CN116942665A - Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，本发明的Kappa阿片受体拮抗剂为BTRX‑335140，首次发现该化合物可显著降低SARS‑COV‑2的感染效率，抑制病毒入侵，对2019‑nCoV、HCoV‑229E、HCoV‑OC43、SARS‑CoV和MERS‑CoV中的至少一种的冠状病毒有显著的抑制效果，适用于在治疗冠状病毒及并发症的药物制备中，包括抑制发热、咳嗽和咽痛的单纯性感染、肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，具体涉及Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由严重急性呼吸综合征冠状病毒新型冠状病毒(世界卫生组织定名为SARS-CoV-2)为冠状病毒疫情的病原体，SARS-CoV-2引起的肺炎主要以发热、乏力和干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。基于病毒复制周期中的酶和蛋白都是抗冠状病毒药物潜在的作用靶点，目前对于抗冠状病毒药物的研究热点主要集中在S蛋白、RdRp、3CLpro、PLpro 等。刺突（S）蛋白属于病毒的结构蛋白，成熟的S蛋白为稳定的三聚体，具有受体及膜融合活性，S1和S2之间存在蛋白酶的裂解位点，S蛋白的裂解活化是病毒入侵宿主细胞的关键。S蛋白上的受体结合域（receptor-bindingdomain，RBD）与细胞表面受体结合，使病毒黏附于细胞表面，不同的冠状病毒其受体不同，亲和力也有区别，MERS-CoV以人细胞表面蛋白二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）作为进入受体，而SARS-CoV-2和SARS-CoV以血管紧张素转化酶II（angiotensin-converting 2，ACE2）作为受体，由于SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2 受体亲和力比SARS-CoV高20倍，导致该病毒在人类中的传播速度更快，且SARS-CoV-2具有一定突变性、潜在宿主多、潜伏期长等特点，另外很多特性尚待阐明，因此，目前迫切需要尽快找到更多安全有效的抗新型冠状病毒的候选药物。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明提供了一种Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用。
第一方面，本发明提供了一种Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用。
进一步地，所述Kappa阿片受体拮抗剂为BTRX-335140，其结构如式（I）所示：
（I）。
进一步地，所述Kappa阿片受体拮抗剂包括化合物BTRX-335140几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。
进一步地，所述药物中还包含药学上可接受的辅料。
进一步地，所述药物的给药途径括但不局限于口服、注射或呼吸道吸入。
进一步地，所述药物的剂型括但不局限于混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、
乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、气雾剂或滴剂。
进一步地，所述冠状病毒包括2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV和MERS-CoV中的至少一种。
进一步地，所述药物包括但不局限于抑制发热、咳嗽和咽痛的单纯性感染、肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（1）BTRX-335140是一种选择性的、具有口服活性的κ opioid receptor (KOR) 拮抗剂，
对κOR、μOR、δOR具有拮抗活性，本发明发现了BTRX-335140在抗冠状病毒中的活性，可制备用于冠状病毒的治疗药物。
（2）Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140有效的抑制体外SARS-COV-2感染，当给药
浓度低于10μM，均可显著降低SARS-COV-2在293T ACE2过表达细胞株和H1299ACE2过表达细胞株中的感染率，且对细胞生长无毒性抑制，其中抑制293T细胞感SARS-COV-2假病毒的IC50为2.994μM，抑制H1299细胞感染SARS-COV-2假病毒的IC50为3.214μM，具有显著抑制SARS-COV-2冠状病毒活性。
（3）Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140在体内具有显著抑制SARS-COV-2病毒活性效果。
附图说明
图1为Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140的分子结构式。
图2为BTRX-335140对293T ACE2过表达细胞株生长的影响。
图3为BTRX-335140对H1299 ACE2过表达细胞株生长的影响。
图4为BTRX-335140对SARS-COV-2假病毒进入293T ACE2过表达细胞的感染效率。
图5为BTRX-335140对SARS-COV-2假病毒进入293T ACE2过表达细胞的抑制率。
图6为BTRX-335140对SARS-COV-2假病毒进入H1299 ACE2过表达细胞的感染效率。
图7为BTRX-335140对SARS-COV-2假病毒进入H1299 ACE2过表达细胞的抑制率。
图8为对照组小鼠感染SARS-COV-2假病毒的荧光成像。
图9为BTRX-335140体内抑制SARS-COV-2假病毒的荧光成像。
图10为BTRX-335140体内抑制SARS-COV-2假病毒的柱状图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1 BTRX-335140对细胞生长的影响
实验对象：293T ACE2过表达细胞株，H1299 ACE2过表达细胞株。
实验药物：Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140，化合物溶剂DMSO。
实验方法：
第一天下午铺板：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入90 μL，293TACE2和H1299 ACE2分别铺1×104和6×103个细胞每孔。
第二天早上加药：每孔加入10 μL浓度梯度的药物，每个药物浓度设置3个复孔，置于5% CO2，37℃培养箱孵育。
加药48h后收板：先倒置显微镜下肉眼观察，接着每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），孵育4 h后终止反应，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
OD值检测：在酶标仪波长490 nm处检测各孔吸光值，计算药物抑制率，计算方法如式（1）所示：
（1）
本实验设不含细胞的培养基作为空白对照组，每孔加入和化合物相同稀释比的DMSO溶液作为阴性对照组，还有含化合物BTRX-335140的实验组。
实验结果：按上述第一部分的试验方法得到的结果见附图2~3，从结果上可知，药物对细胞没有毒性。
实施例2 BTRX-335140对阻断SARS-COV-2假病毒进入细胞试验
第一部分、试验方法
实验对象：293T ACE2过表达细胞株，H1299 ACE2过表达细胞株。
实验材料：SARS-CoV-2_S（D614G）蛋白假慢病毒（病毒内表达绿色荧光蛋白GFP及荧光素酶Luciferase），购买自云舟生物科技（广州）股份有限公司。
Polybrene（5 mg/mL，200 μL），购买自云舟生物科技（广州）股份有限公司。
实验药物：Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140
实验方法：
SARS-COV-2假病毒转导前1天（第0天），将细胞接种到新的无菌黑色不透明96孔板中，293T ACE2和H1299 ACE2过表达细胞每孔分别接种1×104和6×103个细胞，100 μL完全培养基(DMEM+10% FBS)每孔，次日感染时细胞密度50%左右为佳，放置于37℃、5% CO2的二氧化碳培养箱中培养过夜；
SARS-COV-2 假病毒转导当天（第1天），首先在冰上融解冻结的病毒液，轻柔吹打几下，混匀融解后的病毒颗粒，再取10 mL的病毒液加至10 mL含有7.5 μg/mL的Polybrene的新鲜的完培中，使病毒液和完全培养基的体积比为1：1，轻柔混匀，然后均分成以下10组（对照组除外）；
实验共设置对照组（Control），假病毒液组（Pseudovirus），实验组【假病毒液+候选药物（BTRX-335140的工作浓度设置为8 μM、4 μM、2 μM、1 μM、0.5 μM、0.25 μM），每组配制略大于4个复孔的量，配好后冰上孵育30 min, 然后吸出原有培养基，向细胞中加入完全培养基，得到上述含假病毒颗粒的完全培养基（最终使得对照组每孔加入60 μL新鲜的培养基，各假病毒组和实验组分别加入将上述含病毒颗粒的培养基60 μL），最后轻柔地摇动培养板以使病毒液能覆盖每一处细胞，然后放置于37℃、5% CO2的二氧化碳培养箱中培养过夜；
SARS-COV-2假病毒转导第2天，病毒转染24 h后换液，换成含1%双抗的完全培养基，每孔100 μL。
SARS-COV-2假病毒转导第4天，即病毒转染72h后吸掉培养基，每孔加入30 μL裂解液，震荡10 min，然后避光加入20 μL荧光素酶反应底物，再酶标仪检测荧光素酶活性，最后计算感染效率和药物抑制率，其中感染率的计算方法如式（2）所示，药物抑制率的计算方法如式（3）所示；
感染率%=实验组吸光值 / 假病毒组吸光值 × 100%（2）
药物抑制率%=100%-感染率%（3）
第二部分、试验结果
按上述第一部分的试验方法，获得的试验结果如表2~3和附图4~7所示，具体如下：
表2
表3
由表2~3和附图4~7结果看出，Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140给药后，对阻断SARS-COV-2假病毒进入细胞的效果是明显的，其中对抑制293T细胞和H1299细胞感染SARS-COV-2假病毒的活性随着给药浓度的增加而增加，在0.25μM微量给药即出现抑制活性，其中抑制293T细胞感染SARS-COV-2假病毒的IC50为2.994μM，抑制H1299细胞感染SARS-COV-2假病毒的IC50为3.214μM，实验结果具有极显著性差异，抑制活性均显著。
实施例3 BTRX-335140体内抑制SARS-COV-2假病毒试验
第一部分、试验方法
实验对象：C57BL/6J (B6J)小鼠，雌性，6-8周龄，于SPF饲养室饲养5天，同时做隔离观察。
实验材料：
腺相关病毒(AAV)：从派真生物购入AAV9[ssAAV.CAG.human ACE2.WPRE.SV40Pa]，总量5E+12GC，滴度≥1E+13GC/mL，100μL/管。
SARS-CoV-2假病毒：从北京博奥龙购入FNV-SARS-CoV-2-S(BA.4)(Omicron)假病毒，滴度＞107TU/mL，200μL/管。
实验药物：Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140。
给药方式为鼻腔灌注：小鼠用吸入异氟烷进行麻醉，固定在手中，用大拇指的指尖顶住下巴，拇指关节要是向上弯折，目的是把小鼠口式呼吸彻底关闭掉，用100μL移液器吸取50μL液体，放在小鼠鼻孔上，小鼠通过鼻式呼吸把液体吸进鼻腔。
病毒感染及给药：对实验小鼠采用AAV9（滴度为1011GC/mL）感染5天后，采用鼻腔灌注浓度为2.5mg/kg的药物30μL，给药1h后进行SARS-CoV-2假病毒感染，对照组不给药，进行AAV9感染和SARS-CoV-2假病毒感染；
活体成像监测：在病毒感染及给药后第5天鼻腔灌注D-荧光素（钾盐）浓度10mg/mL，20μL，然后吸入异氟烷麻醉，10分钟之后使用IVScope8500小动物活体成像系统检测荧光素酶信号。
第二部分、试验结果
按上述第一部分的试验方法得到的结果见附图8~10，对比对照组和给药组的小鼠体内感染SARS-CoV-2假病毒的荧光成像（具体见图8、图9中的方框内所示），发现给药Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140后，小鼠体内的SARS-CoV-2假病毒的荧光信号显著下降，表明Kappa阿片受体拮抗剂BTRX-335140能显著抑制体内SARS-COV-2假病毒的感染。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1. Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述Kappa阿片受体拮抗剂为BTRX-335140，其结构如式（I）所示：
（I）。
2.根据权利要求1所述的Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述药物还包括化合物BTRX-335140几何异构体或其药学上可接受的盐和/或其溶剂化物和/或其水合物。
3.根据权利要求1或2所述的Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求1或2所述的Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为口服、注射或呼吸道吸入。
5.根据权利要求1或2所述的Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、气雾剂或滴剂。
6.根据权利要求1或2所述的Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述冠状病毒包括2019-nCoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV和MERS-CoV中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的Kappa阿片受体拮抗剂在制备抗冠状病毒药物中的应用，其特征在于，所述药物为抑制发热、咳嗽和咽痛的单纯性感染、肺炎、急性呼吸道感染、严重急性呼吸道感染、低氧性呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症和脓毒性休克。
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