CN116948918A - 一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌及其应用 - Google Patents
一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌及其应用，所述抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株，保藏编号为CGMCC No.24472，保藏日期为2022年03月07日，该菌株能够有效抑制幽门螺杆菌感染，调节肠道菌群环境。
Description
技术领域
本发明属于本申请涉及微生物技术领域，涉及一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌及其应用。
背景技术
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）是一类在显微镜下呈螺旋形或弧形的需氧细菌，与慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的发生有密切的关系。在生长繁殖过程中对营养要求较高，而且可以抵抗胃酸，进入人体后可以在胃黏膜上皮细胞中生存并繁殖，在过程中会产生大量的侵袭因子和毒素，促使消化性溃疡甚至胃癌的发生。幽门螺杆菌对于胃炎的治病机制主要在于在胃内定植后可以产生大量的毒力因子，这些毒力因子会使胃黏膜上皮细胞发生变性，从而破坏正常的胃黏膜屏障，导致胃酸侵蚀胃黏膜，进而引发胃炎；而幽门螺杆菌对于消化性溃疡的治病机制主要在于幽门螺杆菌在破坏胃黏膜屏障的同时，还可能刺激胃酸的分泌，加重胃黏膜和十二指肠黏膜的损伤，进而导致胃溃疡或十二指肠溃疡的发生，约10%的幽门螺杆菌患者会发展胃溃疡。幽门螺杆菌可以打破胃黏膜上皮细胞的繁殖和死亡的平衡，导致慢性萎缩性胃炎。随着疾病进一步的发展，可以发展为肠上皮化生、不典型增生甚至癌变。WHO（世界卫生组织）将幽门螺杆菌（Hp）定义为第一类生物致癌因子。幽门螺杆菌可以通过直接或间接激活转录因子，进一步转录调控下游基因的表达，对胃癌形成、转移、耐药及维持干细胞特性等方面发挥重要作用。对于幽门螺杆菌的感染，临床上一般采用三联或四联药物治疗的方法，但是也会产生一定的临床副作用，会导致胃肠道息肉和白细胞的减少，以及产生胃肠道反应，如恶心、呕吐和肠道细菌使用不平衡等，然而在治疗过程中抗生素对人体产生的副作用往往让人难以承受，抗生素疗法的根除率也在逐年降低。
因此制备一株益生菌，能够有效缓解幽门螺杆菌感染和复发，已经成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌，所述抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株，保藏编号为CGMCC No.24472，保藏日期为2022年03月07日。
本发明从粪便样本中分离获得并保藏了一株新的能够抗幽门螺杆菌感染的菌株，将其命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株，该菌株具有较强的自聚能力和胆盐耐受能力，对胃酸的耐受能力也较强。它是一种对人体肠道及其重要的肠道微生物，与肠道健康密切相关，短双歧杆菌对正常机体生长机能、调节肠道动态平衡、保护肠道上皮屏障和提高免疫力，保持肠道屏障的完整性，减少炎症细胞的生成，同时短双歧杆菌还可以增强机体免疫力，促进宿主的新陈代谢。
筛选方法：使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基上，在37℃培养48 h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30%的甘油进行保藏。
针对保藏的多株单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力（人工模拟）、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株，对其进行鉴定。
本发明所述短双歧杆菌能够提高四重抗生素治疗在三联治疗失败后根除残留的幽门螺杆菌感染、能够将幽门螺杆菌的根除率提高5-15%、可改善幽门螺杆菌引起的胃症状，短双歧杆菌在核因子-κB（NF-κB）这些基因的调控中起着关键作用，而胃黏膜中的各种炎症反应都是由NF-κB介导的。
第二方面，本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌的培养物，所述培养物的制备方法包括：将第一方面所述的短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株接种于培养基中，在30-40℃下培养12-30 h即得。
培养温度可以选择30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等，培养时间可以选择12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述培养基包括乳糖20-30g/L、牛肉浸粉10-15g/L、酵母浸粉10-15g/L、牛骨蛋白胨5-10g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、柠檬酸氢铵2-5g/L、乙酸钠2-5g/L、硫酸镁0.2-0.5g/L、硫酸锰0.1-0.2g/L、吐温80 1-2 mL/L、L-半胱氨酸盐酸盐1-2 g/L和水。
所述乳糖的质量浓度可以选择20 g/L、22 g/L、24 g/L、26 g/L、28 g/L、30 g/L等，牛肉浸粉的质量浓度可以选择10 g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L等，酵母浸粉的质量浓度可以选择10 g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L等，牛骨蛋白胨的质量浓度可以选择5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L等，磷酸氢二钾的质量浓度可以选择2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L等，柠檬酸氢铵的质量浓度可以选择2 g/L、3 g/L、4g/L、5 g/L等，乙酸钠的质量浓度可以选择2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L等，硫酸镁的质量浓度可以选择0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L等，硫酸锰的质量浓度可以选择0.1 g/L、0.12 g/L、0.14 g/L、0.16 g/L、0.18 g/L、0.2 g/L等，吐温80的体积浓度可以选择1 mL/L、1.2 mL/L、1.4 mL/L、1.6 mL/L、1.8 mL/L、2 mL/L等，L-半胱氨酸盐酸盐的质量浓度可以选择1 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2 g/L等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，所述抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂中的菌株包括第一方面所述的短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株。
优选地，所述益生菌剂中短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株的活菌数不低于2×108 CFU/g，例如2×108 CFU/g、3×108 CFU/g、4×108 CFU/g、5×108 CFU/g、6×108 CFU/g、7×108 CFU/g、8×108 CFU/g、9×108 CFU/g、1×109 CFU/g、2×109 CFU/g、5×109 CFU/g、8×109 CFU/g、1×1010 CFU/g、5×1010 CFU/g、1×1011CFU/g、1×1012 CFU/g、1×1013 CFU/g等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
优选地，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
在上述益生菌制剂中，还可将本发明的菌株与不同的甜味剂或调味剂、调色物质、稳定剂、助流剂、填充剂等食品中可接受的辅料进行组合。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉。
优选地，所述辅助添加剂包括益生元。
优选地，所述益生元包括低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、菊粉、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为低聚木糖。
优选地，所述益生菌剂中的菌株还包括副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株，所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCCNo.1.12731，保藏日期为2020年7月20日。
本发明创造性发现上述短双歧杆菌BBr96菌株能够与副干酪乳杆菌LC86菌株进行复配，用于抗幽门螺杆菌感染具有优异的效果，且与单一菌株相比，复合菌具有更显著的抗幽门螺杆菌的效果，说明BBr96菌株与LC86菌株在上述功效上具有协同增效作用。
优选地，短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的活菌数之比为(5-10):1。
其中(5-10)中的具体点值均可选择5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第四方面，本发明提供一种根据第三方面所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂的制备方法，所述制备方法包括：将菌株接种于培养基中，培养，离心收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，冷冻干燥，即得。
第五方面，本发明提供一种根据第一方面所述的BBr96菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备抑制幽门螺杆菌感染的产品或抗氧化剂中的应用。
所述抗氧化剂为能够抑制氧化或过氧化作用的物质。在某些实验方案中，抗氧化剂能够抑制自由基的产生、清除存在的自由基或者阻断自由基参与氧化反应，抑制过氧化反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从粪便中分离获得并保藏了一株新的能够抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌，将其命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，可以抑制幽门螺杆菌感染，显著降低幽门螺杆菌对AGS细胞和SGC7901细胞的粘附力，使用该菌种进行改善或治疗时，不会产生耐药性，改善或治疗过程中也不会引起患者的不良反应，可用于抑制幽门螺杆菌感染的产品，如药物和保健品等。
下述内容中涉及的短双歧杆菌BBr96菌株为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24472，保藏日期为2022年03月07日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述内容中涉及的副干酪乳杆菌LC86菌株为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 1.12731，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
MRS固体培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2 g、酵母粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g、琼脂20 g和半胱氨酸氨酸盐0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.2g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.04g，吐温80 1.0g，蒸馏水1.0L。pH 5.7±0.2。121℃，15min灭菌。
实施例1
本实施例筛选一株抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌，步骤如下：
（1）选取健康婴儿粪便样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基（培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物）上，在37℃培养48 h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30%的甘油进行保藏。
（2）针对保藏的粪便来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力（人工模拟）、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株，具体为如下：
A. 胃肠液耐受能力测试：
人工模拟胃液：配制0.5%NaCl溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/L HCl调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。
人工模拟肠液：配制0.5%NaCl溶液，加入0.1%胰蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。
待选菌株在人工胃液和肠液中厌氧培养3h，取0h和3h的消化液进行活菌数检测，计算其存活率。菌株存活率（%）=A/B×100%，式中A表示该菌0h的活菌数（CFU/mL），B表示该菌3h的活菌数（CFU/mL）。
B. HT-29细胞粘附能力测试：
菌种活化：待选菌株按2%接种量接种于含有0.1%的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃培养14h，取发酵液离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为108CFU/mL。
HT-29细胞培养：在细胞培养瓶中，加入5mL DMEM完全培养液（含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素溶液），于5% CO2恒温培养箱中37℃孵育，每天换1次培养液，待细胞状态良好后（70%-80%融合），用0.2%消化液（胰酶-EDTA）进行消化传代。
黏附性试验：将消化的HT-29细胞调整浓度到105cell/mL，接种到12孔细胞培养板中，每孔1mL，于5% CO2浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层，用无菌PBS洗涤两次，其中一个孔用胰酶消化，用血球计数板进行细胞计数；其他孔中分别加入待选菌株悬液1mL，于5%CO2培养箱中37℃孵育2h后，用无菌PBS洗涤细胞5次，除去未黏附的菌悬液，每孔加入0.2mL胰酶-EDTA缓冲液消化细胞5min，消化完后加入0.8mL PBS吹打均匀，取菌液进行稀释活菌计数。
C. 抑菌能力测试：
采用牛津杯法测试对致病菌的抑制能力：取拮抗菌株按2%（V/V）接种至含有0.1%的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃恒温静置培养12h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液混匀，使体系病原菌活菌数在106 CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，每孔注入200 μL拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
D. 功能性低聚糖利用能力测试：
无糖培养基：蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母浸膏0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K2HPO40.2%、MgSO4 0.058%、MnSO4 0.019%、吐温-80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%。
菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖购于量子高科（中国）生物股份有限公司，低聚木糖（XOS）购自山东龙力生物科技有限公司。
将低聚木糖（XOS）、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖按2%加入到上述无糖培养基中，获得含低聚糖为碳源的培养基。将待选菌株接种到含低聚糖的培养基中，37℃恒温静置培养12h，测定OD600吸光度判断菌株对功能性菌株的利用能力。
综合以上胃肠液耐受能力（人工模拟）、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和对利用功能性低聚糖能力实验，BBr96是最好的菌株。
实施例2
本实施例将实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16SrRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
（1）形态鉴定
将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可知，菌落呈乳白色，为圆形，直径大多1.0mm以上，表面光滑、隆起，边缘整齐。
（2）16S rRNA分子生物学鉴定
将-80℃保藏的菌株取出，按2%比例接种于装有20 mL的MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养18 h后进行离心分离，8000 rpm下离心10 min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。
SEQ ID No:1：
CGGCTCCCTCCCGCAAGGGGTTAGGCCACCGGCTTCGGGTGCTGCCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGACGTTGCTGATTCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGGGATCCGCTCCAGCTCGCACTGTCGCATCCCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTAACCCCGGCGGTCCCCCGTGAGTTCCCGGCACAATCCGCTGGCAACACGGGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCCGCCCCGAAGGGAAACCCCATCTCTGGGATCGTCGGGAACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTAGCTCCGACACGGAACCCGTGGAACGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCAAGCCCGCCCGTACCCGGCGCGGATCCACCGTTAAGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAAAGGTACACTCAACACAAAGTGCCTTGCTCCCTAACAAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGAAGCCATGGTGGGCCGTTACCCCGCCATCAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAGGCTTTCCCAACACACCATGCGGTGTGATGGAGCATCCGGCATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCATGGGGCAGGTCGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCACCAAGCAAAGCCCGATGGATCCCGTTCGACTGCATG。
实施例3
短双歧杆菌对不同基因型幽门螺杆菌生长的抑制作用
短双歧杆菌菌悬液制备：
将短双歧杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃培养18h进行活化，连续活化两次；活化液按2%接种量接种到灭菌后的MRS培养基中，37℃培养20 h，在4℃下7000r/min离心10min，取上清液于0.22μm无菌滤膜过滤，得到短双歧杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，得到短双歧杆菌菌悬液。
抑菌圈实验：
吸取H.pylori cagA+基因型和H.pylori vacA+基因型幽门螺杆菌（密度为1×107CFU/mL）0.1mL分别置于固体培养基表面，涂布均匀，待表面菌液固定在平板的表面后打孔，分别加入0.2mL以下任一组液体，从而形成不同实验组别：短双歧杆菌菌悬液；短双歧杆菌上清液；阳性对照（质量浓度为0.025%的奥美拉唑）；阴性对照（PBS缓冲液）；空白对照（MRS液体培养基）。37℃培养72h测定抑菌圈直径，结果表1所示。
表1
本发明的短双歧杆菌上清液和菌悬液对于H.pylori cagA+基因型和H.pylorivacA+基因型均具有抑制效果，其中短双歧杆菌上清液对H.pylori cagA+基因型和H.pylorivacA+基因型的抑菌圈直径分别为15.3mm和16.8mm，短双歧杆菌菌悬液对H.pylori cagA+基因型和H.pylori vacA+基因型的抑菌圈直径分别为18.4mm和20.5mm，本发明的短双歧杆菌对幽门螺杆菌体具有良好的抑菌效果，可作为幽门螺杆菌抑菌剂使用。
实施例4
短双歧杆菌BBr96改善幽门螺杆菌的调节作用：
实验动物：河南省实验动物中心提供3周龄，雄性昆明小鼠50只，每只体重16-18g，动物饲养控制条件为清洁级。
幽门螺杆菌（Hp）的培养和保存：参照E Sturegård（DOI： 10.1099/00222615-47-12-1123）的方法培养Hp 72 h。取菌液涂片，经革兰染色，在油镜下观察菌体形态。留取菌体弯曲明显的菌液，采用含10%蔗糖和50%小牛血清的保存液将细菌浓度调整至2.5×109CFU/mL后，置-70℃贮存备用。
测试方法与实验分组：
在小鼠中随机选取10只作为正常对照，予每只小鼠生理盐水0.5 mL灌胃，每隔2 d1次，共7次。其余40只小鼠制造Hp感染模型，予每只小鼠Hp液0.5 mL菌液灌胃，每隔2 d一次，共7次，之后随机挑选10只小鼠与正常对照小鼠一同处死，进行快速尿素酶试验和Giemsa染色电镜观察，检测是否存在Hp感染，确认造模成功后将Hp感染的其余30只小鼠采用随机数字表法分为3组，每组10只，3组小鼠在停药4周后统一处死。
标准三联组：予标准三联疗法治疗2周[阿莫西林：50 mg/(kg·d)，2.4 mL，分2次；克拉霉素：15 mg/(kg·d)，4.8 mL，分2次；奥美拉唑0.8 mg/(kg·d)，2.0 mL分2次]；
BBr96组：在标准三联疗法基础上加用BBr96治疗2周[黄连素7.5 mg/(kg·d)，2.1mL；阿莫西林：50 mg/(kg·d)，2.4 mL，分2次；克拉霉素：15 mg/(kg·d)，4.8 mL，分2次；奥美拉唑0.8 mg/(kg·d)，2.0 mL分2次]；
铋剂组：在标准三联疗法基础上加用铋剂治疗2周[胶体果胶铋8 mg/(kg·d)，1.8mL；阿莫西林：50 mg/(kg·d)，2.4 mL，分2次；克拉霉素：15 mg/(kg·d)，4.8 mL，分2次；奥美拉唑0.8 mg/(kg·d)，2.0 mL分2次]。
标本采集与检测：
各组小鼠禁食不禁水5 h，处死解剖取出胃，沿胃大弯和胃小弯剪开，一半固定后Giemsa染色电镜观察，一半4℃保存送微生物室进行快速尿素酶试验
(1)快速尿素酶法检测：使用Hp快速尿素酶检测试剂盒，取胃黏膜组织1块放在黄色试纸中央，观察试纸颜色变化，试纸组织边缘1 min内由黄色变成樱红色为强阳性，3 min内变成樱红色为弱阳性，不变色为阴性；
(2)胃黏膜Giemsa染色法：将胃组织切片浸入Giemsa染液中常温染色2 min，自来水洗1 min，将切片浸入1%醋酸溶液分化数秒，自来水洗。
镜检染色结果：Hp感染呈淡蓝色，结果如表2所示。
根除率＝[(初始Hp阳性数－停药4周后依然Hp阳性数)/初始Hp阳性数]×100%。
表2
为确保实验准确性，分别采用两种检测方法进行Hp感染检测，快速尿素酶法和Giemsa染色法，其阳性结果一致。标准三联组根除率为60.0%，BBr96根除率为70.0%，铋剂组根除率为90.0%，3组根除率差异有统计学意义(P<0.05)，其中BBr96组根除率低于铋剂组，高于标准三联组，组间差异有统计学意义。
实施例5
短双歧杆菌BBr96的代谢产物对幽门螺杆菌生长的抑制作用
制备Hp菌液：将幽门螺杆菌接种至液体培养基，在37℃，微需氧培养条件下培养7d，得到HP菌液，用幽门螺杆菌液体培养基稀释至1×108 CFU/mL。调节幽门螺杆菌液体培养基至pH＝2.5作为稀释液，用稀释液将短双歧杆菌BBr96代谢产物进行2.5倍、5倍、10倍、20倍稀释。
取6根15 mL无菌离心管，分别为短双歧杆菌BBr96代谢产物原液组、1:2.5组、1:5组、1:15组、1:20组和空白对照组，每根管中加入6 mL稀释至1×108 CFU/mL的Hp菌液，随后分别加入5 mL稀释至不同倍数的短双歧杆菌BBr96，原液组加入短双歧杆菌BBr96，对照组加入稀释液，随后于37℃微需氧环境作用2 h。
稀释滴定计数(20μL点板)：取6个平板，每个平板平均分为6个区域。随后将固体平板在37℃微需氧培养7天。进行菌落计数，不同浓度短双歧杆菌BBr96代谢产物对幽门螺杆菌的杀伤效果如表3所示。
CFU菌落计数方法换算公式：CFU=（N/V)×（1/d）
其中，CFU表示菌落形成单位，N表示实际计数的菌落数，V表示取样体积，d表示取样液稀释倍数。
表3
通过以上数据说明，对比空白对照组，短双歧杆菌BBr96原液组以及1:2.5组对幽门螺杆菌杀灭能力较强。
实施例6
探究短双歧杆菌BBr96对幽门螺旋杆菌感染的预防和抑制作用
选用雄性小鼠，体重18-22 g，将上述小鼠随机分为5组，每组10只。其中，第一组小鼠灌胃6×109CFU短双歧杆菌BBr96；第二组小鼠灌胃6×109CFU副干酪乳杆菌LC86；第三组小鼠灌胃6×109CFU短双歧杆菌BBr96和副干酪乳杆菌LC86的组合物（活菌数之比为5:1）；第四组小鼠灌胃6×109CFU短双歧杆菌ATCC15700和副干酪乳杆菌LC86的组合物（活菌数之比为5:1）；对照组灌胃生理盐水，每天灌胃1次，连续灌胃处理60d。在第61d时灌胃上述组合物的同时，分别对每只小鼠灌胃0.1mL活菌数为6×109CFU/mL的幽门螺旋杆菌菌液，连续灌胃3天。最后一次灌胃结束后1 h，将小鼠断颈处死，取胃体下部组织，称重，按照1:9（g/mL）的比例加入生理盐水，制备组织匀浆，检测尿素酶活性，计算体内抑菌率。
尿素酶活性检测方法：将小鼠组织匀浆粉碎后加入9 mL生理盐水，使用移液枪吸取1 mL转入培养皿中，用酚红溶液配制尿素溶液，直至完全浸润，停留5min，观察培养皿的红色反应，观察检测指标如表4所示。
表4
抑菌率检测方法：将40 mg的小鼠的匀浆组织溶解于200μL的DMSO和800μL的MH培养基中，震荡混匀，制备提取物储备液，阴性对照不含小鼠的匀浆组织。提取物储备液以1:150的比例稀释至MH培养基中，在595nm处读取吸光度值，并在37℃下孵育24h。最后观察板上是否存在抑制现象，并重新读取OD值。计算出OD的变化，并使用以下公式计算出对细菌生长的百分比抑制率。
结果如表5所示。
表5
由试验结果可知，BBr96的抑菌率为76.35%，BBr96+LC86组合物的效果有显著的增强作用，且该组合方式优于其他组合的方式。综上所述，该组合物对幽门螺旋杆菌感染具有良好的预防和抑制效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌命名为短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株，保藏编号为CGMCCNo.24472，保藏日期为2022年03月07日。
2.一种抗幽门螺杆菌感染的短双歧杆菌的培养物，其特征在于，所述培养物的制备方法包括：将权利要求1所述的短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株接种于培养基中，在30-40℃下培养12-30 h即得。
3.一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，其特征在于，所述抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂中的菌株包括权利要求1所述的短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株。
4.根据权利要求3所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株的活菌数不低于2×108 CFU/g。
5.根据权利要求3所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
6.根据权利要求3所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂和/或辅助添加剂。
7.根据权利要求3所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株还包括副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株，所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCC No. 1.12731，保藏日期为2020年7月20日。
8.根据权利要求7所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂，其特征在于，短双歧杆菌Bifidobacterium breve BBr96菌株与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的活菌数之比为(5-10):1。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将菌株接种于培养基中，培养，离心收集菌泥，将菌泥与保护剂混合，冷冻干燥，即得。
10.根据权利要求1所述的BBr96菌株或权利要求2所述的培养物或权利要求3-8中任一项所述的益生菌剂在制备抑制幽门螺杆菌感染的产品或抗氧化剂中的应用。
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