014-02-06 2024-07-01 美商尤爾實驗室有限公司 用於產生可吸入蒸汽之電子裝置
WO2015175433A1 (fr) 2014-05-12 2015-11-19 Cellomics, Inc. Imagerie automatisée d'échantillons marqués par des chromophores
US9686540B2 (en) * 2014-06-23 2017-06-20 Xerox Corporation Robust colorimetric processing method for paper based sensors
UA125687C2 (uk) 2016-02-11 2022-05-18 Джуул Лебз, Інк. Заповнювальний картридж випарного пристрою та способи його заповнення
SG10202108578XA (en) 2016-02-11 2021-09-29 Juul Labs Inc Securely attaching cartridges for vaporizer devices
US10912333B2 (en) 2016-02-25 2021-02-09 Juul Labs, Inc. Vaporization device control systems and methods
EP3568677A4 (fr) 2017-01-10 2020-10-21 Photoswitch Biosciences, Inc. Systèmes et procédés de détection
JP6656210B2 (ja) * 2017-07-21 2020-03-04 株式会社日立ハイテクサイエンス 分光蛍光光度計

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004017374A2 (fr) * 2002-08-16 2004-02-26 Clinical Microarrays, Inc. Lecture de reseaux fluorescents
WO2004063731A1 (fr) * 2003-01-16 2004-07-29 Olympus Corporation Capteur optique

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854684A (en) * 1996-09-26 1998-12-29 Sarnoff Corporation Massively parallel detection
DE19914279C1 (de) * 1999-03-25 2000-09-07 Jena Optronik Gmbh Anordnung zum optischen Auslesen der Information von einem matrixförmigen Substrat mit einer Vielzahl von Einzelproben
WO2002093144A1 (fr) * 2001-05-10 2002-11-21 Regents Of The University Of Minnesota Imagerie d'echantillons biologiques au moyen d'un photodetecteur electronique
CA2459570A1 (fr) * 2001-09-05 2003-03-13 Genicon Sciences Corporation Dispositif pour la lecture de signaux emis par des particules a dispersion de la lumiere de resonance utilisees comme marqueurs
DE10223438B4 (de) * 2002-05-24 2005-11-03 Bayer Healthcare Ag Fluoreszenz-Mess-System
FR2845488B1 (fr) * 2002-10-08 2004-12-17 Trophos Dispositif optique pour l'observation d'echantillons sur un support, destine notamment a un cytometre

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004017374A2 (fr) * 2002-08-16 2004-02-26 Clinical Microarrays, Inc. Lecture de reseaux fluorescents
WO2004063731A1 (fr) * 2003-01-16 2004-07-29 Olympus Corporation Capteur optique

Also Published As

Publication number Publication date
US7812952B2 (en) 2010-10-12
FR2873815A1 (fr) 2006-02-03
FR2873815B1 (fr) 2006-11-24
US20080068602A1 (en) 2008-03-20
AU2005279081A1 (en) 2006-03-09
JP2008508537A (ja) 2008-03-21
CA2576779A1 (fr) 2006-03-09
JP5060292B2 (ja) 2012-10-31
WO2006024772A1 (fr) 2006-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006024772A1 (fr) Dispositif de lecture pour lames portant des micro depots supports de reaction biologique
CA2294005C (fr) Appareil d'eclairage de l'objet a examiner avec cavite optique pour eclairage sur fond noir et procedes d'utilisation
Liu et al. Pocket MUSE: an affordable, versatile and high-performance fluorescence microscope using a smartphone
EP1825317B1 (fr) Systeme optique pour imagerie cellulaire
JP6513802B2 (ja) ナノ粒子検出のためのレーザー光結合
SE531233C2 (sv) Anordning och förfarande för detektion av fluorecensmärkta biologiska komponenter
KR100500610B1 (ko) 형광 현미경 및 이를 사용한 관측 방법
WO2006055521A3 (fr) Train optique et procede de detection et d'analyse tirf de molecule unique
JPH09113448A (ja) レーザ誘起２光子蛍光相関分光分析を実施する装置
EP1285301B1 (fr) Dispositif d'observation sequentielle d'echantillons et procedes l'utilisant
JPWO2019131947A1 (ja) 分光分析装置、分光分析方法、プログラム、記録媒体及び顕微鏡
US8964183B2 (en) Systems and methods for screening of biological samples
WO2021158629A1 (fr) Appareil et procédé de cytométrie de flux cyclique utilisant une identification de cellule particularisée
CA2808191A1 (fr) Dispositif lecteur de microplaques
WO2008132325A2 (fr) Dispositif de lecture de fluorescence
JP2009002774A (ja) 生体物質検出装置
EP1463969B1 (fr) Dispositif de positionnement d'une plaque d'analyse d'echantillons sur un dispositif d'observation
US20150125899A1 (en) Fluorescence-assisted counting apparatus for qualitative and/or quantitative measurement of fluorescently tagged particles
Bock et al. Use of diode lasers in an evanescent wave immunosensor for stationary and time-resolved detection of antigens
Swaim Overview of confocal microscopy
Chen et al. 64-channel label-free fluorescence detection and single-particle counting device
Wiklund et al. Microscopy for Acoustofluidic Micro-Devices
Bae et al. Fluorescence microscope using total internal reflection
BE1025622A1 (fr) Dispositif de lecture optique matricielle d’un support solide amovible pour la détection et/ou la quantification d’analytes présents dans un échantillon
BE1025624A1 (fr) Dispositif de lecture optique avec choix de méthode de lecture automatisé d’un support solide amovible pour la détection et/ou la quantification d’analytes présents dans un échantillon

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20070117

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR

17Q First examination report despatched

Effective date: 20070530

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: NICOLAI, GILLES

Inventor name: DECAUDIN, JEAN-MICHEL

Inventor name: HUGUET-CHANTOME, PASCALRESIDENCE LOUBASSANE - H2

Inventor name: DELAAGE, MICHEL

APBK Appeal reference recorded

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNREFNE

APBN Date of receipt of notice of appeal recorded

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNNOA2E

APBR Date of receipt of statement of grounds of appeal recorded

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNNOA3E

APAF Appeal reference modified

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSCREFNE

APBT Appeal procedure closed

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNNOA9E

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20140304