CN116966301A - Fap蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供FAP蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途,涉及生物医药领域。抗衰老疗法的开发需要高敏感性和特异性的衰老细胞标志物,由于衰老细胞异质性较大,目前仍然缺乏在在各组织中广泛存在,且灵敏度高、特异性强的体内衰老细胞标志物。本发明提供FAP蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途,FAP在各种衰老疾病中的衰老细胞中表达上升,通过靶向识别FAP蛋白的手段来消除衰老细胞或者抑制衰老细胞的致病作用,为制备清除衰老细胞试剂上提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及FAP蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途。
背景技术
以下的背景技术介绍仅仅是一些背景常识的介绍,不会对本发明构成任何限制。
Senolytics(选择性消除衰老细胞的药物)自被报道以来就引起了广泛关注。由于那些30-70%具有促凋亡、组织破坏性SASP(全称是senescence-associated secretoryphenotype,衰老相关分泌表型)的衰老细胞本身对凋亡具有抗性。对蛋白质组学和转录组学数据的分析表明,衰老细胞中确实存在一种或多种衰老细胞抗凋亡途径(SenescentCell Antiapoptotic Pathways,SCAPs)的上调。SCAP途径保护衰老细胞使其自身能够避免凋亡,瞬时阻断SCAP途径能够导致衰老细胞凋亡,而非衰老细胞仍能存活。但是,由于衰老细胞异质性大,在某些类型的衰老细胞中,SCAPs是冗余的,因此靶向单个SCAP的Senolytics不能有效清除所有类型的衰老细胞。另外,一些Senolytics如BCL-2途径抑制剂ABT-263、A1331852或A1155463,可引起血小板减少和中性粒细胞减少。因此,尽管在多种小鼠临床前模型中Senolytics可以缓解多种衰老相关机体障碍和疾病,但是在Senolytics的临床试验中,部分研究由于疗效不佳而提前终止(NCT04349956)。
另一种能够降低衰老细胞累积和减轻相关病理条件的手段是调节衰老细胞的免疫清除。这是因为某些细胞表面蛋白(抗原)在衰老细胞中的表达往往比其他类型(例如非衰老细胞)细胞更高。这促使了针对这些细胞表面标记的嵌合抗原受体(Chimeric AntigenReceptor,CAR)T细胞的发展。2020年,C.Amor,J首次报道了构建针对PLAUR的CAR-T细胞可以靶向消除PLAUR(全称Urokinase Plasminogen Activator Surface Receptor,尿激酶纤溶酶原激活物表面受体)阳性的细胞,在体内和体外都能特异性地杀死衰老细胞,能延缓衰老相关的肝脏纤维化并延长肺腺癌小鼠的寿命。然而目前还不清楚PLAUR(是否主要表达在那些具有促凋亡、促炎症、破坏组织的SASP的衰老细胞,还是那些主要具有促进生长的SASP的细胞,又或者两种类型的衰老细胞上都表达。此外,CAR-T细胞治疗也面临着治疗费用昂贵、实体组织浸润能力较弱、并可能引起引发炎症因子风暴和移植排异需要接受长期有风险的免疫抑制治疗的缺陷。
单个Senolytics(选择性消除衰老细胞的药物)的有效性较弱,且可能引起血小板减少和中性粒细胞减少的毒/副作用,而传统的CAR-T细胞面临着治疗费用昂贵、实体组织浸润能力较弱、并可能引起引发炎症因子风暴和移植物抗宿主病的缺陷。
这就需要对传统技术进行改进,或者发现新的衰老细胞的新的表面蛋白,从而可以有效的消除衰老细胞,从而延缓衰老。
发明内容
针对上述情况,为克服现有技术的缺陷,本发明提供FAP蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途。
本发明发现成纤维细胞活化蛋白α(FAP,Fibroblast Activation ProteinAlpha,Ensembl:ENSG00000078098,UniProtKB/Swiss-Prot:Q12884)表面蛋白在范围广泛的体外和体内哺乳动物衰老模型中通常被上调。所述FAP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID:1所示,编码FAP蛋白的核酸具有如SEQ ID:2的序列,表达FAP的DNA是编码为NG_027991.1的基因。
FAP的上调响应于所有测试的衰老触发因素而发生:复制诱导的衰老和药物诱导的衰老(例如多柔比星)和致癌基因诱导的衰老。发现FAP蛋白的上调存在于大多数衰老细胞中,例如存在于一些疾病导致的衰老疾病中,例如肺纤维化、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、糖尿病、肝纤维化、慢性肾病、衰老或骨关节炎,并改善接受衰老诱导疗法(例如化疗药物)的受试者的肿瘤反应性等疾病导致衰老细胞的积累,在这些衰老细胞中发现FAP蛋白的上调。
所以,本发明发现FAP是与衰老细胞相关联的,当FAP蛋白的表达或者含量上调,则预示着衰老细胞的出现或者衰老细胞的增加或者积累,这种积累可能是先从患病的局部组织或者器官开始,然后导致全身性的积累。
所有能够抑制FAP蛋白表达的手段都可以用来消除衰老细胞或者抑制衰老细胞。
例如单抗或者抗体片段,多肽等可以结合FAP蛋白,从而抑制衰老细胞,或者通过能够表达抗FAP的抗体或者抗体片段,或者多肽的载体或者免疫细胞,从而可以定向的杀死或者消除衰老细胞。
还可以是一些核酸类药物,通过载体定向递送给衰老细胞中,从而封闭,抑制表达FAP蛋白的DNA的表达,或者RNA的转录翻译,或者FAP蛋白形成的任何过程中的限制或者抑制等。
还是可以是一些化学药物结合FAP蛋白,从而消除或者抑制带有FAP蛋白的衰老细胞。例如体外表达或者体内表达能够与FAP氨基酸序列任何位置结合的抗体,单抗,抗体片段,多肽,甚至化学药物等制剂都可以抑制FAP的活性。或者通过基因敲出,基因编辑,基因沉默让表达FAP蛋白的DNA沉默、变异等,从而减少或者不表达FAP蛋白都是可以的。
在一些方式中,可以利用工程化免疫细胞来效地消除了表达FAP(Gene ID:2191)的衰老细胞。这种工程化的免疫细胞可以特异消除表达FAP的衰老细胞,而不会对宿主动物造成任何不需要的毒/副作用。任何工程化免疫细胞的免疫细胞都可以来表达抗FAP的抗体或者抗体片段,或者多肽。凡是能够结合FAP蛋白的任何试剂都可以抑制该蛋白的活性,从而抑制或者消除带有FAP的衰老细胞。
可以理解,上述结合FAP抗原的任何氨基酸片段或者表达氨基酸的核酸片段不一定都是通过工程免疫细胞获得,还可以通过任何其它手段获得,比如体外表达,例如酵母表达,或者通过载体递送到含有FAP衰老细胞中进行表达,或者采用基因工程手段进行表达FAP基因的编辑,变异,或者沉默等等都是可以的。采用工程免疫细胞仅仅是一种可选的实现方式。
所以,本发明提供FAP蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途。
在一些方式中,所述清除衰老细胞试剂包括靶向FAP蛋白的嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体带有能够结合FAP的区域。在一些方式中,所述的嵌合抗原受体结构包括胞外结构域,跨膜结构域以及胞内结构域。在一些方式中,所述的胞外结构域包括特异结合FAP蛋白的区域以及间隔区。
进一步的,所述清除衰老细胞试剂还包括细胞,所述细胞经靶向FAP蛋白的嵌合抗原受体修饰,所述细胞包括单核细胞、巨噬细胞或者树突状细胞中的任意一种或多种。
进一步的,所述清除衰老细胞试剂是细胞,所述细胞为巨噬细胞。巨噬细胞具有独特的组织浸润能力,可以穿透实体瘤,而其他免疫细胞(如T细胞)则被排斥或失活,因此包含了靶向FAP蛋白的嵌合抗原受体的巨噬细胞可用于清除实体瘤内的衰老细胞。此外,巨噬细胞不会诱发移植物抗宿主病,从而提高了它们做为即用型(off-the-shelf)细胞来源的前景。由于其天然的吞噬活性和独特的组织渗透能力,工程化的巨噬细胞在浸润消除致密实体组织(如骨关节软骨或滑膜)内部的衰老细胞方面具有先天优势。
进一步的,所述衰老细胞包括细胞复制、药物、或致癌基因中的任意一项或多项诱导的衰老细胞。所述的衰老细胞表面带有FAP蛋白,所述FAP的氨基酸序列如SEQ ID:1所示,编码FAP蛋白的核酸具有如SEQ ID:2的序列。
进一步的,所述药物诱导的衰老细胞包括MEK抑制剂和/或Cdk4/6抑制剂诱导的衰老细胞,所述MEK抑制剂包括曲美替尼、和/或多柔比星;所述Cdk4/6抑制剂包括palbociclib;所述致癌基因包括HRASG12D、NRASG12D、NRASG12D、D38A中的任意一种或多种。
另一方面,本发明提供FAP蛋白用于制备治疗衰老细胞引发疾病的试剂上的用途。
进一步的,所述衰老细胞引发疾病包括心脏纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、糖尿病、肝纤维化、慢性肾病、衰老或骨关节炎中的任意一种或多种。
另一方面,本发明提供FAP蛋白用于制备预测或检测是否为衰老细胞的试剂的用途。由于FAP是与衰老细胞相关联的,FAP在衰老细胞中表达提高,FAP表达量可作为判断细胞是否衰老的标准。FAP可作为骨关节炎免疫治疗中衰老细胞表面标志物。所述衰老细胞表面标志物的使用方法为,采用qPCR、免疫荧光法和流式细胞术相对定量,FAP含量相比于对照组出现统计学显著性差异者,即可判断为衰老细胞。
另一方面,本发明提供一种嵌合抗原受体在制备清除衰老细胞试剂或治疗衰老细胞引发疾病或治疗骨性关节炎中的用途,所述嵌合抗原受体包含靶向FAP的抗体片段。
另一方面,本发明提供一种免疫工程细胞在制备清除衰老细胞或治疗衰老细胞引发疾病或治疗骨性关节炎中的用途,所述免疫工程细胞包含嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包含靶向FAP的抗体片段。
进一步的,所述免疫工程细胞为巨噬细胞、单核细胞或树突状细胞中的任意一种或多种。在此用途中选择巨噬细胞作为免疫工程细胞,包含FAP特异性嵌合抗原受体后可以选择性地靶向表达FAP的衰老细胞,发挥其吞噬效应,实现清除衰老细胞的目的,同时不影响正常增殖细胞,也不会对宿主动物造成任何不需要的毒/副作用。
另一方面,本发明提供一种嵌合抗原受体,包含胞外结构域、胞内结构域和跨膜结构域。胞外结构域包括靶向FAP抗原结合结构域。
进一步的,嵌合抗原受体的胞外结构域包括靶向FAP抗原结合结构域,所述靶向FAP抗原结合结构域为可以靶向FAP抗原的抗体片段,所述FAP具有如SEQ ID:1所示的氨基酸序列,编码FAP蛋白的核酸具有如SEQ ID:2的序列。
进一步的,所述嵌合性抗原受体的胞外结构域含有但不限于scFv、Fab、scFab、或scIgG抗体片段,以用于识别并结合FAP特异性抗原/相关性抗原。
在一些方式中,所述抗体片段包括重链和/或轻链,所述重链包括VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3中的任意一种或多种,轻链包括VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3中的任意一种或多种;所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3分别具有如SEQ ID:4~9所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:4~9任意一项或多项所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
在一些方式中,所述抗体片段为scFv,所述scFv包含重链和/或轻链,所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID:11所示,或与SEQ ID:10和/或SEQ ID:11所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
进一步的,所述scFv具有如SEQ ID:12和/或SEQ ID:13所示的核苷酸序列,或与SEQ ID:12和/或SEQ ID:13所示的核苷酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
在一些方式中,所述共刺激结构域可以增强受体信号,共刺激结构域包含但不限于4-1BB(CD137)、CD80、CD86、FcεRI共同γ亚基(即FcsRIγ)和CD28胞内段中的一种或多种的片段。所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID:24所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:24所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述4-1BB具有如SEQ ID:3所示的核酸序列,或与SEQ ID:3所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
在一些方式中,优选含有CD28胞内段,当嵌合抗原受体位于巨噬细胞,采用CD28胞内段作为共刺激结构域,有以下优势:1.可以促使巨噬细胞发生抑炎性的M2型极化,从而可以应用于治疗需要避免或消除炎症反应的疾病,2.CD28胞内段可以使巨噬细胞具有更高的吞噬效应,3.CD28胞内段可以使表达嵌合抗原受体的巨噬细胞对靶细胞上FAP抗原密度的响应阈值更低,特别是对于FAP表达较低的衰老软骨细胞的吞噬,CD28胞内段相较于其余共刺激结构域具有更明显的优势。所述CD28胞内段的氨基酸序列如SEQ ID:14所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:14所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述CD28胞内段具有如SEQ ID:15所示的核酸序列,或与SEQ ID:15所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
当共刺激结构域为FcεRI共同γ亚基或CD28胞内段可以实现较高的巨噬细胞吞噬效应,在一些实施例中,当衰老细胞为FAP表达水平较低的人衰老软骨细胞,含有CD28胞内段的CAR-M对FAP阳性靶细胞具有更高的吞噬率达到38.75%。当衰老细胞为衰老成纤维细胞时,FcεRIγ和CD28胞内段可分别提高巨噬细胞的吞噬效应至41.5%,37.0%。
可以理解,任意可以实现刺激增强受体信号的多肽片段都可以被包含于本发明所提供嵌合抗原受体的共刺激结构域,共刺激分子包括但不限于TCR、CD3zeta、CD3 gamma、CD3 delta、CD3 epsilon、CD86、常见FcR gamma、FcR beta(Fc Epsilon Rib)、CD79a、CD79b、Fcgamma Rlla、DAPIO、DAP 12,T细胞受体(TCR),CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIG HT,KG2C、B7-H3、一种与CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、Kp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta特异性结合的配体,IL2R gamma,IL7R alpha,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CDlld,ITGAE,CD103,ITGAL,CDlla,LFA-1,ITGAM,CDllb,ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD 18、LFA-1、ITGB7、T FR2、TRANCE/RAKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM,Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Lyl08),SLAM(SLAMFl,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、Kp44、Kp30、Kp46、KG2D、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段,具有可刺激信号增强的特征的共刺激分子的任何合成序列相同的功能能力,及其任意组合。
在一些方式中,所述胞内活化区域包含但不限于FcεRIγ、CD3ζ中的一种或多种。胞内活化区域可实现信号转染。优选的,所述胞内活化区域为CD3ζ,所述CD3ζ具有如SEQID:16所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:16所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述CD3ζ具有如SEQ ID:17所示的核酸序列,或与SEQ ID:17所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。FcεRIγ含有一个免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM),该基序是介导巨噬细胞吞噬活性的重要信号转导区,CD3ζ含有3个ITAM基序,其在结构、分布及功能上与FcεRIγ类似。ITAM数量越多,下游信号越强,免疫细胞的响应也越强。所述FcsRIγ具有如SEQ ID:22所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:22所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述FcsRIγ具有如SEQ ID:23所示的核酸序列,或与SEQ ID:23所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
在一些方式中,所述跨膜结构域含有CD28或CD8,所述CD28和CD8分别具有如SEQID:18~19所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:18~19所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述CD28和CD8分别具有如SEQ ID:20~21所示的核酸序列,或与SEQ ID:20~21所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
在一些方式中,所述嵌合抗原受体的胞外结构域还包括将靶向FAP抗原结合结构域和跨膜结构域相连的间隔区域。
在一些方式中,所述的间隔区可以足够灵活以允许抗原结合结构域定向在不同方向,可以促进抗原识别同时保持CAR的激活活性。在一些实施例中,所述嵌合抗原受体的跨膜结构域中采用CD8,会有CD8的α铰链表达在所述间隔区,有利于嵌合抗原受体对靶细胞上FAP抗原密度的响应性,可以使嵌合抗原受体巨噬细胞识别FAP表达较低的衰老软骨细胞(FAP表达相对于非衰老细胞上调20倍)。
在某些非限制性实施方案中,间隔区包括但不限于CD28的一部分、CD8的一部分、免疫球蛋白的CH2CH3区、CD3的一部分、IgGl的铰链区中的任意一种或多种,所述CD28和CD8分别具有如SEQ ID:18~19所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:18~19所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述CD28和CD8分别具有如SEQ ID:20~21所示的核酸序列,或与SEQ ID:20~21所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列或合成的间隔序列。任何前述变体与其至少约80%、至少约85%、至少约90%、或至少约95%同源,或合成的间隔序列。在某些非限制性实施方案中,间隔区的长度可介于约1-50个(例如,5-25、10-30或30-50)个氨基酸之间。
另一方面,本发明提供一种包含嵌合抗原受体的修饰细胞,细胞表达本发明所提供的嵌合抗原受体,所述细胞为免疫细胞,在一些方式中,所述细胞为单核细胞、巨噬细胞或者树突状细胞中的一种或多种。
在某些实施方案中,可以使用本领域可用的任何数量的单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或祖细胞系。这些细胞不一定来自受试者。在某些实施方案中,可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术,例如Ficoll分离,从从受试者收集的血液单位中获得细胞。在一个实施方案中,来自个体骨髓来源细胞通过单核细胞分离术获得。在一个实施方案中,培养包含单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的细胞或细胞群用于扩增。在另一个实施方案中,培养包含祖细胞的细胞或细胞群用于单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的分化和扩增。在不做限制的可选方案中,由多能干细胞(如胚胎干细胞)分化而来的单核细胞或巨噬细胞也可以作为替代方案。
本发明包括扩增包含本文所述的包含本发明所提供嵌合抗原受体的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞群。
进一步的,所述细胞表达嵌合抗原受体的方式为,采用载体转染细胞,所述载体包括质粒载体、病毒载体、反转录转座子(例如piggyback、睡美人)、定点插入载体(例如CRISPR、Zn指核酸酶、TALEN)或自杀表达载体,或其他本领域已知的载体。
在一个实施例中,优选的,所述载体为慢病毒载体。采用慢病毒作为载体转染巨噬细胞可以避免产生促炎性的M1型极化,从而更加有利于促进产生抑炎性的M2型极化。避免了目前对巨噬细胞极化采用Ad5f35腺病毒载体,从而避免了产生M1型极化。当巨噬细胞产生促炎性M1型极化,会因为产生促炎细胞因子,如白细胞介素-1β(IL-1β),IL-6,IL-12,IL-23和TNF-α而不适宜用于表达靶向FAP特异性的嵌合抗原受体进行靶向衰老细胞的治疗,只有抑炎性的M2型极化的巨噬细胞适用于退行性疾病的组织再生治疗。优选的,当巨噬细胞表达的本发明所提供的嵌合抗原受体的共刺激结构域具有CD28胞内段时,采用慢病毒作为载体,可以稳定地促进巨噬细胞发生M2型极化。
现有的促M2型极化巨噬细胞的方式为,在转染使巨噬细胞等细胞表达嵌合抗原受体的同时,进一步表达信号因子以抑制产生M1型极化的通路,比如TNF-α/NF-KappaB通路、TLR/MyD88通路,通过这样的方法实现促进M2型巨噬细胞。本发明提供的巨噬细胞M2型极化的调节方式,除了需要表达的嵌合抗原载体不需要表达任何其余信号因子,相比于现有技术具有高效、稳定的优势。
在一些实施例中,采用的载体为慢病毒,相比于常规的感染方式,采用离心感染(spinfection)可以提高嵌合抗原受体的表达率提高4.7倍至57%。
当FAP特异性嵌合抗原受体巨噬细胞应用于小鼠或人类骨性关节炎模型的治疗,可有效地清除FAP阳性的衰老细胞产生治疗效果。比如可以清除衰老的软骨细胞。在一些实施例中,本发明所提供的FAP特异性嵌合抗原受体巨噬细胞应用于小鼠创伤性骨关节炎模型的治疗中,除了可以有效地清除衰老细胞,还可减少滑膜炎症,可有效地治疗小鼠创伤型骨性关节炎,使小鼠恢复运动功能障碍。
另一方面,本发明提供一种包含嵌合抗原受体的修饰细胞的制备方法,采用慢病毒作为载体转染巨噬细胞后表达本发明所提供的嵌合抗原受体,并且采用离心感染的操作方式。在一些实施例中,离心感染的参数是:800g离心20min。
另一方面,本发明提供一种调节巨噬细胞极化的方法,巨噬细胞被慢病毒载体转染表达嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包含CD28胞内段的共刺激结构域使巨噬细胞产生抑炎性的M2型极化。
进一步的,包含CD28胞内段的共刺激结构域位于所述嵌合抗原受体的胞内结构域,所述嵌合抗原受体的胞外结构域还包括靶向抗原结合结构域。所述CD28胞内段具有如SEQ ID:14所示的氨基酸序列,或与SEQ ID:14所示的氨基酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列,所述CD28胞内段具有如SEQ ID:15所示的核酸序列,或与SEQID:15所示的核酸序列60%、70%、80%、85%、90%、或95%以上同源的序列。
在一些方式中,所述的胞外结构域包括特异结合细胞表面蛋白的抗原结合结构域以及间隔区。
进一步的,所述抗原结合结构域可以定向结合目的蛋白抗原密度达到响应阈值的靶细胞,而不结合其他细胞。所述的抗原结合结构域,是可以根据目的蛋白而设计出的抗体片段。这里所述的目的蛋白包括任何细胞表面的蛋白,所述的靶细胞可以是癌细胞,衰老细胞,或者其它任何细胞。
在一些方式中,所述的目的蛋白为衰老细胞表面的任何蛋白,例如本发明的FAP蛋白,还包括已经发现的衰老细胞表面的特异蛋白如尿激酶纤溶酶原激活物受体(urokinaseplasminogen activator receptor,uPAR)和糖蛋白Nmb(Glycoprotein Nmb,GPNMB)。当然也可以被用于那些没有发现衰老细胞表面的其它蛋白,一旦被新发现,都可以用本发明的嵌合抗原受体结构所利用。
在一些可选方式中,所述目的蛋白包括但不限于以下抗原组成中的任一种:PLAUR、GPNMB、间皮质素、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD21、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、GD2、CCL19、CCL21、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HER2、CAIX、CD171、LMP1、EGFR、Muc1、GPC3、EphA2、EpCAM、MG7、CSR、ART-4。
另一方面,本发明提供以慢病毒作为载体转染巨噬细胞表达包含CD28胞内段共刺激结构域的嵌合抗原受体在调节巨噬细胞为M2型极化中的用途。
综上所述,本发明的有益效果如下:
(1)本发明发现FAP与衰老细胞之间的关系,从而提供了FAP蛋白在制备抑制或者消除衰老细胞试剂上的用途,为抗衰老药物设计、美容成分研发等需要清除衰老细胞的场景提供了新的思路,同时也提供了FAP作为衰老细胞标志物的新用途。
(2)本发明所提供的特异性靶向FAP的嵌合抗原受体,以及表达这种嵌合抗原受体的巨噬细胞,可以选择性地靶向衰老细胞,同时不影响正常增殖细胞,可有效地清除表达衰老细胞,可有效地应用于治疗骨性关节炎中清除衰老的软骨细胞,同时可以减少滑膜炎症,同时此类细胞还可应用于预防衰老。
(3)本发明所提供的靶向FAP特异性嵌合抗原受体的免疫工程细胞,所采用的巨噬细胞具有以下优点:1.独特的组织浸润能力,可以穿透实体瘤、致密的实体组织比如骨关节软骨或滑膜;2.巨噬细胞不会诱发移植物抗宿主病,相较于嵌合抗原受体T细胞具有更高的免疫安全性。因此,采用巨噬细胞作为免疫工程细胞更有利于清除实体致密组织或实体瘤中的衰老细胞。
(4)本发明所提供的靶向FAP特异性嵌合抗原受体的巨噬细胞的嵌合抗原受体分子信号域经过优选后,共刺激结构域为FcεRI共同γ亚基或CD28胞内段,可提高巨噬细胞的吞噬效应。
(5)本发明所提供的靶向FAP特异性嵌合抗原受体的巨噬细胞的极化类型为抑炎性的M2型极化,避免了传统的巨噬细胞活化后产生的M1型极化,从而有利于在清除衰老细胞中避免炎症反应。
(6)本发明首次提出稳定的嵌合抗原受体的巨噬细胞M2型极化方式为,采用慢病毒为载体转染巨噬细胞,所表达的嵌合抗原受体中的共刺激结构域为CD28胞内段,采用此方法可稳定地获得M2型巨噬细胞,而无需专门构建抑制促M1型极化的通路(比如TNF-α/NF-KappaB通路、TLR/MyD88通路)的序列。经过别的从而可以利用于各种并不仅限于清除衰老细胞的、需要抑炎效果的疾病治疗中,优点是不会诱发移植物抗宿主病,不会产生炎症因子风暴。
(7)本发明所提供的嵌合抗原受体序列的优选方式,针对胞外结构域的间隔区、跨膜结构域、胞内结构域的共刺激结构域的调整使FAP特异性嵌合抗原受体巨噬细胞对衰老细胞细胞上FAP抗原密度的响应阈值达到衰老软骨细胞和衰老成纤维细胞的FAP表达水平,从而使之更为安全有效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1:所提出的嵌合抗原受体巨噬细胞治疗方法的说明。
图2:显示了嵌合抗原受体(CAR)的概念图,该图从左至右为胞外结构域(图中细胞外片段)、跨膜结构域(图中跨膜片段)、胞内结构域(图中细胞内片段)。胞外结构域包含具有靶向功能的抗原结合结构域(图中靶向片段),在一些方式中还包含将抗原结合结构域和跨膜结构域相连接的间隔区(图中铰链区),胞内结构域包含共刺激结构域和胞内活化区域(图中胞内激活信号)。
图3:对应实施例一。通过单细胞数据鉴定新的衰老标记物。其中,图3A显示OA病人的软骨细胞的UMAP降维结果,其中衰老细胞特征基因和基质降解基因表达具有较大异质性。图3B显示相较于经典的衰老细胞标记物CDKN1A和PLAUR,FAP特异性地表达在促进基质降解的衰老细胞亚群中(identity=1)。
图4:对应实施例一。FAP在衰老细胞中表达上调。小鼠原代成纤维细胞(图4C-D)和软骨细胞(4A-B)经DOX处理诱导细胞衰老后,FAP表达显著升高。
图5:对应实施例一。FAP表达在衰老细胞的表面。通过流式细胞仪鉴定显示,FAP在小鼠和人类衰老软骨细胞的细胞表面高度表达(图5A-B)。
图6:对应实施例一。FAP作为OA免疫治疗衰老细胞表面标志物的可行性。小鼠关节组织(关节软骨和滑膜组织)中FAP阳性和SA-β-gal阳性细胞的数量在半月板失稳(DMM)诱导的创伤后骨关节炎(图6.1B-C)和年龄相关骨性关节炎模型(图6.1A)中均显著增加,但在假手术关节中几乎没有检测到。最后,与小鼠的结果相似,临床OA患者的关节软骨(图6.2D)和滑膜组织(图6.2E)中FAP也上调,而正常人类关节的FAP表达量则较低。此外,在小鼠的心脏和肝脏组织中,FAP的蛋白表达水平在衰老组织中均显著增加(图6.3F)。总之,这些结果证明FAP可能是OA免疫治疗中senolytic-CAR策略的理想候选靶点。
图7:对应实施例十。CAR在原代巨噬细胞中表达效率的检测。其中,使用的CAR为包括与小鼠细胞内4-1BB共刺激和CD3ζ信号域连接的抗小鼠FAP(m.FAP)单链可变片段(scFV)(图7A)。图7B显示spinfection可以显著提升CAR分子的表达效率。
图8:对应实施例六。具有不同胞内结构的CAR分子介导的吞噬效率。图8.1A是一系列显示CAR构建体具体实例的结构示意图,图8.2B显示含有CD28胞内段或FcεRI共同γ亚基的CAR-M对FAP阳性靶细胞具有更高的吞噬率,图8.3C显示四种CAR-M对于不同细胞FAP的吞噬效率。
图9:对应实施例四与实施例五。FAP特异的CAR-M的制备和CAR介导的衰老活性评估,其中,FAP特异的CAR包括与小鼠细胞内CD28共刺激和CD3ζ信号域连接的抗小鼠FAP(m.FAP)单链可变片段(scFV)(图9A)。为了评估抗FAP CAR-Macs对目标抗原的特异性吞噬潜力,将CAR引入小鼠吞噬巨噬细胞系J774A.1并以过表达FAP的HEK293T细胞为靶细胞。流式细胞仪结果显示FAP CAR-M对FAP阳性靶细胞具有较高的吞噬率,而空载(含有GFP但没有信号域)转染的巨噬细胞则没有这种选择性吞噬(图9B)。为提高巨噬细胞的转染效率,使用慢病毒离心转染法将FAP CAR引入小鼠原代骨髓巨噬细胞,经离心转染法转染的小鼠巨噬细胞有效表达CAR(图9C)。为评估FAP CAR-M的靶向衰老细胞吞噬能力,通过将CAR-M、空载转染的巨噬细胞的VT-Macs分别与DOX处理的小鼠原代软骨细胞共培养,高内涵细胞分析仪显示CAR-M而不是VT-Macs可以选择性地消除衰老的软骨细胞(图9D-E)。此外,CAR-M而不是空载转染的巨噬细胞对衰老软骨细胞表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性(图9F-G)。总之,这些数据表明FAP CAR-M可以有效地靶向衰老软骨细胞并介导senolytic活性。图10:对应实施例七。评估FAP特异性CAR-M的极化表型,其中,FAP特异性CAR-M显示出细长的形状,带有丝状细胞骨架染色,与M2(抗炎)表型非常相似(图10.1A)。为了进一步表征FAP CAR-M的表型,进行了bulk-RNA测序。CAR转染的、空载体转染的、经典激活的M1或替代激活的M2和未处理的BMDM的转录组通过无偏主成分分析(PCA)进行处理,CAR-M聚集到替代激活的M2和远离经典激活的M1(图10.1B).无偏层次聚类热图还显示CAR-M与M2相似,但与M1明显不同(图10.1C)。比较CAR转染和激活的Mac之间的炎症相关差异,与M1极化的Mac相比,CAR-M没有显示出显着的促炎通路富集(图10.2D)。此外,CAR-M还积极介导吞噬作用和抗原呈递相关通路和关键成分(图10.3E、F)。所有这些结果表明,FAP CAR转染的Mac表现出抗炎样M2表型。
图11:对应实施例九。FAP特异性CAR-M对成年小鼠创伤后OA的治疗作用,其中,在p16-3MR转基因小鼠中进行了内侧半月板(DMM)手术的去稳定化,这允许对衰老细胞数量进行活体监测。在DMM手术后2周和6周进行两次关节内(IA)注射CAR-M(图11.1A)。CAR-M处理显着降低了DMM小鼠关节区域的发光信号,表明有效去除了关节中的衰老细胞数量(图11.1B)。组织学评估显示,与载体转染的Mac或载体相比,CAR-M减少了OA小鼠的软骨退化和滑膜炎症(图11.2C-E)。对FAP、p16INK4a和高迁移率族盒1(HMGB1)进行免疫染色以鉴定SnC。在软骨中,DMM后FAP和p16INK4a阳性细胞的比例显着高于假手术,而HMGB1在假手术中显示核积累,DMM后核丢失。值得注意的是,CAR-M不仅显着减少了DMM小鼠中p16INK4a阳性细胞的数量并恢复了HMGB1的核染色,而且还减少了胶原X阳性肥大软骨细胞的数量并增加了软骨基质中胶原蛋白II的含量(图11.3F,G)。与软骨中CAR-M的衰老细胞清除一致,此外,通过Rotarod测试评估的运动功能显示CAR-M恢复了与DMM手术相关的运动功能障碍(图11.4H)。总的来说,这些结果表明,FAP特异性CAR-M可以用作创伤后OA的治疗手段。
图12:对应实施例八。FAP特异性CAR-M在人类关节外植体中的清除衰老细胞的作用。其中,为了评估FAP特异性CAR-M在OA中的临床潜力,我们收集了接受全膝关节置换术的OA患者的组织外植体,并将它们与针对FAP特异的CAR-M共同培养。鉴于OA关节外植体中衰老细胞数量存在明显的个体差异,我们构建了DOX诱导的衰老外植体模型以避免偏差(图12.1A)。FAP和p21阳性细胞百分比的增加证实了人软骨外植体的DOX诱导的衰老表型。CAR-M共培养消除了衰老软骨外植体中FAP阳性的衰老细胞,降低了软骨分解代谢酶的表达并促进了细胞外基质的合成(图12.1B、C)。此外,免疫荧光染色证明CAR-M渗入软骨外植体并聚集在衰老细胞周围,而载体转染的Macs仅保留在外植体表面(图12.2D)。尽管单个外植体检查可以更好地控制实验变量,但它们仍然不能反映OA病理学中滑膜和软骨之间的关键串扰。因此,我们设计了一种软骨-滑膜共培养模型来测试CAR-M是否可以通过消除滑膜中的衰老细胞来促进软骨外植体再生:首先将骨关节炎滑膜外植体与载体转染的Macs或CAR-M共培养72小时,然后然后与未受损的软骨共培养10天(图12.1A)。正如预期的那样,CAR-M还可以有效地消除受OA影响的滑膜中的衰老细胞(图12.2E、F)。有趣的是,在与CAR-M共培养的滑膜条件培养基(CM)中培养的软骨外植体显示出比仅来自骨关节炎滑膜的CM显着更少的MMP13阳性细胞和更多的蛋白多糖合成(图12.3G,H)。总之,这些结果证明了CAR-M在人类关节外植体中的抗衰老活性,并阐明了清除衰老细胞在人体OA模型上的治疗作用。
图13:第三代慢病毒载体质粒clonetech pLVX-IRES-ZsGreen1 Vector结构。
详细说明
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR):
是指包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、和能够激活或加强免疫应答的细胞内信号传导结构域融合的分子。在某些实施方案中,CAR的细胞外抗原结合结构域包含scFv。
scFv:
scFv可源自融合抗体的可变重区和轻区。scFv可源自Fab(而不是源自抗体,例如,从Fab文库获得)。在某些实施方案中,scFv融合到跨膜结构域,然后融合到细胞内信号结构域。
CDR:
被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列,其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。
“基本相同”或“基本同源”是指多肽或核酸分子表现出与参考氨基酸序列(例如,本文所述的任何氨基酸序列)或参考核酸至少约50%同源或相同酸序列(例如,本文所述的任何核酸序列)。在某些实施例中,这样的顺序是至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%。与用于比较的氨基酸或核酸的序列至少约90%、至少约95%、至少约99%或至少约100%同源或相同。
巨噬细胞(Macrophage):
指一种由单核细胞(Monocyte)穿出血管后发育而来的髓样免疫细胞,广泛分布于机体组织的各个脏器中。其在正常组织中的主要生理作用是:通过加工和呈递抗原的方式介导特异性免疫反应;以固定细胞或游离细胞的形式吞噬并降解坏死细胞、碎片和异物,继而参与机体内非特异性反应;通过分泌炎症因子激活淋巴球或其他免疫细胞,进而协调炎症过程。
衰老细胞与衰老:
本发明说的衰老一般是哺乳动物或者人类自然生长规律下导致的衰老或者某些疾病导致的衰老。这种表现出来的衰老症状的一个方面是由于体内衰老细胞的积累。由于疾病导致的衰老细胞的积累可能是患有癌症,某些炎症性疾病,或者疼痛,或者这些疾病发生,发展的过程中的某些生理作用的过程中,例如某些蛋白,某些基因的激活而导致衰老细胞得出现,积累,从而从症状上表现衰老。这种疾病可以包括肺纤维化、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、糖尿病、肝纤维化、慢性肾病、衰老或骨关节炎,并改善接受衰老诱导疗法(例如化疗药物)的受试者的肿瘤反应而导致的衰老细胞的增多或者积累。这样积累可以是在患病的组织或者器官上积累,也可以是全身性组织或者器官的积累。在不同的组织上,器官上积累的衰老细胞导致组织,器官的衰老,功能的退化或者正常生理功能的减弱,这些都是衰老细胞导致的。
衰老细胞的表面蛋白:
一般,衰老细胞与正常健康非衰老细胞相比,总会出现一些特异的蛋白的数量增加或者新的蛋白的出现,这些蛋白有些存在于细胞的表面,有些存在于细胞的内部。为了抑制或者消除衰老细胞是治疗衰老的一种手段,而用于抑制衰老细胞表面蛋白的表达,或者通过与衰老细胞表面蛋白的结合抗体或者多肽片段是一个有效的手段。本发明发现成纤维细胞活化蛋白α(FAP,Fibroblast Activation Protein Alpha,Ensembl:ENSG00000078098,UniProtKB/Swiss-Prot:Q12884)表面蛋白在范围广泛的体外和体内哺乳动物衰老模型中通常被上调。
载体:
天然或合成核酸的表达通常通过将核酸或其部分可操作地连接至启动子并将构建体掺入表达载体中来实现。该载体通常能够在哺乳动物细胞中复制,和/或也能够整合到哺乳动物的细胞基因组中。典型的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。
免疫细胞:
这里所述的免疫细胞实质带有嵌合抗原受体结构。这些结构在细胞具有细胞外区域以及跨膜区域以及细胞内区域。这里的免疫细胞包括从受试者获得吞噬细胞来源,例如单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。受试者的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地,对象是人。细胞可以从许多来源获得,包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带和肿瘤。
治疗:
本发明所谓的治疗是通过向患病的个体施加试剂,或者需要改善某些健康状况的个体施加药物试剂,达到消除、抑制或者延缓疾病的发生发展。一个方面,本发明可以提供任何试剂,例如结合衰老细胞表面蛋白FAP的试剂,例如抗体,抗体片段,多肽片段,核酸、化学药物等,能够结合FAP蛋白。
在另一个发明,可以利用本发明的改良的工程细胞来治疗或改善有此需要的受试者的衰老相关病理学的影响的方法,包括向受试者施用有效量的本文所述的任何工程化免疫细胞,其中受试者表现出与在健康对照受试者中观察到的相比,衰老细胞的积累增加。
在一些实施方案中,衰老相关病理是肺纤维化、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、糖尿病、肝纤维化、慢性肾病、衰老或骨关节炎。此外或备选地,在某些实施方案中,衰老细胞表现出衰老相关分泌表型(SASP)。衰老相关分泌表型可能由致癌基因(例如,HRASG12D、NRASG12D、NRASG12D;D38A等)或药物(例如,Cdk4/6抑制剂(例如,palbociclib)、MEK抑制剂(例如,曲美替尼)、多柔比星)诱导的。当然,也可以让降低衰老细胞的个体施加一些本发明的工程细胞,例如皮肤上的衰老细胞改善皮肤,美容方面,也可以用于心脏,肝脏上的衰老细胞的减少或者消除或者杀死带有FAP蛋白的衰老细胞。
具体实施案例
实施例一:证明FAP与衰老细胞之间的相关性
FAP表达在衰老细胞中:
通过单细胞数据鉴定新的衰老标记物。我们重新分析了来自10名OA患者关节软骨的单细胞RNA测序数据集(GSE104782)的数据。结果如图3所示。图3A显示OA病人的软骨细胞的UMAP降维结果,其中衰老细胞特征基因和基质降解基因表达具有较大异质性。图3B显示相较于经典的衰老细胞标记物CDKN1A和PLAUR,FAP特异性地表达在促进基质降解的衰老细胞亚群中(identity=1)。
FAP在衰老细胞中表达上调:
将小鼠原代细胞用500ng/ml多柔比星(DOX)处理24h并用新鲜完全培养基继续培养7d(培养基每2天更换一次)以获得衰老细胞。使用RT-qPCR和免疫荧光染色检测衰老细胞成纤维细胞活化蛋白(FAP)的表达(免疫荧光染色的方式参考实施例九)。结果如图4所示。小鼠原代成纤维细胞(图4C-D)和软骨细胞(4A-B)经DOX处理诱导细胞衰老后,FAP表达显著升高。
FAP表达在衰老细胞的表面:
采用小鼠和人得软骨细胞进行实验,衰老细胞获得方法同上,随后进行流式细胞术检测FAP表达水平。使用0.2% EDTA-PBS缓冲液消化贴壁细胞细胞30分钟,以防止损伤细胞表面标志物蛋白,移液器轻轻吹打培养瓶底壁获得细胞悬液。细胞悬液200g,5min离心,用红色荧光直接标记的抗FAP抗体(Abcam,ab207178)或同型对照IgG抗体按1:200稀释后重悬细胞,室温孵育15-30min。孵育完成后的细胞悬液离心去上清,PBS洗涤2-3次,最后用200μl PBS重悬细胞调整细胞密度至1×106/ml并用锡纸避光,将细胞悬液转移至流式管中,并在流式细胞仪上进行检测,数据分析使用FlowJo软件。通过流式细胞仪分析结果显示,FAP在小鼠和人类衰老软骨细胞的细胞表面高度表达。结果如图5所示,可知FAP在小鼠和人类衰老软骨细胞的细胞表面高度表达(图5A-B)。
FAP可作为OA和多器官衰老的免疫治疗衰老细胞表面标志物:
为了验证FAP在衰老和疾病组织中的表达,获取了年轻(2月龄)和年老的(20月龄)小鼠的关节、心脏和肝脏组织,半月板失稳(DMM)诱导的小鼠关节炎的关节,以及临床骨关节炎病人的软骨和滑膜组织进行组织切片,以及FAP免疫组化染色,和衰老标记物如SA-β-gal,p53的染色检测,结果如图6所示。
图6结果显示:小鼠关节组织(关节软骨和滑膜组织)中FAP阳性和SA-β-gal(衰老相关-β-半乳糖苷酶,一种衰老标志物)阳性细胞的数量在半月板失稳(DMM)诱导的创伤后骨关节炎(图6.1B-C)和年龄相关骨性关节炎模型(图6.1A)中均显著增加,但在假手术关节中几乎没有检测到。最后,与小鼠的结果相似,临床OA患者的关节软骨(图6.1D)和滑膜组织(图6.1E)中FAP也上调,而正常人类关节的FAP表达量则较低。此外,在小鼠的心脏和肝脏组织中,FAP的蛋白表达水平在衰老组织中均显著增加(图6.2F)。总之,这些结果证明FAP可能是OA和多器官衰老的免疫治疗中senolytic-CAR策略的理想候选靶点。
实施例二:构建靶向FAP的嵌合抗原受体
将包含FAP特异单链抗体片段FAP-scFv(具体核酸序列如SEQ ID:12)、CD8跨膜区(具体序列如SEQ ID:21)、CD3ζ(具体序列如SEQ ID:17)以及CD28胞内段(具体序列如SEQID:15)的全部序列,通过BsmBI和EcoRI酶切慢病毒载体质粒clonetech pLVX-IRES-ZsGreen1 Vector(质粒结构如附图13),将纯化后的载体片段与CAR分子DNA片段通过T4连接酶将CAR分子引入CMV启动子下游构建重组质粒。
重组慢病毒载体质粒包括的CMV启动子序列(具体序列如SEQ ID:)、FAP单链抗体(scFv)、CD8跨膜区、CD28共刺激分子区域、CD3活化区域序列。
第三代慢病毒质粒(质粒结构如附图13)包括氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、PGK启动子、慢病毒5'LTR、慢病毒3'LTR、RRE顺式元件、cPPT顺式元件、eWPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件。
实施例三:制备慢病毒
本实施例所制备的慢病毒载体为采用如实施例二中的质粒制备的慢病毒载体。
准备目的质粒与包装质粒:用质粒小提试剂盒(OMEGA)提取所需目的质粒(mFAP-CAR,GFP标签;hFAP-CAR,GFP标签;mCherry;luciferase,新霉素抗性)以及二代包装质粒psPAX2和pMD2.G,并用Nano Drop仪器(Thermo)检测相应质粒的浓度。
准备HEK293T细胞(cat No.CL-0005,Procell Life Science&Technology Co.,Ltd,武汉,中国)用于病毒包装:复苏HEK293T细胞,在含1%双抗(Gibco)+10% FBS(Gibco)+DMEM高糖培养基(Gibco)的完全培养基中传2-3代后,在包被病毒的前24h,将HEK293T细胞用胰酶消化并计数,将约2.0×106细胞接种于10cm细胞培养皿中,补充DMEM高糖完全培养基至10ml。当细胞融合度达70-80%时,更换9mL新的无抗生素DMEM高糖完全培养基后即可准备病毒包被。
脂质体转染:将50μl Lipofectamin 2000(Invitrigen)加入500μl Opti-MEM培养基(Gibco)于1.5mL EP管A中,轻轻震荡混匀,注意不要产生气泡,室温静置5min;接着将8μg目的质粒(实施例1的方式制备的质粒)、6μg psPAX2质粒、6μg pMD2.G质粒和500μl Opti-MEM培养基加入在另一1.5mL EP管B中,轻轻震荡混匀,注意不要产生气泡,室温静置5min;将上述A、B两种混合溶液进行混合,轻轻震荡混匀,注意不要产生气泡,室温静置15min后将混合后的液体用移液器滴入之前备用的HEK293T细胞培养液中,轻轻晃动培养皿混匀,注意不要把HEK293T细胞晃动脱离培养皿底;最后把培养皿放入37℃,5%二氧化碳培养箱中,12h后更换新鲜DMEM高糖完全培养基;此后每隔24h更换并收集含病毒的培养基。
病毒收获(生物安全柜内操作):培养48h后,将全部HEK293T细胞的培养液上清转移至50mL离心管内,配平并置于离心机以4℃,3000g离心10min,用注射器吸出上清并用0.45μm滤器过滤后得到FAP-CAR慢病毒,-80℃冰箱保存备用。
实施例四:制备嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)
本实施例采用小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)制备嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)的方法,构建时采用如实施例三所制备的慢病毒载体,表达的嵌合抗原受体结构示意图如图2所示,在细胞表面表达的嵌合抗原载体如图9A。具体如下:
BMDM细胞获取:
C57BL/6N小鼠颈椎脱臼法处死,用75%酒精对其充分消毒并有效固定小鼠,分离并取下小鼠的股骨和胫骨,注意不要损伤骨头,随后将其放入事先含有75%酒精的10cm细胞培养皿中,转移至生物安全柜中并进一步分离去除软组织。将分离的骨头移入含有1×PBS的10cm细胞培养皿中清洗,转移至另一装有DMEM低糖完全培养基的10cm细胞培养皿中等待下一步处理。
用眼科剪去除股骨和胫骨的两侧骨端,然后用1mL注射器抽取1ml低糖完全培养基从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到15mL无菌离心管中,重复2-3次至骨髓腔发白。把收集到的细胞悬液以4℃,200g离心5min,弃上清液。加入1ml红细胞裂解液并重悬,冰上静置5min,随后加入5ml 1×PBS终止裂解,以4℃,200g离心5min,弃上清液。
加入5mL DMEM低糖完全培养基重悬并用70μm细胞筛过滤细胞,以4℃,200g离心5min,弃上清液,获得小鼠骨髓细胞。
细胞转染:
1、将生长状态良好的BMDM培养液吸去,用Accutase消化细胞,将消化后的BMDM按1.0×106个细胞/孔接种于6孔板(Corning)中。
2、待细胞贴壁24h后用无抗生素DMEM低糖完全培养基清洗一次。
配制转染工作液:采用如实施例三制备的慢病毒,加入Polybrene至终浓度为8ug/ml。将转染工作液按2ml/孔加入6孔板中,其中Blank组加入等量的含8ug/ml Polybrene的无抗生素DMEM完全培养基。
3、将6孔板用封口膜密封,以37℃,800g离心20min。
4、离心完成后,吸去病毒培养基,加入2ml DMEM低糖完全培养基,放于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养过夜。
5、如有必要重复步骤2-4
CAR表达的检测鉴定:
待转染细胞长满后,用Accutase消化细胞,将消化后的CAR-M通过流式细胞仪检测CAR表达。结果如图9C所示:FAP特异性的CAR成功表达在BMDM细胞表面,证明使用慢病毒离心转染法将FAP CAR引入小鼠原代骨髓巨噬细胞,离心转染法转染小鼠巨噬细胞后可有效表达CAR。
实施例五:CAR巨噬细胞(带有FAP抗原结合结构域)杀伤衰老细胞的功能检测
1、基于流式细胞术吞噬功能测定
构建载体、转染细胞的方式参考实施例二、三、四。将1×106GFP阳性空载体(实施例二采用的空载体)转染的巨噬细胞(转染方式参考实施例三)、CAR-M(实施例四制备的CAR-M)和单独培养基(Macs alone)、5×105mCherry阳性的HEK293T细胞、过表达FAP的HEK293T细胞在37℃、5%二氧化碳培养箱中共培养24h。Accutase消化细胞,4%多聚甲醛固定细胞15min,流式细胞仪检测GFP阳性细胞中mCherry阳性细胞百分比即吞噬百分比。结果如图9B所示。流式细胞仪的分析结果显示FAP CAR-M对FAP阳性靶细胞具有较高的吞噬率,而空载(含有GFP但没有信号域)转染的巨噬细胞则没有这种选择性吞噬(图9B)。
2、基于荧光显微镜吞噬功能测定
将mCherry阳性小鼠原代软骨细胞用500ng/ml多柔比星处理24h并继续培养7d以制备mCherry阳性衰老软骨细胞。将2×104mCherry阳性衰老软骨细胞接种于放置有圆形细胞爬片的24孔板中。待细胞贴壁后,将1×105GFP阳性空载体(实施例二采用的空载体)转染的巨噬细胞(转染方式参考实施例三)、CAR-M(实施例四制备的CAR-M)和衰老软骨细胞在37℃、5%二氧化碳培养箱中共培养48h。取出细胞爬片,1×PBS洗去未贴壁细胞,4%多聚甲醛固定细胞15min,DAPI染色30min,防荧光淬灭封片剂封片。使用共聚焦显微镜(OLYMPUS),×10倍镜,使用mCherry和GFP通道对爬片进行成像,在每个爬片中3个随机视野中计算平均吞噬事件数,每个实验重复3次。结果如图9E所示。
3、基于高内涵吞噬功能测定
将2×104mCherry阳性衰老软骨细胞接种于放置有圆形细胞爬片的24孔板中。待细胞贴壁后,将1×105GFP阳性空载体(实施例二采用的空载体)转染的巨噬细胞(转染方式参考实施例三)、CAR-M(实施例四制备的CAR-M)和衰老软骨细胞在37℃、5%二氧化碳培养箱中共培养48h。取出细胞爬片,1×PBS洗去未贴壁细胞,4%多聚甲醛固定细胞15min,DAPI染色30min,防荧光淬灭封片剂封片。使用高内涵细胞分析仪(PerkinElmer)测定每个爬片中3个随机视野中mCherry阳性细胞数,每个实验重复3次。结果如图9D所示。
图9D和图9E的同时显示出,CAR-M而不是VT-Macs可以选择性地消除衰老的软骨细胞。证明CAR-M而不是空载转染的巨噬细胞可吞噬阳性衰老软骨细胞。
4、基于共聚焦显微镜活细胞成像吞噬功能测定
将1×105mCherry阳性衰老软骨细胞接种于3.5cm CELLviewTM玻底皿(Greinerbio-one)。待细胞贴壁后,将5×105GFP阳性空载体(实施例二采用的空载体)转染的巨噬细胞(转染方式参考实施例三)、CAR-M(实施例四制备的CAR-M)和衰老软骨细胞在37℃、5%二氧化碳培养箱中共培养48h。使用共聚焦显微镜(OLYMPUS),×10倍镜,每2-5min,使用mCherry和GFP通道对细胞成像一次,连续拍摄24h。
5、体外细胞毒性实验
在基于萤光素酶的杀伤测定中使用GFP阳性空载体(实施例二采用的空载体)转染的巨噬细胞(转染方式参考实施例三)、CAR-M(实施例四制备的CAR-M)作为效应细胞,表达luciferase的衰老软骨细胞作为靶细胞。将2×104靶细胞接种到不透光48孔板中,每组3个复孔。待靶细胞贴壁后,依次按照效应细胞(E):靶细胞(T)=10:1-1:10接种效应细胞,在37℃、5%二氧化碳培养箱中共培养48h。1×PBS洗涤细胞3次,荧光素酶裂解液(Promega)裂解细胞,以4℃,10000g离心5min,取20μl上清至不透光的96孔板中,每孔加入100μl 150μg/mlXenolight D-luciferin,potassium salt(PerkinElmer,122799),37℃避光孵育10min,使用酶标仪(Thermo)检测荧光强度,并通过以下公式计算细胞溶解率:
细胞溶解率(Specific lysis%)=【1-(共培养细胞荧光信号–背景荧光信号)/(单独培养衰老软骨细胞荧光信号–背景荧光信号)】×100
结果如图9F-G所示,CAR-M而不是空载转染的巨噬细胞对衰老软骨细胞表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性。与对照组相比,制备的CAR-M细胞均能够显著杀伤衰老软骨细胞。
本实施例的结果数据表明FAP CAR-M可以有效地靶向衰老软骨细胞并介导清除衰老细胞活性。
实施例六:测试不同胞内结构的CAR分子介导的巨噬细胞吞噬效率
为评估不同共刺激结构域的CAR-M的靶向衰老细胞吞噬能力,构建不同共刺激结构域的CAR,将各组的CAR-M与DOX处理的人原代软骨细胞和成纤维细胞(处理方式如实施例五)共培养,CAR-M发挥吞噬效应。
一共构建4种CAR,构建方式参考实施例二,构建示意图如图8.1A,包括CAR-1、CAR-2、CAR-3和CAR-4,它们分别在胞内结构域的共刺激结构域含有4-1BB、CD28胞内段、Dectin-1,FcεRI共同γ亚基,彼此之间一致的是含有FAP抗原特异性scFv、CD8铰链、CD8跨膜和CD3ζ胞内区域。
这四种CAR的慢病毒载体构建方式参考实施例三,转染巨噬细胞的方式与实施例四一致。
采用流式细胞术检测细胞表面FAP蛋白水平,结果如图8.2B所示,人衰老软骨细胞相对于非衰老细胞,FAP蛋白呈现较低水平的上调(约20倍),而人衰老成纤维细胞的FAP蛋白呈现较高的表达水平(约80倍)。
将各组的CAR-M与DOX处理的人原代软骨细胞和成纤维细胞(处理方式如实施例五)共培养后,采用流式细胞术检测各组CAR-M的吞噬效率,结果如图8.3C所示。流式细胞仪分析结果显示:四种CAR-M对于FAP表达水平较高的人衰老成纤维细胞具有较好的吞噬活性,而对于FAP表达水平较低的人衰老软骨细胞,含有CD28胞内共刺激片段的CAR-M对FAP阳性靶细胞具有更高的吞噬率(图8.3C)。说明含有CD28胞内共刺激片段的CAR-M对于靶细胞表面的FAP的响应阈值更低。
实施例七:评估FAP特异性CAR-M的极化表型
为评估FAP特异性CAR-M的极化表型,采用如实施例四所获得的CAR-M进行实验,采用荧光显微镜观察F-actin染色(Cytoskeleton,Inc.#PHDG1-A)观察细胞形态。除CAR-M细胞(如实施例四)外,小鼠来源的巨噬细胞BMDM M0、M1极化(BMDM在20ng/ml IFN-γ和100ng/ml LPS中孵育48小时)、M2极化(BMDM在20ng/ml IL-4和20ng/ml IL-13孵育48小时)的巨噬细胞同时进行观察做为对照,可得知FAP特异性CAR-M显示出细长的形状,带有丝状细胞骨架染色,与M2(抗炎)表型非常相似(图10.1A)。为了进一步表征FAP CAR-M的表型,进行了bulk-RNA测序。一共有如下组别:CAR组为CAR转染的巨噬细胞(同实施例四)、Empty组为空载体转染的(同实施例五)、M1组为同实施例四类似但提前经典激活的M1型极化表达CAR的巨噬细胞,M2组为替代激活的M2型极化表达CAR的巨噬细胞,UTD组为未处理的BMDM的转录组,以上所有组通过无偏主成分分析(PCA)进行处理,CAR-M聚集到替代激活的M2和远离经典激活的M1(图10.1B)。无偏层次聚类热图还显示CAR-M与M2相似,但与M1明显不同(图10.1C)。比较CAR转染和激活的Mac之间的炎症相关差异,与M1极化的Mac相比,CAR-M没有显示出显着的促炎通路富集(图10.2D)。此外,CAR-M还积极介导吞噬作用和抗原呈递相关通路和关键成分(图10.3E、F)。所有这些结果表明,FAP CAR转染的Mac表现出抗炎样M2表型。
实施例八:CAR巨噬细胞治疗人骨关节炎外植体实验
软骨外植体来自2例Kellgren-Lawrence(KL)0级因关节创伤行全膝关节置换术的患者,有膝关节手术史或其他关节疾病(化脓性关节炎或肿瘤)的患者被排除在外,本研究获得患者的知情同意和机构伦理委员会的批准。
鉴于OA关节外植体中衰老细胞数量存在明显的个体差异,我们构建了DOX诱导的衰老外植体模型以避免偏差(图12.1A)。用手术刀(#21刀片)切下全层软骨并修整样本至约5mm×5mm大小,将软骨块放置于低吸附24孔板(Corning)中,添加1ml含1%胎牛血清(FBS)、1%庆大霉素、1mM丙酮酸钠、50μg/mL L-脯氨酸、50μg/mL L-抗坏血酸2-磷酸和1X胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-G)的DMEM/F12完全培养基,在37℃、5%二氧化碳培养箱中预培养72h。随后用含500ng/ml多柔比星的DMEM/F12完全培养基处理外植体48h并继续培养7d以制备人衰老软骨外植体。
将2×105GFP阳性空载体转染的巨噬细胞(与实施例五中一致)、FAP CAR-M(与实施例四中构建的CAR-M一致)和人衰老软骨外植体在37℃、5%二氧化碳培养箱中共培养72h。将外植体浸泡于1×PBS中清洗3次,足量4%多聚甲醛避光固定48h。样本梯度脱水、浸蜡、包埋制成石蜡块。对包埋后的石蜡块进行切片,切片厚度为5μm。将切片脱蜡后进行免疫荧光染色。
为了反映OA病理学中滑膜和软骨之间的关键串扰,我们设计了一种软骨-滑膜共培养模型来测试CAR-Macs是否可以通过消除滑膜中的衰老细胞来促进软骨外植体再生:首先将骨关节炎滑膜外植体与载体转导的Macs或CAR-Macs共培养72小时,然后然后与未受损的软骨共培养10天(图12.1A)
免疫荧光染色:将脱蜡后的切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;免疫组画笔圈出样本区域;在样本上滴加0.1%的TritonX-100,静置15min;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;在样本上滴加5%的BSA,室温静置1h;吸干封闭液,在样本上滴加3% BSA稀释的一抗:FAP(Abcam,ab207187)确保样本完全覆盖,4℃孵育过夜;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;吸干PBS,在样本上滴加3% BSA稀释的相应荧光二抗,确保样本完全覆盖,避光室温孵育1h;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;DAPI染色30min;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;防荧光淬灭封片剂封片。使用共聚焦显微镜(OLYMPUS),×20倍镜,使用mCherry和GFP通道对切片进行成像。结果如图12所示。
DAB显色液避光显色(不超过8min),显微镜下观察适时终止显色;苏木精复染1min;流水冲洗1min;1%酒精盐酸分色;自来水蓝化5min。对完成染色的切片进行脱水、透明、封片,光学显微镜下拍照并定量阳性细胞。
结果如图12所示:
图12.1B和12.1C显示FAP和p21阳性细胞百分比的增加证实了人软骨外植体的DOX诱导的衰老表型。CAR-Macs共培养消除了衰老软骨外植体中FAP阳性的衰老细胞,降低了软骨分解代谢酶的表达并促进了细胞外基质的合成。
图12.2D显示免疫荧光染色证明CAR-Macs渗入软骨外植体并聚集在衰老细胞周围,而载体转导的Macs仅保留在外植体表面。
图12.2E、F显示CAR-Macs还可以有效地消除受OA影响的滑膜中的衰老细胞。且在与CAR-Mac共培养的滑膜条件培养基(CM)中培养的软骨外植体显示出比仅来自骨关节炎滑膜的CM显示出更少的MMP13阳性细胞和更多的蛋白多糖合成(图12.3G,H)。
总之,这些结果证明了CAR-Macs在人类关节外植体中的衰老活性,并阐明了清除衰老细胞在人体OA模型上的治疗作用。
实施例九:CAR巨噬细胞治疗小鼠骨关节炎的功能检测
本实施例中所采用的CAR-M与实施例四中所制备的一致。嵌合抗原受体免疫细胞治疗体内骨关节炎流程图如图1所示。
小鼠内侧半月板不稳(DMM)模型:
实验小鼠为6-8周龄的雄性p16-3MR小鼠(由Judith Campisi,Buck Institutefor Research on Aging,USA,提供),将小鼠随机分为ABCD四组,其中A组为假手术组(Sham),n=5;BCD组进行DMM造模,n=8。操作过程如下:
1、术前准备:腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉小鼠(剂量:10μl/g体重),小鼠选取仰卧位固定右后肢屈膝90°,用脱毛膏脱去膝关节附近毛发,暴露手术野,1%碘伏充分消毒皮肤。
2、用显微外科镊和剪刀在小鼠膝关节处纵向剪开皮肤,体视镜(Olympus,SZX7)下用手术刀沿髌韧带内侧切开肌肉和软组织,钝性分离髌韧带,暴露膝关节,内侧半月板通过内侧半月板胫副韧带(MMTL)与胫骨平台相连。
3、用显微外科剪刀、显微外科刀(#11刀片)于膝关节近外侧切断MMTL,使内侧半月板失稳,注意避免划伤关节软骨(Sham组不进行此步骤),无菌生理盐水冲洗创面。
4、分别用7-0外科缝合线(VICRYL)缝合关节腔,6-0外科缝合线(VICRYL)缝合肌肉和皮肤,1%碘伏消毒皮肤。
5、将小鼠置于加热毯上待其苏醒,术后2h内小鼠具有良好的活动能力。CAR-M关节腔注射:
DMM造模2周后进行关节腔注射,使用#33针(Hamilton)和25μl微量注射器(Hamilton)进行关节腔注射。AB组注射10μl载体溶液(1×PBS),CD组分别注射等量空载体转染的巨噬细胞(与实施例五中采用的一致)和CAR-M(实施例四所制备的CAR-M),频率为1月/次,共注射2剂次,给药方式如图11.1A。
1、细胞准备:消化空载体转染的巨噬细胞(与实施例五中采用的一致)和CAR-M(实施例四所制备的CAR-M)并计数,调整细胞密度为3.0×106细胞/ml备用。
2、术前准备:详见DMM模型。
3、关节腔注射:取膝关节正中纵向皮肤切口,长约5mm,牵拉皮肤找到髌韧带,用微量注射器以髌韧带内缘中点为进针点,斜向后上方约2mm深度进行关节腔注射(10μl,3.0×106细胞/ml),注射完成停留5s后拔针,缝合皮肤切口。
生物发光:
将p16-3MR小鼠麻醉,双侧膝关节腔注射10μl(150μg/ml)XenolightRediJectCoelenterazine h(PerkinElmer,760506)。10min后,用IVIS Spectrum小动物活体荧光影像分析系统(PerkinElmer)定量膝关节衰老细胞荧光(Field of View:D,Medium Binning,Exposure Time:5min)。结果如图11所示。CAR-M(实施例四所制备的CAR-M)治疗组衰老细胞荧光强度显著低于空载巨噬细胞模型组*p<0.05,**p<0.01,***p<0.005;A/B组n=6,C/D组n=8。
组织学:
将固定好的小鼠膝关节样本置于脱钙液(10%EDTA)中脱钙3周,期间每3d更换一次脱钙液。样本梯度脱水、浸蜡、包埋制成石蜡块。对包埋后的石蜡块进行切片,切片厚度为5μm。将切片脱蜡后进行番红O&固绿染色和免疫组化染色。
番红O&固绿染色:将脱蜡后的切片浸泡于0.02%固绿溶液中,静置5min;流水冲洗1min;将切片浸泡于0.1%番红O溶液中,静置3min;流水冲洗1min;固绿复染5min。对完成染色的切片进行脱水、透明、封片,光学显微镜下拍照并进行OARSI评分。结果如图11所示。CAR-M治疗组关节OARSI评分和滑膜厚度显著低于空载巨噬细胞模型组,*p<0.05,**p<0.01;A组n=5,B/C/D组n=8。
免疫组化染色:将脱蜡后的切片浸泡于柠檬酸抗原修复液中,65℃烘箱中修复过夜;抗原修复后,在室温静置至切片恢复室温,将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;免疫组画笔圈出样本区域;在样本上滴加0.1%的TritonX-100,静置15min;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;在样本上滴加3%甲醇过氧化氢,静置15min;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;在样本上滴加5%的BSA,室温静置1h;吸干封闭液,在样本上滴加3% BSA稀释的一抗:FAP(Abcam,ab207187),p16INK4a(Abcam,ab241543),HMGB1(Abcam,ab18256),COL10(Invitrogen,14-9771-82),COL2(Santa Cruz,sc-52658)确保样本完全覆盖,4℃孵育过夜;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;吸干PBS,在样本上滴加3%BSA稀释的相应二抗,确保样本完全覆盖,室温孵育1h;将切片浸泡于1×PBS中清洗3次,每次5min;DAB显色液避光显色(不超过8min),显微镜下观察适时终止显色;苏木精复染1min;流水冲洗1min;1%酒精盐酸分色;自来水蓝化5min。对完成染色的切片进行脱水、透明、封片,光学显微镜下拍照并定量阳性细胞。
结果如图11所示:
CAR-M处理显着降低了DMM小鼠关节区域的发光信号,表明有效去除了关节中的衰老细胞数量(图11.1B)。
组织学评估显示,与载体转导的Mac或载体相比,CAR-M减少了OA小鼠的软骨退化和滑膜炎症(图11.2C-E)。
对FAP、p16INK4a和高迁移率族盒1(HMGB1)进行免疫染色以鉴定SnC。在软骨中,DMM后FAP和p16INK4a阳性细胞的比例显着高于假手术,而HMGB1在假手术中显示核积累,DMM后核丢失。值得注意的是,CAR-M不仅显着减少了DMM小鼠中p16INK4a阳性细胞的数量并恢复了HMGB1的核染色,而且还减少了胶原X阳性肥大软骨细胞的数量并增加了软骨基质中胶原蛋白II的含量(图11.3F,G)。CAR-M治疗组FAP、p16INK4a阳性细胞百分比和COL10含量显著低于空载巨噬细胞模型组,CAR-M治疗组HMGB1阳性细胞百分比和COL2含量显著高于空载巨噬细胞模型组*p<0.05,**p<0.01;A组n=3,B/C/D组n=5,证明CAR-M可以用作创伤后OA的治疗手段,可以实现治疗衰老相关疾病。
与软骨中CAR-M的衰老细胞清除一致,此外,通过Rotarod测试评估的运动功能显示CAR-M恢复了与DMM手术相关的运动功能障碍(图11.4H)。
总的来说,这些结果表明,FAP特异性CAR-M可以用作创伤后OA的治疗手段。
实施例十:检测CAR在原代巨噬细胞中表达效率
本实施例中原代巨噬细胞表达的CAR结构示意图如图7A,胞外结构域为FAP特异性scFV(为抗小鼠FAP(m.FAP)单链可变片段(scFV))和CD8的α铰链,跨膜结构域为CD8,共刺激结构域为4-1BB,胞内活化区域为CD3ζ。采用类似实施例二的方式构建,采用如同实施例三的方式产生慢病毒载体FAP-CAR,采用如同实施例3的方式转染小鼠原代单核细胞获得CAR-M后用流式细胞仪检测CAR的表达率。
分离小鼠原代单核细胞,待细胞贴壁24h后用无抗生素DMEM低糖完全培养基清洗一次。
配制转染工作液:在收取的FAP-CAR慢病毒中加入Polybrene至终浓度为8ug/ml。
将转染工作液按2ml/孔加入6孔板中,按以下分组方式进行实验:
no virus组不添加转染工作液,加入的是等量的含8ug/ml Polybrene的无抗生素DMEM完全培养基。
spinfection组以37℃,800g离心20min,随后放于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养过夜。
control组添加直接放于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养过夜。
待转染细胞长满后,用Accutase消化细胞,将消化后的CAR-M通过流式细胞仪检测CAR表达。结果如图7B,图7B显示spinfection可以显著提升CAR分子的表达效率提高至57%经过计算,采用离心转染的方式相比于不采用离心而直接转染的方式,CAR在巨噬细胞中表达率提高了4.7倍。
本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术,本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中,跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素,一种限制或多种限制的情况下实现,这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”,“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里的所谓的“一个”仅仅表示“一”的意思,而不排除仅仅只是包括一个,也可以表示包括2个以上。这里采用的术语和表达方式所为描述方式,而不受其限制,这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征,但是可以知道,可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解,本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点,任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化,这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。
Claims (13)
1.FAP蛋白在制备抑制或清除衰老细胞试剂上的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述FAP具有如SEQ ID:1所示的氨基酸序列,编码FAP蛋白的核酸具有如SEQ ID:2的序列。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述清除衰老细胞试剂包括靶向FAP蛋白的嵌合抗原受体。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述清除衰老细胞试剂还包括细胞,所述细胞经靶向FAP蛋白的嵌合抗原受体修饰,所述细胞包括单核细胞、巨噬细胞或者树突状细胞中的任意一种或多种。
5.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述细胞为巨噬细胞。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述衰老细胞包括细胞复制、药物、或致癌基因中的任意一项或多项诱导的衰老细胞。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述药物诱导的衰老细胞包括MEK抑制剂和/或Cdk4/6抑制剂诱导的衰老细胞,所述MEK抑制剂包括曲美替尼、和/或多柔比星;所述Cdk4/6抑制剂包括palbociclib;所述致癌基因包括HRASG12D、NRASG12D、NRASG12D、D38A中的任意一种或多种。
8.FAP蛋白用于制备治疗衰老细胞引发疾病的试剂上的用途。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述衰老细胞引发疾病包括心脏纤维化、肺纤维化、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、糖尿病、肝纤维化、慢性肾病、衰老或骨关节炎中的任意一种或多种。。
10.FAP蛋白用于制备预测或检测是否为衰老细胞的试剂的用途。
11.一种嵌合抗原受体在制备清除衰老细胞试剂或治疗衰老细胞引发疾病或治疗骨性关节炎中的用途,其特征在于,所述嵌合抗原受体包含靶向FAP的抗体片段。
12.一种免疫工程细胞在制备清除衰老细胞试剂或治疗衰老细胞引发疾病或治疗骨性关节炎中的用途,其特征在于,所述免疫工程细胞包含嵌合抗原受体,所述嵌合抗原受体包含靶向FAP的抗体片段。
13.如权利要求12所述的用途,其特征在于,所述免疫工程细胞是巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞中的一种或多种。
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