CN116966285A - 一种纯化缓冲液组合物及口蹄疫灭活疫苗的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纯化缓冲液组合物及口蹄疫灭活疫苗的纯化方法。所述纯化缓冲液组合物包括第一缓冲液和第二缓冲液，其中，所述第一缓冲液包括35～45mM的Tris‑HCl和80～100mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为12～14mS/cm；所述第二缓冲液包括35～45mM的Tris‑HCl、80～100mM的MgCl2溶液和20～60mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为15～20mS/cm。本发明的纯化缓冲液组合物可实现口蹄疫灭活疫苗纯化的PEG复溶处理。

Description

一种纯化缓冲液组合物及口蹄疫灭活疫苗的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体来讲，是涉及一种纯化缓冲液组合物及口蹄疫灭活疫苗的纯化方法。
背景技术
口蹄疫灭活疫苗纯化生产工艺过程中，主流的纯化过程通常都包含PEG工艺、超滤工艺、层析工艺。PEG工艺环节是去除非结构蛋白重要的步骤之一，其工艺步骤主要涉及PEG沉淀与复溶，现有技术常见复溶过程中，通常使用一种缓冲液，分多次完成复溶，如，使用一种缓冲液，分4次完成复溶全过程，单次用时在25min左右，总计用时约100min。缓冲液用量多工艺实施时间较长，且该方法复溶后得到的产物中目标蛋白及非目标蛋白均有溶解，目标蛋白纯度往往较低，为5-10％左右。
同时由于目标蛋白纯度较低，现有技术在复溶工艺后需要通过超滤步骤，进一步提高纯度、减少PEG复溶后体积及杂质含量，以达到后续层析工艺的要求。而超滤步骤本身在包含浓缩及洗滤过程中，需要换2-3次不同的缓冲液循环冲洗，过程进行费时、费力，且洗滤过程如果意外情况发生污染又需要加入新纯化处理的步骤才能满足后续层析要求。
总体而言，现有口蹄疫灭活疫苗的纯化工艺在层析之前的处理步骤需要多种缓冲液交替使用、工艺复杂、处理时间长、效率低，得到的蛋白纯度较低，不利于后续处理，是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术存在的问题，本发明的发明人经过广泛而深入的研究，目的之一在于提供一种纯化缓冲液组合物，该纯化缓冲液组合物可实现口蹄疫灭活疫苗纯化的PEG复溶处理；本发明的另一目的在于提供一种口蹄疫灭活疫苗的纯化方法，所述纯化方法能够优化PEG复溶过程及超滤过程，通过使用至少两种(如两种)不同缓冲液达到维持PEG复溶过程收率稳定、提升纯度目的，同时借助缓冲液调整省去超滤过程中的洗滤步骤。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种用于口蹄疫灭活疫苗的纯化缓冲液组合物，包括第一缓冲液和第二缓冲液，其中，
所述第一缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl和80～100mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为12～14mS/cm；
所述第二缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl、80～100mM的MgCl2溶液和20～60mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为15～20mS/cm。
在本发明的一些实施方式中，所述纯化缓冲液组合物由第一缓冲液和第二缓冲液组成。
本发明的缓冲液组合物温和，能够保护146s抗原完整性，避免抗原降解或聚集。
本发明第二方面提供了一种如上第一方面所述的纯化缓冲液组合物在纯化口蹄疫灭活疫苗中的应用。其中，所述第一缓冲液用于冲洗处理，第二缓冲液进行复溶处理。
在本发明的一些实施方式中，当使用所述纯化缓冲液纯化口蹄疫灭活疫苗时，在超滤工艺阶段，能够减少洗滤工艺步骤，能够省去传统的超滤步骤洗滤过程中的换液步骤(如2-3次换液)，节约时间，降低工艺复杂性。
本发明第三方面提供了一种口蹄疫灭活疫苗的纯化方法，包括对待纯化口蹄疫病毒液依次进行PEG沉淀、PEG复溶和超滤的步骤。
其中，对通过PEG沉淀后得到的沉淀中间产物进行所述PEG复溶包括步骤：
S101、通过第一缓冲液对所述沉淀中间产物进行冲洗处理，得到冲洗后沉淀产物；
S102、将所述冲洗后沉淀产物与第二缓冲液混合后进行复溶处理，得到复溶后产物。
在本发明的一些实施方式中，步骤S101中，所述沉淀中间产物与所述第一缓冲液的体积比为4～8：1～2。
在本发明的一些实施方式中，步骤S102中，所述冲洗后沉淀产物与所述第二缓冲液的体积比为1～2：1～3。
本发明中，使用所述第一缓冲液冲洗能够去除非目标蛋白，所述第二缓冲液能够溶解目标蛋白。本发明中，非目标蛋白指的是如宿主蛋白、核酸、培养基残留组分等，目标蛋白指的是口蹄疫病毒完整颗粒(以下可简称为146S)。
在本发明的一些实施方式中，所述第一缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl和80～100mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为12～14mS/cm。
在本发明的一些实施方式中，所述第一缓冲液包括40mM的Tris-HCl和100mM的NaCl溶液，pH值为8.0。
在本发明的一些实施方式中，所述第二缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl、80～100mM的MgCl2溶液和20～60mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为15～20mS/cm。
在本发明的一些实施方式中，所述第二缓冲液包括40mM的Tris-HCl、100mM的MgCl2溶液和40mM的NaCl溶液，pH值为8.0。
本发明中，所述第一缓冲液对所述沉淀中间产物进行冲洗处理后，冲洗液中不含有目标蛋白。换句话说，使用第一缓冲液冲洗时不会造成目标蛋白的损失。
在本发明的一些实施方式中，所述超滤包括对所述复溶后产物(即完成所述PEG复溶得到的溶液)进行浓缩处理的步骤。
在本发明的一些实施方式中，使超滤处理后的溶液的体积为待纯化口蹄疫病毒液体积的5～8％，以完成所述超滤的步骤；进一步优选的，完成所述超滤后的溶液的pH值为7.8～8.2、电导率为15～20mS/cm，以完成所述超滤的步骤。
例如，当待纯化抗原(待纯化口蹄疫病毒液)的体积为10L，采用PEG6000、硅藻土沉淀后，使用微米级滤板过滤器拦截抗原(会形成硅藻土滤饼)；使用第一缓冲液冲洗滤饼1次，再使用第二缓冲液冲洗滤饼1次，得到3～5L冲洗过滤饼的复溶后产物(即为复溶抗原)；继续使用300kDa或500kDa中空纤维柱超滤系统，对复溶抗原进行浓缩至0.5～0.8L(pH值为7.8～8.2，Cond为15～20mS/cm)进行层析工艺处理。
在本发明的一些实施方式中，进行所述超滤的步骤包括：通过300kDa或500kDa中空纤维柱超滤系统，控制TMP在0.1～0.5Bar，对完成所述PEG复溶得到的溶液(即上述步骤S102得到的复溶后产物)进行浓缩。
在本发明的一些实施方式中，所述超滤不包括更换缓冲液的步骤，即所述超滤能够省去超滤时洗滤的换液步骤。本发明的所述超滤步骤，由于使用本发明的缓冲液组合物进行纯化(第一缓冲液和第二缓冲液)，完成浓缩减少完成所述PEG复溶得到的溶液(即步骤S102得到的复溶后产物)的体积后，能够省去传统的超滤步骤洗滤过程中的换液步骤(如2-3次换液)，达到节约时间，降低工艺复杂性目的。
根据本发明，在完成超滤后，还可包括层析步骤。本发明中，通过所述超滤步骤，使溶液满足后续进行纯化时的层析步骤的要求(包括pH值、电导、体积等)即可。本发明对层析步骤并无严格限定，本领域技术人员可以根据具体情况进行确认。
本发明中所述待纯化口蹄疫病毒液可通过天康生物股份有限公司自制获得。
在本发明的一些实施方式中，所述PEG复溶的步骤中，口蹄疫146S抗原的收率不小于85％，优选不小于95％。
在本发明的一些实施方式中，完成所述PEG复溶得到的溶液中，口蹄疫146S抗原的纯度不小于20％，优选不小于30％。
本发明中，经过PEG沉淀和PEG复溶的处理步骤，待纯化口蹄疫病毒液的浓缩倍数可为2～3倍，即得到浓缩了2～3倍的所述复溶后产物；再经过超滤的处理步骤，所述复溶后产物的浓缩倍数可为5～7倍，即得到浓缩了5～7倍的超滤处理后溶液(待层析处理溶液)。
本发明中，经过PEG沉淀、PEG复溶和超滤的处理步骤，待纯化口蹄疫病毒液的浓缩倍数可为15～20倍。
本发明对PEG沉淀步骤并无严格限定，本领域技术人员可以根据具体情况确定。
在本发明的一些实施方式中，PEG沉淀的步骤包括：向抗原内加入4-10％的PEG6000，0.2-1％硅藻土及水溶液辅助溶解。
本发明中，可加入硅藻土、PEG、水溶液等成分进行PEG沉淀完成PEG沉淀。
本发明中，PEG沉淀所使用的PEG的分子量可为6000。但可以理解的是，本发明对PEG沉淀并无严格限定。
在本发明的一些实施方式中，进行PEG沉淀所使用的溶液与所述复溶后产物的体积比为1：2～3。例如，使用PEG6000及水辅助溶解的溶液进行PEG沉淀时，PEG6000及水溶液辅助溶解的溶液的总体积与所述复溶后产物的体积比为1：2～3。
在本发明的一些实施方式中，所述口蹄疫灭活疫苗的纯化方法包括步骤：
①灭活得到抗原，经“离心+深层过滤”或“沉淀+深层过滤”过滤方式澄清阻断后，加入硅藻土、PEG、水溶液等成分进行PEG沉淀；
②沉淀重悬后，使用膜堆过滤，采用离心方式或滤板截留方式收集沉淀，得到沉淀中间产物；
③使用冲洗缓冲液(即上述第一缓冲液)冲洗沉淀中间产物，再使用复溶缓冲液(即上述第二缓冲液)复溶沉淀，完成沉淀中回收目标蛋白，得到PEG沉淀后产物；
④超滤浓缩，将PEG复溶的目标蛋白溶液进行浓缩处理，满足溶液的pH值为7.8～8.2、电导率为15～20mS/cm；
⑤层析步骤：使用离子交换层析方式对洗滤后抗原进行进一步纯化。
本发明第四方面提供了一种使用包括上述第三方面所述的纯化方法获得的口蹄疫灭活疫苗。
在本发明的一些实施方式中，所述口蹄疫灭活疫苗可通过对含有口蹄疫146S抗原的待纯化口蹄疫病毒液依次进行PEG沉淀与复溶、超滤和层析获得。
与现有技术相比，本发明包括以下有益效果：
1)本发明的纯化缓冲液组合物，缓冲液温和，能够保护146s抗原完整性，避免抗原降解或聚集；
2)本发明提供的口蹄疫灭活疫苗的纯化方法，通过优化PEG复溶模式，使用非循环模式可以减少工艺时间；并且能够减少缓冲液交替更换，优化工艺连贯性；
3)本发明提供的口蹄疫灭活疫苗的纯化方法，通过使用两种缓冲液进行PEG复溶，确保第一缓冲液(冲洗缓冲液)仅能去除非目标蛋白(如少量宿主蛋白、核酸类非结构蛋白、小分子杂质、培养基内残留组分)成分，对目标蛋白无影响；第二缓冲液(复溶缓冲液)能够溶解目标蛋白，保证收率和纯度；
4)本发明提供的口蹄疫灭活疫苗的纯化方法，经过调整与优化后，进行PEG复溶步骤时，在保证收率前提下，纯度提升至20％以上；在超滤工艺阶段，能够减少洗滤工艺步骤，能够省去传统的超滤步骤洗滤过程中的换液步骤(如2-3次换液)，节约时间，降低工艺复杂性。
附图说明
图1和图2示出了本发明实施例1中使用冲洗缓冲液A-F进行冲洗前的液相色谱图；
图3和图4示出了本发明实施例1中使用冲洗缓冲液A-F完成冲洗后冲洗液的液相色谱图；
图5和图6示出了本发明实施例2中冲洗完成后冲洗液的液相色谱图；
图7和图8示出了本发明实施例2中复溶后得到的产物的液相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细说明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围并不限于下述说明。
以下实施例中，收率的计算方法为：
收率＝(复溶抗原146S含量*体积)/(抗原146S含量*体积)；
纯度的计算方法为：
纯度＝复溶抗原146S含量/复溶抗原总蛋白含量。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用原料、试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购途径获得的常规产品或者根据现有技术公开的制备方法制得。
以下实施例中，待纯化口蹄疫病毒液来自天康生物股份有限公司自制，通过灭活收获抗原经过滤澄清阻断后，按照质量体积比加入0.2-1％硅藻土、4-10％PEG 6000、1-5％水等成分进行PEG沉淀4h以上；将沉淀重悬混匀后，使用微米级膜堆/滤板过滤，富集沉淀，得到沉淀中间产物。
实施例1
实施例1中，使用10mL第一缓冲液对40mL沉淀中间产物进行冲洗处理，得到冲洗液。更换冲洗缓冲液(即第一缓冲液)，其他条件不变的情况下进行平行实验，得到冲洗液A-F。使用的冲洗缓冲液A-F如下表1所示：
表1
实施例1-1 A：40mM Tris-HCl,100mM NaCl溶液，pH 8.0，Cond为12-14mS/cm
实施例1-2 B：50mM Tris-HCl溶液，pH 8.0
实施例1-3 C：10mM Hepes溶液，pH 7.96
实施例1-4 D：1*PBS溶液，pH 7.4
实施例1-5 E：0.9％NaCl溶液
实施例1-6 F：去离子水
上述冲洗缓冲液A-F经口蹄疫146S HPLC方法检测，如图1和图2所示，冲洗缓冲液A-F无特征峰，同时在20-25min区间内，各冲洗缓冲液内出现很低的溶剂峰(＜0.002AU)，与口蹄疫抗原图谱相比有明显区别。
经口蹄疫146S HPLC方法分别检测得到的冲洗液A-F中是否存在口蹄疫146S。检测结果如图3和图4所示，与抗原自身相同出峰时间处，冲洗缓冲液B-F均有不同高度的目标峰出现，表明冲洗造成部分目标蛋白146S损失，同时20-25min处溶剂峰液增加(0.08-0.14AU)，说明有部分杂质被洗出。
实施例2
使用上述实施例1筛选出的冲洗缓冲液A，加入10mL冲洗缓冲液对40mL沉淀中间产物进行冲洗处理，经口蹄疫146S HPLC方法检测，如图5和图6所示，确认冲洗液内无目标蛋白特征峰(做平行对照，共2条线)，冲洗完成后，得到40mL冲洗后沉淀产物，平行实验6组；使用如下表2中不同的第二缓冲液I-VI(即复溶缓冲液)各20mL分别对6组冲洗后沉淀产物进行复溶，如表2所示。
表2
通过口蹄疫146S HPLC方法分别对复溶后得到的产物进行检测，结果如图7和图8所示，并计算收率、纯度如下表3所示：
表3
表3中的“灭活抗原”指的是进行PEG沉淀前的抗原。
由图7和图8可知，复溶缓冲液I-VI对PEG沉淀进行复溶后，经口蹄疫146SHPLC方法检测复溶沉淀缓冲液内出现与口蹄疫抗原相同的特征峰，表明复溶缓冲液可溶解目标蛋白146S。
由表3可知，选用冲洗缓冲液A和复溶缓冲液IV进行PEG复溶步骤，可以实现146S的收率为93.4％、纯度为32.1％。
实施例3
实施例3-1和实施例3-2的纯化方法包括步骤：
1)(无冲洗沉淀中间产物步骤)取2000mL复溶缓冲液，冲洗2000mL灭活抗原的沉淀中间产物，冲洗至500mL时，收集500mL混合冲洗液(记为4倍复溶)；复溶缓冲液为：40mMTris-HCL,100mM NaCL，250mM KCL，60MgCL2溶液，pH值为8.0，Cond为45-55mS/cm；
2)继续冲洗至1000mL时，收集1000mL混合冲洗液(记为2倍复溶)；复溶缓冲液为：40mM Tris-HCL,100mM NaCL，250mM KCL，60MgCL2溶液，pH值为8.0，Cond为45-55mS/cm；
3)继续冲洗至2000mL时，收集2000mL混合冲洗液(记为0倍复溶)；40mM Tris-HCL,100mM NaCL，250mM KCL，60MgCL2溶液，pH值为8.0，Cond为45-55mS/cm；
4)超滤浓缩，将PEG复溶后产物的目标蛋白溶液使用300kD或500kD中空纤维柱进行浓缩处理，满足溶液的pH值为7.9-8.0、电导率为45-55mS/cm、体积为200-300mL；
5)依次分别使用电导率为25-35mS/cm、15-20mS/cm洗滤液对浓缩抗原进行3-5倍体积连续洗滤，使最终的pH值为7.9-8.0、电导率为15-20mS/cm、体积为200mL；洗滤液为：40mM Tris-HCL,150mM NaCL，40MgCL2溶液，pH值为8.0，Cond为25-35mS/cm；40mM Tris-HCL,100mM NaCL，20MgCL2溶液，pH值为8.0，Cond为15-20mS/cm
6)层析：使用离子交换层析方式对洗滤后抗原进行进一步纯化。
实施例3-3和实施例3-4的纯化方法包括步骤：
1)加入500mL的冲洗缓冲液冲洗2000mL灭活抗原的沉淀中间产物，得到冲洗后沉淀产物；冲洗缓冲液为：40mM Tris-HCL，100mM NaCL溶液，pH值为8.0，Cond为12-14mS/cm；
2)取2000mL复溶缓冲液，冲洗沉淀产物进行复溶，冲洗至500mL时，收集500mL混合冲洗液(记为4倍复溶)，继续冲洗至1000mL时，完成沉淀中回收目标蛋白，得到PEG复溶后产物(记为2倍复溶)；复溶缓冲液为40mM Tris-HCL，100mM MgCl2溶液，40mM NaCL溶液，pH值为8.0，Cond为15～20mS/cm；
3)超滤浓缩，将PEG复溶后产物的目标蛋白溶液进行浓缩处理，满足溶液的pH值为7.9-8.0、电导率为15～20mS/cm、体积为200-300mL；
4)层析：使用离子交换层析方式对洗滤后抗原进行进一步纯化。
本实施例平行进行4组实验，具体区别如下表4所示。
表4
以实验室规模(40mL)进行上述实验，当收率均达到98％时，本发明(即改进工艺)的浓缩倍数是现工艺的2倍，且PEG复溶后抗原的纯度较现工艺高(如上表中纯度高25.55％)。
以生产规模(6000L)进行上述实验，比较现工艺与改进工艺对纯化工艺的影响，以相同PEG复溶收率(98％)为前提，从工艺时间、缓冲液用量、缓冲液种类等方面进行比较，结果如下：
1)工艺时间：未发生变动工艺时间不计，现工艺完成PEG复溶需要100min，本发明的改进工艺总用时(包含冲洗及复溶)约50min，可节约50min。
2)缓冲液使用量：PEG复溶工艺阶段，本发明的改进工艺(4500L)较现工艺(1200L)多使用2400L；超滤工艺阶段，改进工艺省去洗滤步骤，较现工艺少用2400L，但工艺时间可节约48min。
3)缓冲液种类：从PEG复溶工艺开始至层析工艺结束过程，本发明的改进工艺仅需要2种缓冲液即可，现工艺需要4-5种缓冲液。
综上所述，在相同收率条件时，改进工艺较现工艺纯度可提升20％；在相同处理体积条件时，改进工艺较现工艺时间更短、缓冲液用量、种类更少。
实施例4
使用10mL的冲洗缓冲液对40mL沉淀中间产物进行冲洗处理，得到冲洗后沉淀产物；
使用20mL复溶缓冲液对冲洗后沉淀产物进行复溶处理，得到复溶后产物。
分别使用下表5中冲洗缓冲液(表中简称冲洗)和复溶缓冲液(表中简称复溶)，进行上述纯化，得到的结果如下表6所示。
表5
表6
样品名称 体积 收率(％) 纯度(％)
抗原 40 / 0.24
实施例4-1 20 94.22 29.19
实施例4-2 20 97.82 30.44
实施例4-3 20 96.54 29.21
实施例4-4 20 92.58 30.24
实施例4-5 20 96.72 31.05
实施例4-6 20 82.47 28.64
抗原 40 / 0.24
在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为25-150，在本说明书中它的意思是具体列举了26-149、27-148……以及87-88等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本申请中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种用于口蹄疫灭活疫苗的纯化缓冲液组合物，其包括第一缓冲液和第二缓冲液，其中，
所述第一缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl和80～100mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为12～14mS/cm；
所述第二缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl、80～100mM的MgCl2溶液和20～60mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为15～20mS/cm。
2.一种权利要求1所述的纯化缓冲液组合物在纯化口蹄疫灭活疫苗中的应用。
3.一种口蹄疫灭活疫苗的纯化方法，包括对含有口蹄疫146S抗原的待纯化口蹄疫病毒液依次进行PEG沉淀、PEG复溶和超滤的步骤，
对通过PEG沉淀后得到的沉淀中间产物进行所述PEG复溶包括步骤：
S101、通过所述第一缓冲液对所述沉淀中间产物进行冲洗处理，得到冲洗后沉淀产物；
S102、将所述冲洗后沉淀产物与所述第二缓冲液混合后进行复溶处理，得到复溶后产物。
4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述第一缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl和80～100mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为12～14mS/cm；
和/或，所述第二缓冲液包括35～45mM的Tris-HCl、80～100mM的MgCl2溶液和20～60mM的NaCl溶液，pH值为7.8～8.2，Cond为15～20mS/cm。
5.根据权利要求3或4所述的纯化方法，其特征在于，步骤S101中，所述沉淀中间产物与所述第一缓冲液的体积比为4～8：1～2；
和/或，步骤S102中，所述冲洗后沉淀产物与所述第二缓冲液的体积比为1～2：1～3。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述超滤包括对完成所述PEG复溶得到的溶液进行浓缩处理。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，使所述超滤后的溶液的体积为待纯化口蹄疫病毒液体积的5％～8％，以完成所述超滤的步骤；进一步优选的，完成所述超滤后的溶液的pH值为7.8～8.2、电导率为15～20mS/cm，以完成所述超滤的步骤。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述超滤不包括更换缓冲液的步骤。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述PEG复溶的步骤中，口蹄疫146S抗原的收率不小于85％，优选不小于95％；
和/或，完成所述PEG复溶得到的溶液中，口蹄疫146S抗原的纯度不小于20％，优选不小于30％。
10.一种使用包括权利要求3-9中任一项所述的纯化方法获得的口蹄疫灭活疫苗。
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