CN116942847B - 一种靶向毛囊的载药植物外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体及其制备方法和应用,属于植物外泌体技术领域。本发明的靶向毛囊的载药植物外泌体的制备方法,包括如下步骤:(1)制备纳米级中草药悬浮液;(2)制备植物外泌体;(3)将所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体混合,得到负载药物的植物外泌体;(4)用Wnt3a蛋白修饰所述负载药物的植物外泌体,得到所述靶向毛囊的载药植物外泌体。本发明将纳米级中草药提取物包封在经稳定性修饰的植物外泌体中,再利用特异性毛囊细胞Wnt受体的靶向蛋白Wnt3a对外泌体进行修饰,构建药物纳米递送系统,使递送系统具有靶向性,提高药物的稳定性和生物利用率。
Description
技术领域
本发明涉及植物外泌体技术领域,尤其涉及一种靶向毛囊的载药植物外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
白发是指头发失去了黑色素,呈现出白色或灰色的颜色。白发的形成主要与体内的黑色素生成和分泌过程相关。黑色素是一种由毛囊中的色素细胞合成的色素,它能够赋予头发、皮肤和眼睛等组织颜色,它的生成和分泌与头发的色素调节和保护密切相关。黑色素的生成和分泌受到多种因素的影响,例如遗传、环境、营养等因素都可以影响黑色素的生成和分泌。
目前,通过外用药物、光疗等方法来促进黑色素的生成和分泌已经成为了一种常见的治疗方法。然而,这些方法存在着一些局限性,例如需要长期使用、副作用较大等。因此,寻找一种新的、安全有效的方法来促进黑色素的生成和分泌,成为了一项重要的研究课题。
中草药在促进黑色素生成和分泌方面有一定的潜力,因此被广泛用于治疗白发。中草药中具有促进黑色素生成和分泌作用的活性成分主要包括多酚类、黄酮类、生物碱类、皂苷类等。这些活性成分可以通过不同的途径影响黑色素合成和分泌过程,例如促进酪氨酸酶活性、增加黑色素细胞数量、增强黑色素细胞对黑色素的吞噬能力等。常见的促进黑色素生成和分泌的中草药包括黄柏、何首乌、川芎、当归、桑白皮等。这些草药可以单独使用或者组成复方使用,具体的使用方法需要根据患者的具体情况来进行选择和调配。
近年来,越来越多的研究表明,植物外泌体作为一种天然的载体,可以有效地将生物活性物质输送到细胞内部,从而实现更加精准的靶向治疗。同时,植物外泌体具有较好的生物相容性和稳定性,可以减少药物的不良反应和副作用。目前已有临床试验验证了外泌体治疗疾病的安全性,未来有望成为治疗肿瘤、心脑血管等难治性疾病的突破口。中医药作为传统药物,在现代研究中能通过多途径、多靶点实现对目标靶器官的调控,从而发挥临床疗效。现已有对负载中药复方制剂外泌体的研究,复方制剂包括但不限于补阳还五汤、通心络胶囊。在大数据、精准医学的背景下,更需要对传统药物的有效成分进行研究、分析和提纯,运用外泌体等更加安全有效的药物载体,可望实现药物对目标靶器官或细胞进行精确干预。
植物外泌体样纳米囊泡(plant exosome-like nanovesicles,PELNVs)是源于植物真核细胞的多泡体,通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性小囊泡,由于来源于植物,资源广泛,因此具有大规模生产的可行性。与此同时,来源于药用植物的PELNVs往往富含各种具有生物活性的脂质、蛋白质、RNA等成分,是天然的纳米制剂,被证明在肿瘤、免疫调节、肠道疾病与再生医学等方面具有显著的调控作用。并且,PELNVs兼具纳米载体的形态与特点,因此可作为低毒的纳米载体实现对外源性药物分子的递送,相比哺乳动物来源和人工合成的纳米囊泡,基于PELNV的药物递送纳米平台在生物相容性、稳定性、体内分布、延长半衰期和细胞内化等方面都表现出显著的优势。此外,PELNVs还具有体积小、组织穿透性强等优点,在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性,所有这些特征都使得PELNVs成为经皮递送、靶向给药、基因传递等药物递送中较理想的载体选择,具有广阔的应用前景。
Wnt3a是一种Wnt信号通路激动剂,可以模拟Wnt信号通路的作用,从而促进毛囊干细胞的增殖和分化,促进毛发的生长。Wnt3a通过与Frizzled蛋白的Cys-rich domain结合来启动Wnt信号通路,并进一步激活Dishevelled蛋白和其他信号通路分子,促进毛囊干细胞的增殖和分化。Frizzled蛋白是Wnt信号通路的重要受体蛋白,参与了Wnt信号通路的调节和控制。Frizzled蛋白与Wnt3a结合后,Wnt3a会促进Frizzled蛋白与Low-densitylipoprotein receptor-related protein(LRP)家族蛋白的结合,形成Wnt-Frizzled-LRP复合物,进而启动Wnt信号通路。Wnt信号通路对毛囊的生长和再生起着重要的作用,因此,增强Wnt受体信号可以促进毛囊干细胞的增殖和分化,从而促进毛发的生长。
然而,一直以来,因为中草药提取物的活性成分复杂、颗粒尺寸较大等问题,导致其难以特异性发挥作用,且中草药活性成分本身不具有靶向性,难以精准靶向靶点,进一步导致其生物利用度低,是药物开发和临床应用的关键障碍。因此,提高中草药提取物的靶向性对解决中草药活性成分透皮吸收、靶向毛囊的难题,提高其利用率有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向毛囊的载药植物外泌体及其制备方法和应用。本发明将纳米级中草药提取物包封在经稳定性修饰的植物外泌体中,再利用特异性毛囊细胞Wnt受体的靶向蛋白Wnt3a对外泌体进行修饰,构建药物纳米递送系统,使递送系统具有靶向性,提高药物的稳定性和生物利用率。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备纳米级中草药悬浮液;
(2)制备植物外泌体;
(3)将所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体混合,得到负载药物的植物外泌体;
(4)用Wnt3a蛋白修饰所述负载药物的植物外泌体,得到所述靶向毛囊的载药植物外泌体。
优选的,步骤(1)所述纳米级中草药悬浮液的制备方法为将中草药粉末与水混合,均质、离心、重悬,得到纳米级中草药悬浮液。
优选的,所述中草药粉末与水的体积比为1:(8~15);所述均质的压力为5000~10000psi,温度为60~70℃,时间为30~180min;所述纳米级中草药悬浮液的浓度为10~1000mg/ml。
优选的,所述植物外泌体为经过稳定性修饰的植物外泌体;所述稳定性修饰的方法为将植物外泌体依次进行脂肪酸修饰和聚乙二醇修饰。
优选的,步骤(3)中,所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体的体积比为(0.5~2):(0.5~2)。
优选的,步骤(4)中,所述修饰的方法为:制备Wnt3a蛋白溶液,将所述负载药物的植物外泌体与Wnt3a蛋白溶液混合,洗涤、重悬,得到靶向毛囊的载药植物外泌体。
优选的,所述Wnt3a蛋白溶液的浓度为10~100ng/ml;所述负载药物的植物外泌体与Wnt3a蛋白溶液的体积比为(3~6):1;所述靶向毛囊的载药植物外泌体的浓度为5~200mg/ml。
本发明还提供了一种上述制备方法制得的靶向毛囊的载药植物外泌体。
本发明还提供了一种上述靶向毛囊的载药植物外泌体在制备治疗白发药物中的应用。
本发明提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体及其制备方法和应用。本发明将中草药提取物处理成纳米级别,并将其包封在植物外泌体中,构建纳米递送系统;外泌体递送系统利用脂肪酸修饰及PEG交联,提高外泌体递送系统的稳定性;利用特异性毛囊细胞Wnt受体的靶向蛋白Wnt3a对外泌体进行修饰,构建具备毛囊细胞靶向性的外泌体递送系统,解决中草药活性成分透皮吸收、靶向毛囊的难题,提高其利用率,增强细胞活性和酪氨酸酶活性,提高黑色素含量,达到安全、高效治疗白发的目的。
附图说明
图1为实施例1的靶向毛囊的载药植物外泌体的粒径分布图。
图2为实施例2的靶向毛囊的载药植物外泌体的粒径分布图。
图3为实施例3的靶向毛囊的载药植物外泌体的粒径分布图。
图4为实施例4的载药植物外泌体的粒径分布图。
图5为实施例5的载药植物外泌体的粒径分布图。
图6为实施例6的载药植物外泌体的粒径分布图。
图7为实验例2中,各组外泌体样本影响下的酪氨酸酶活性检测结果图。
图8为实验例3中,各组外泌体样本影响24、48、72h时的黑色素瘤细胞活性检测结果图。
图9为实验例4中,各组外泌体样本影响24、48、72h时的黑色素瘤细胞中黑色素含量检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备纳米级中草药悬浮液;
(2)制备植物外泌体;
(3)将所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体混合,得到负载药物的植物外泌体;
(4)用Wnt3a蛋白修饰所述负载药物的植物外泌体,得到所述靶向毛囊的载药植物外泌体。
本发明首先制备纳米级中草药悬浮液。
在本发明中,所述纳米级中草药悬浮液的制备方法优选为将中草药粉末与水混合,均质、离心、重悬,得到纳米级中草药悬浮液。
在本发明中,所述中草药粉末优选包括何首乌提取物、丹参提取物、姜提取物和黑芝麻提取物。
在本发明中,所述何首乌提取物、丹参提取物、姜提取物、黑芝麻提取物的质量比优选为(5~6):(8~12):(5~8):(2~6),进一步优选为5.8:10:6:5。
在本发明中,所述中草药粉末与水的体积比优选为1:(8~15),进一步优选为1:10。
在本发明中,所述均质的压力优选为5000~10000psi,进一步优选为8000psi。
在本发明中,所述均质的温度优选为60~70℃,进一步优选为65℃。
在本发明中,所述均质的时间优选为30~180min,进一步优选为120min。
在本发明中,所述重悬的溶剂优选为双蒸水。
在本发明中,所述纳米级中草药悬浮液的浓度优选为10~1000mg/ml,进一步优选为200mg/ml。
本发明接下来制备植物外泌体。
在本发明中,所述植物外泌体优选为经过稳定性修饰的植物外泌体。
在本发明中,所述稳定性修饰的方法优选为将植物外泌体依次进行脂肪酸修饰和聚乙二醇修饰。
在本发明中,所述植物外泌体优选采用聚合物沉淀法制备得到。
在本发明中,所述脂肪酸修饰的方法优选为为将脂肪酸羧酸与所述植物外泌体溶液、PBS溶液混合,得到脂肪酸修饰的植物外泌体。
在本发明中,所述脂肪酸羧酸的浓度优选为0.1~10mM,进一步优选为5mM。
在本发明中,所述植物外泌体溶液与所述脂肪酸羧酸体积比优选为(8~12):1,进一步优选为10:1。
在本发明中,所述PBS溶液的添加量优选为所述植物外泌体溶液和所述脂肪酸羧酸总体积的0.5~2倍,进一步优选为1倍。
在本发明中,所述混合的温度优选为20~25℃,进一步优选为25℃。
在本发明中,所述混合的时间优选为6~12h,进一步优选为10h。
在本发明中,所述聚乙二醇修饰的方法优选为将聚乙二醇-800与所述脂肪酸修饰的植物外泌体混合,得到植物外泌体交联体系。
在本发明中,所述聚乙二醇-800的原始浓度优选为30~50%,进一步优选为35%。
在本发明中,所述植物外泌体交联体系中聚乙二醇-800的终浓度优选为1.3~2.5%,进一步优选为2%。
在本发明中,所述混合的温度优选为20~25℃,进一步优选为25℃。
在本发明中,所述混合的时间优选为1~3h,进一步优选为2h。
在本发明中,所述植物外泌体交联体系还优选加入海藻糖溶液,经超速离心后,重悬,得到所述经过稳定性修饰的植物外泌体。
在本发明中,所述海藻糖溶液的原浓度优选为20~30%,进一步优选为25%。
在本发明中,所述海藻糖加入植物外泌体交联体系后的终浓度优选为10~15%,进一步优选为12%。
在本发明中,所述超速离心的转速优选为120000~200000g,进一步优选为150000g。
在本发明中,所述超速离心的温度优选为0~4℃,进一步优选为4℃。
在本发明中,所述超速离心的时间优选为0.5~2h,进一步优选为1h。
在本发明中,所述重悬的溶剂优选为浓度25%的海藻糖溶液。
在本发明中,所述重悬后的经过稳定性修饰的植物外泌体的浓度优选为1~30mg/ml,进一步优选为15mg/ml。
本发明将所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体混合,得到负载药物的植物外泌体。
在本发明中,所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体的体积比优选为(0.5~2):(0.5~2),进一步优选为1:1。
在本发明中,所述混合的温度优选为0~4℃,进一步优选为4℃。
在本发明中,所述混合的转速优选为80~150rpm,进一步优选为100rpm。
在本发明中,所述混合的时间优选为18~32h,进一步优选为24h。
本发明用Wnt3a蛋白修饰所述负载药物的植物外泌体,得到所述靶向毛囊的载药植物外泌体。
在本发明中,所述修饰的方法优选为:制备Wnt3a蛋白溶液,将所述负载药物的植物外泌体与Wnt3a蛋白溶液混合,洗涤、重悬,得到靶向毛囊的载药植物外泌体。
在本发明中,所述Wnt3a蛋白溶液的浓度优选为10~100ng/ml,进一步优选为60ng/ml。
在本发明中,所述负载药物的植物外泌体与Wnt3a蛋白溶液的体积比优选为(3~6):1,进一步优选为5:1。
在本发明中,所述混合的温度优选为0~4℃,进一步优选为4℃。
在本发明中,所述混合的转速优选为80~150rpm,进一步优选为100rpm。
在本发明中,所述混合的时间优选为12~16h,进一步优选为16h。
在本发明中,所述洗涤用试剂优选为PBS缓冲液。
在本发明中,所述洗涤时的转速优选为120000~200000g,进一步优选为150000g。
在本发明中,所述洗涤的时间优选为15~40min,进一步优选为30min。
在本发明中,所述重悬的溶剂优选为PBS缓冲液。
在本发明中,所述靶向毛囊的载药植物外泌体的浓度优选为5~200mg/ml,进一步优选为20mg/ml。
本发明还提供了一种上述制备方法制得的靶向毛囊的载药植物外泌体。
本发明还提供了一种上述靶向毛囊的载药植物外泌体在制备治疗白发药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体,具体制备过程如下:
(1)纳米级中草药悬浮液的制备:
将购买的中草药粉末何首乌提取物、丹参提取物、姜提取物、黑芝麻提取物按照质量比5.8:10:6:5混合,得到混合中草药粉末;将混合中草药粉末与双蒸水按照体积比1:10混合,以1000rpm的转速搅拌5min,使中草药分子均匀分散,得到中草药悬浮液。进行高压均质处理前,在中草药悬浮液中加入适量双蒸水,调整中草药悬浮液的pH值处于6.5之间。将调整好pH值的中草药悬浮液倒入高压均质机的处理室中,打开高压均质机的电源,启动高压泵和处理室的主轴,控制处理室的温度为65℃,压力为8000psi,进行高压均质处理。处理120min后,将处理室中的样品收集起来,5000rpm离心10min,弃上清液,用双蒸水重悬,得到浓度为200mg/ml的纳米级中草药悬浮液。
(2)生姜外泌体的制备:
将新鲜生姜清洗后,切成小块,加入等体积的PBS溶液,在冷料理模式下榨汁3min,得到生姜汁;将生姜汁用滤纱和漏斗过滤,得到生姜提取汁;将生姜提取汁以1000g离心15min,去除大颗粒杂质,保留上清液;将上一步的上清液以5000g离心30min,去掉破碎细胞碎片和大的凋亡小体,保留上清液;将上一步的上清液与初始浓度55%的PEG-800溶液混合,使PEG-800的终浓度为10%,充分混合后,在4℃下孵育过夜;过夜后,以50000g在4℃下离心1h,离心结束后倒出锥形管,并排干五分钟,不时敲击以除去过量的PEG,得到沉淀物。
将沉淀物稀释在5mLPBS溶液中,再加入初始浓度55%的PEG-800溶液,这次使PEG-800的终浓度降低到5%;以50000g在4℃下离心1h,得到沉淀物,将得到的沉淀物悬浮在200μL的无颗粒PBS缓冲液中,在室温下摇动20min,得到生姜外泌体溶液。
将生姜外泌体溶液与浓度为5mM的脂肪酸羧酸按照体积比10:1混合,得到混合物;向混合物中加入等体积的PBS溶液作为缓冲剂,于室温下孵育10h,得到脂肪酸修饰的生姜外泌体;将脂肪酸修饰的生姜外泌体与初始浓度为35%的PEG-800溶液混合,使PEG的终浓度为2%,室温孵育2h,得到生姜外泌体交联体系;在交联体系中加入原浓度为25%的海藻糖溶液,使得体系中海藻糖浓度为12%,获得生姜外泌体超速离心体系;将生姜外泌体超速离心体系以150000g,4℃离心1h,共离心2次,弃上清,称量所得沉淀的质量,用2.5ml浓度为25%的海藻糖溶液重悬,得到浓度为15mg/ml的生姜外泌体。
(3)负载药物的植物外泌体的制备:
将纳米级中草药悬浮液与生姜外泌体按照体积比1:1混合,4℃下以100rpm的转速摇晃24h,使两者充分接触,使中草药成分进入外泌体,得到负载药物的植物外泌体。
(4)靶向毛囊的载药植物外泌体的制备:
将购买的Wnt3a蛋白(购自abcam)加入到PBS缓冲液中,制成浓度为60ng/ml的Wnt3a蛋白溶液。将5体积的负载药物的植物外泌体加入到1体积的Wnt3a蛋白溶液中,4℃下以100rpm的转速摇晃过夜,得到Wnt3a修饰的外泌体。将Wnt3a修饰的外泌体在4℃下,以150000g离心30min,收集沉淀,用PBS缓冲液重悬后,重复离心一次,收集沉淀称量,用PBS缓冲液重悬后,得到浓度为20mg/ml的靶向毛囊的载药植物外泌体。
实施例2
本实施例提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体,具体制备过程如下:
(1)纳米级中草药悬浮液的制备:
将购买的中草药粉末何首乌提取物、丹参提取物、姜提取物、黑芝麻提取物按照质量比5.8:10:6:5混合,得到混合中草药粉末;将混合中草药粉末与双蒸水按照体积比1:10混合,以1000rpm的转速搅拌5min,使中草药分子均匀分散,得到中草药悬浮液。进行高压均质处理前,在中草药悬浮液中加入适量双蒸水,调整中草药悬浮液的pH值处于7.0之间。将调整好pH值的中草药悬浮液倒入高压均质机的处理室中,打开高压均质机的电源,启动高压泵和处理室的主轴,控制处理室的温度为65℃,压力为8000psi,进行高压均质处理。处理120min后,将处理室中的样品收集起来,5000rpm离心10min,弃上清液,用双蒸水重悬,得到浓度为200mg/ml的纳米级中草药悬浮液。
(2)银杏叶外泌体的制备:
将新鲜银杏叶清洗后,切成小块,加入等体积的PBS溶液,在冷料理模式下榨汁3min,得到银杏叶汁;将银杏叶汁用滤纱和漏斗过滤,得到银杏叶提取汁;将银杏叶提取汁以1000g离心15min,去除大颗粒杂质,保留上清液;将上一步的上清液以5000g离心30min,去掉破碎细胞碎片和大的凋亡小体,保留上清液;将上一步的上清液与初始浓度55%的PEG-800溶液混合,使PEG-800的终浓度为10%,充分混合后,在4℃下孵育过夜;过夜后,以50000g在4℃下离心1h,离心结束后倒出锥形管,并排干五分钟,不时敲击以除去过量的PEG,得到沉淀物。
将沉淀物稀释在5mLPBS溶液中,再加入初始浓度55%的PEG-800溶液,这次使PEG-800的终浓度降低到5%;以50000g在4℃下离心1h,得到沉淀物,将得到的沉淀物悬浮在200μL的无颗粒PBS缓冲液中,在室温下摇动20min,得到银杏叶外泌体溶液。
将银杏叶外泌体溶液与浓度为5mM的脂肪酸羧酸按照体积比10:1混合,得到混合物;向混合物中加入等体积的PBS溶液作为缓冲剂,于室温下孵育10h,得到脂肪酸修饰的银杏叶外泌体;将脂肪酸修饰的银杏叶外泌体与初始浓度为35%的PEG-800溶液混合,使PEG的终浓度为2%,室温孵育2h,得到银杏叶外泌体交联体系;在交联体系中加入原浓度为25%的海藻糖溶液,使得体系中海藻糖浓度为12%,获得银杏叶外泌体超速离心体系;将银杏叶外泌体超速离心体系以150000g,4℃离心1h,共离心2次,弃上清,称量所得沉淀的质量,用1.8ml浓度为25%的海藻糖溶液重悬,得到浓度为15mg/ml的银杏叶外泌体。
(3)负载药物的植物外泌体的制备:
将纳米级中草药悬浮液与银杏叶外泌体按照体积比1:1混合,4℃下以100rpm的转速摇晃24h,使两者充分接触,使中草药成分进入外泌体,得到负载药物的植物外泌体。
(4)靶向毛囊的载药植物外泌体的制备:
将购买的Wnt3a蛋白(购自abcam)加入到PBS缓冲液中,制成浓度为60ng/ml的Wnt3a蛋白溶液。将5体积的负载药物的植物外泌体加入到1体积的Wnt3a蛋白溶液中,4℃下以100rpm的转速摇晃过夜,得到Wnt3a修饰的外泌体。将Wnt3a修饰的外泌体在4℃下,以150000g离心30min,收集沉淀,用PBS缓冲液重悬后,重复离心一次,收集沉淀称量,用PBS缓冲液重悬后,得到浓度为20mg/ml的靶向毛囊的载药植物外泌体。
实施例3
本实施例提供了一种靶向毛囊的载药植物外泌体,具体制备过程如下:
(1)纳米级中草药悬浮液的制备:
将购买的中草药粉末何首乌提取物、丹参提取物、姜提取物、黑芝麻提取物按照质量比5.8:10:6:5混合,得到混合中草药粉末;将混合中草药粉末与双蒸水按照体积比1:10混合,以1000rpm的转速搅拌5min,使中草药分子均匀分散,得到中草药悬浮液。进行高压均质处理前,在中草药悬浮液中加入适量双蒸水,调整中草药悬浮液的pH值处于7.0之间。将调整好pH值的中草药悬浮液倒入高压均质机的处理室中,打开高压均质机的电源,启动高压泵和处理室的主轴,控制处理室的温度为65℃,压力为8000psi,进行高压均质处理。处理120min后,将处理室中的样品收集起来,5000rpm离心10min,弃上清液,用双蒸水重悬,得到浓度为200mg/ml的纳米级中草药悬浮液。
(2)大蒜外泌体的制备:
将新鲜大蒜清洗后,切成小块,加入等体积的PBS溶液,在冷料理模式下榨汁3min,得到大蒜汁;将大蒜汁用滤纱和漏斗过滤,得到大蒜提取汁;将大蒜提取汁以1000g离心15min,去除大颗粒杂质,保留上清液;将上一步的上清液以5000g离心30min,去掉破碎细胞碎片和大的凋亡小体,保留上清液;将上一步的上清液与初始浓度55%的PEG-800溶液混合,使PEG-800的终浓度为10%,充分混合后,在4℃下孵育过夜;过夜后,以50000g在4℃下离心1h,离心结束后倒出锥形管,并排干五分钟,不时敲击以除去过量的PEG,得到沉淀物。
将沉淀物稀释在5mLPBS溶液中,再加入初始浓度55%的PEG-800溶液,这次使PEG-800的终浓度降低到5%;以50000g在4℃下离心1h,得到沉淀物,将得到的沉淀物悬浮在200μL的无颗粒PBS缓冲液中,在室温下摇动20min,得到大蒜外泌体溶液。
将大蒜外泌体溶液与浓度为5mM的脂肪酸羧酸按照体积比10:1混合,得到混合物;向混合物中加入等体积的PBS溶液作为缓冲剂,于室温下孵育10h,得到脂肪酸修饰的大蒜外泌体;将脂肪酸修饰的大蒜外泌体与初始浓度为35%的PEG-800溶液混合,使PEG的终浓度为2%,室温孵育2h,得到大蒜外泌体交联体系;在交联体系中加入原浓度为25%的海藻糖溶液,使得体系中海藻糖浓度为12%,获得大蒜外泌体超速离心体系;将大蒜外泌体超速离心体系以150000g,4℃离心1h,共离心2次,弃上清,称量所得沉淀的质量,用3ml浓度为25%的海藻糖溶液重悬,得到浓度为15mg/ml的大蒜外泌体。
(3)负载药物的植物外泌体的制备:
将纳米级中草药悬浮液与大蒜外泌体按照体积比1:1混合,4℃下以100rpm的转速摇晃24h,使两者充分接触,使中草药成分进入外泌体,得到负载药物的植物外泌体。
(4)靶向毛囊的载药植物外泌体的制备:
将购买的Wnt3a蛋白(购自abcam)加入到PBS缓冲液中,制成浓度为60ng/ml的Wnt3a蛋白溶液。将5体积的负载药物的植物外泌体加入到1体积的Wnt3a蛋白溶液中,4℃下以100rpm的转速摇晃过夜,得到Wnt3a修饰的外泌体。将Wnt3a修饰的外泌体在4℃下,以150000g离心30min,收集沉淀,用PBS缓冲液重悬后,重复离心一次,收集沉淀称量,用PBS缓冲液重悬后,得到浓度为20mg/ml的靶向毛囊的载药植物外泌体。
实施例4
本实施例提供了一种不具有靶向作用的载药植物外泌体,与实施例1的区别在于,省略步骤(4),得到载药植物外泌体。
实施例5
本实施例提供了一种不具有靶向作用的载药植物外泌体,与实施例2的区别在于,省略步骤(4),得到载药植物外泌体。
实施例6
本实施例提供了一种不具有靶向作用的载药植物外泌体,与实施例3的区别在于,省略步骤(4),得到载药植物外泌体。
实验例1
为了测定实施例1~6所制备的载药植物外泌体递送系统的粒子大小,使用Malvern ZetasizerNano ZS90纳米粒径电位分析仪进行分析。具体步骤如下:
分别准备实施例1~3的靶向毛囊的载药植物外泌体和实施例4~6的载药植物外泌体样本各15μl,滴入马尔文微量样品池中,放入仪器,进行粒径的测定,每个样本测定五次取平均值,制作粒径分布图。实施例1~6的样本粒径分布图如图1~6所示。
从图1~6可以看出,实施例1~3的靶向毛囊的载药植物外泌体和实施例4~6的载药植物外泌体的平均粒径介于50nm到300nm之间。植物外泌体的直径一般在20nm到300nm之间,其粒径大小因来源和功能而异。作为药物递送系统,六组样本的平均粒径介于50nm到300nm之间,意味着其利于透皮吸收,更容易通过皮肤屏障到达靶点,利于载药植物外泌体递送系统在药物输送方面的应用。而使用Wnt3a蛋白修饰载药植物外泌体并不会对外泌体递送系统的粒径产生影响。
实验例2
酪氨酸酶是一种广泛分布于不同生物体中的含有多个铜离子的生物酶,在黑色素的生成和酶促褐变过程中发挥着重要作用,为了测定载药植物外泌体递送系统对酪氨酸酶活性的影响,使用上海通蔚人酪氨酸酶(TyR)试剂盒TW9912ELISA试剂盒检测酪氨酸酶的活性。具体步骤如下:
将实施例1~3作为实验组,将未经植物外泌体包裹的纳米级中草药悬浮液(即实施例1步骤(1)制得的纳米级中草药悬浮液)作为对照组。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl,待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样时,将样品加于标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀;用封板膜封板后置37℃温育30分钟;将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用;小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干;每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外;重复上一步温育,洗涤;每孔先加入显色剂A 50μl,再加入显色剂B 50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟;每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色);以空白空调零,450nm波长依序测量各组的吸光度(OD值),记录OD值。
由于酪氨酸酶能够催化L-多巴生成多巴色素,产物在450~475nm处具有特征吸收峰,通过吸光值变化即可表征酪氨酸酶的活性。
各组酪氨酸酶活性检测结果如图7所示。可以看出,中草药悬浮液可激活酪氨酸酶对L-多巴的催化作用,且实验各组的经植物外泌体包裹的中草药悬浮液对酪氨酸酶的激活作用优于对照组。
实验例3
B16-F10是小鼠皮肤黑色素瘤细胞,可以用于进行分泌黑色素等相关实验。本发明的载药植物外泌体主要靶向作用于体内的黑色素瘤细胞,为了检测载药植物外泌体递送系统的细胞毒性,本发明选择B16-F10进行后续的细胞活性检测。采用Cell Counting Kit-8CCK-8试剂盒(碧云天C0038)用于快速灵敏地检测细胞活性,具体实验步骤如下:
将实施例1~3作为实验组,将未经植物外泌体包裹的纳米级中草药悬浮液(即实施例1步骤(1)制得的纳米级中草药悬浮液)作为对照组,并设置只含B16-F10为空白组(Blank);将B16-F10以含10%FBS的高糖DMEM培养基(含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)培养至近融合状态时,以0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化,离心,以上述培养基重悬细胞,调整细胞密度为1×105/ml,接种96孔板,每孔1mL。
将96孔板放培养箱(37℃、5%CO2)中预培养,取出孔板,向培养板分别加1ml上述待测样品,空白组添加1ml蒸馏水。在培养箱孵育24h、48h和72h。培养至24h、48h、72h时收集孔板,每孔加10μl的CCK-8溶液,放入37℃孵箱孵育4h,弃上清,将培养板置于培养箱内孵育4小时;置酶标仪450nm波长下测量各孔吸光度值,记录OD值。
由于CCK-8法检测细胞活性,在电子耦合试剂存在的情况下,WST-8(化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物,其颜色的深浅即OD值大小与细胞活性成正比,与细胞毒性成反比,使用酶标仪在450nm波长处测定OD值,可以间接反映细胞活性。
细胞活性检测结果如图8所示,可以看出,与空白组对比,对照组和实验组对B16-F10活性无不良影响,反而细胞活性稍高于空白组,意味着载药植物外泌体递送系统对细胞毒性较小,生物安全性高。
实验例4
Wnt3a是Wnt信号通路中的一个配体,它与毛囊细胞表面的Frizzled受体(FZD)结合后,激活Wnt信号通路,研究表明,Wnt信号通路对于黑色素细胞的增殖分化具有调节作用。为了验证载药植物外泌体对毛囊细胞的靶向性,使用多功能酶标仪对细胞中黑色素含量进行分析。具体步骤如下:
将实施例1~3作为实验组,实施例4~6作为对照组,并设置只含B16-F10的空白组(Blank)。将B16-F10以含10%FBS的高糖DMEM培养基(含100U/ml青霉素100μg/ml链霉素)培养至近融合状态时,以0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化,离心,以上述培养基重悬细胞,调整细胞密度为1×105/ml;取B16-F10接种于12孔板中,每孔1mL,于培养箱(37℃、5%CO2)培养24h。
取出12孔板,吸去培养基,对实验组和对照组对应的孔中加入含待测样品的培养基,每孔2000μl,继续培养24h、48h、72h后,吸去培养基,用PBS洗涤,胰酶消化,终止消化,收集消化液;将各孔中消化液分别转入1.5ml EP管,离心,去上清,立即以酶标仪测定每孔490nm吸光值,记录OD值。
由于黑色素在490nm处具有特征吸收峰,吸光值间接反映了黑色素含量。
各组黑色素含量检测结果如图9所示。可以看出,与空白组相比,对照组和实验组的OD值明显增高;且实验组与对照组相比,实验组的OD值高于对照组,意味着实验组的黑色素生成、分泌量高于对照组,即经过Wnt3a靶向修饰的载药植物外泌体对黑色素的促生作用优于未经靶向修饰的载药植物外泌体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种靶向毛囊的载药植物外泌体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)制备纳米级中草药悬浮液;
所述纳米级中草药悬浮液的制备方法为将中草药粉末与水混合,均质,离心,重悬,得到纳米级中草药悬浮液;
所述中草药粉末与水的体积比为1:(8~15);所述均质的压力为5000~10000psi,温度为60~70℃,时间为30~180min;所述纳米级中草药悬浮液的浓度为10~1000mg/ml;
(2)制备植物外泌体;
所述植物外泌体为经过稳定性修饰的植物外泌体;所述稳定性修饰的方法为将植物外泌体依次进行脂肪酸修饰和聚乙二醇修饰;
所述脂肪酸修饰的方法为将脂肪酸羧酸与所述植物外泌体溶液和PBS溶液混合,得到脂肪酸修饰的植物外泌体;所述脂肪酸羧酸的浓度为0.1~10mM,所述植物外泌体溶液与所述脂肪酸羧酸体积比为(8~12):1;所述PBS溶液的添加量为所述植物外泌体溶液和所述脂肪酸羧酸总体积的0.5~2倍;
所述聚乙二醇修饰的方法为将聚乙二醇-800与所述脂肪酸修饰的植物外泌体混合,得到植物外泌体交联体系;所述聚乙二醇-800的原始浓度为30~50%,所述植物外泌体交联体系中聚乙二醇-800的终浓度为1.3~2.5%;
所述植物外泌体交联体系还加入海藻糖溶液,经超速离心后,重悬,得到所述经过稳定性修饰的植物外泌体;所述海藻糖溶液的原始浓度为20~30%;所述海藻糖加入植物外泌体交联体系后的终浓度为10~15%;
(3)将所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体混合,得到负载药物的植物外泌体;
(4)用Wnt3a蛋白修饰所述负载药物的植物外泌体,得到所述靶向毛囊的载药植物外泌体;
所述用Wnt3a蛋白修饰的方法为:制备Wnt3a蛋白溶液,将所述负载药物的植物外泌体与Wnt3a蛋白溶液混合,洗涤,重悬,得到靶向毛囊的载药植物外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述纳米级中草药悬浮液与所述植物外泌体的体积比为(0.5~2):(0.5~2)。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述Wnt3a蛋白溶液的浓度为10~100ng/ml;所述负载药物的植物外泌体与Wnt3a蛋白溶液的体积比为(3~6):1;所述靶向毛囊的载药植物外泌体的浓度为5~200mg/ml。
4.一种权利要求1~3任一项所述制备方法制得的靶向毛囊的载药植物外泌体。
5.一种权利要求4所述的靶向毛囊的载药植物外泌体在制备治疗白发药物中的应用。
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中药纳米混悬剂制备及固体化研究进展;廖卫波等;《中药材》;20181208;第41卷(第11期);摘要,第1.1节 * |
外泌体作为中药载体的研究进展;袁鹏等;《药学学报》;20171112;第52卷(第11期);第1667-1672页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN116942847A (zh) | 2023-10-27 |
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