CN116926097A - 小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用 - Google Patents

小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116926097A
CN116926097A CN202310685601.XA CN202310685601A CN116926097A CN 116926097 A CN116926097 A CN 116926097A CN 202310685601 A CN202310685601 A CN 202310685601A CN 116926097 A CN116926097 A CN 116926097A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ibpa
heat shock
shock protein
small molecule
expression vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310685601.XA
Other languages
English (en)
Inventor
亓正良
刘新利
叶亦珂
杨飞越
韩郁杰
董蝶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu University of Technology
Original Assignee
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qilu University of Technology filed Critical Qilu University of Technology
Priority to CN202310685601.XA priority Critical patent/CN116926097A/zh
Publication of CN116926097A publication Critical patent/CN116926097A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用，属于基因工程技术领域，是将类球红细菌ATCC 17023中的小分子热休克蛋白编码基因ibpA克隆并构建表达载体，将表达载体转入宿主菌中，使得宿主菌过表达小分子热休克蛋白IbpA，所述小分子热休克蛋白编码基因ibpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过在宿主菌中过表达小分子热休克蛋白IbpA，所获得的重组菌在不同胁迫条件下的抗性大大增加，能够提高宿主菌在多种逆境下的生存能力。

Description

小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用。
背景技术
在微生物的培养过程中，只有在适宜的外界条件和适当的营养物质下，微生物才能正常生长，如果外界条件不适宜，微生物会受到底物不足、冷热、酸碱、渗透压等胁迫因素的影响，这些因素会抑制微生物的生长甚至引起其死亡，并且抑制或减少其代谢产物的生成；酸胁迫、碱胁迫、高温胁迫、氧胁迫等是常见的微生物细胞所面临的胁迫，提高微生物的胁迫抗性，将有利于微生物在逆境环境下生存，维持细胞的正常生命活动；另外，提高工业菌株的高温胁迫抗性，可有效降低冷却水的使用，降低能耗及生产成本，同时可以有效降低染菌几率；为提高菌株耐热性，传统的育种技术如高温驯化、自然选育、诱变育种等方法都曾发挥重要作用，但存在效率低、无方向性等缺点。
生物耐热性的获得与热激蛋白的合成有着密切的正相关性。热休克蛋白是在所有生物如古生菌、细菌和真核生物中发现的超家族，它可以作为分子伴侣，结合部分变性的蛋白质，协助变性蛋白质的降解，并且还可以阻止由各种环境压力诱导引起的蛋白质不可逆的聚集，帮助细胞适应外界压力环境，热休克蛋白的过表达可以保护微生物免受外界高温压力对细胞的损伤；目前，关于微生物小分子热休克蛋白的功能与应用研究才刚起步，这些小分子热休克蛋白是重要的生物资源，未来在食品工业、环境保护、医疗健康等领域都有重要的应用价值。
类球红细菌是一种不产氧光合细菌，在食品、医药、环保、农业等领域都有应用，具有较高的研究和应用价值。在食品医药领域，类球红细菌可用于生产辅酶Q10、合成番茄红素、类胡萝卜素等；在环保领域，类球红细菌具有较强的氮、磷代谢能力，可将其用于降解有机磷农药和富集重金属；在农业领域，类球红细菌可作为叶面肥使用，利用其合成5-氨基乙酰丙酸促进植物成熟。
为了增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞正常的代谢功能，提高生物在逆境下的生存能力，本发明拟利用转基因技术将类球红细菌ATCC 17023中的小分子热休克蛋白编码基因ibpA转入菌株中进行过表达，以提高类球红细菌以及其它宿主菌对不利环境的耐受能力。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用，将小分子热休克蛋白编码基因ibpA克隆并构建重组表达载体，将重组表达载体转入宿主菌中过表达小分子热休克蛋白IbpA，以提高宿主菌在不同胁迫条件下的抗性。
本发明技术方案如下：
一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用，所述小分子热休克蛋白IbpA来源于类球红细菌ATCC 17023，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述小分子热休克蛋白IbpA的编码基因ibpA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
优选的，所述宿主菌为类球红细菌或大肠杆菌。
优选的，一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用，应用方法是将类球红细菌ATCC 17023中的小分子热休克蛋白编码基因ibpA克隆并构建重组表达载体，将重组表达载体转入宿主菌中，使得宿主菌过表达小分子热休克蛋白IbpA。
优选的，一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用，应用方法具体包括如下步骤：
S1，从类球红细菌ATCC 17023中提取出总DNA；
S2，以提取的总DNA为模板，设计引物，通过PCR扩增得到小分子热休克蛋白的编码基因ibpA，即克隆产物；所述引物为：
上游引物：5’-CGGGGTACCATGCGTAGCTATGATTTCTCGCCGC-3’，SEQ ID NO.3；
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGGCCTCGACCGGCTCCTTCAC-3’，SEQ ID NO.4；
S3，将克隆产物酶切后插入酶切后的质粒载体中构建重组表达载体；
S4，采用接合转移的方式将重组表达载体转化到宿主菌中，过表达小分子热休克蛋白IbpA，提高宿主菌环境耐受性。
优选的，所述S2中的PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸2min，重复35个循环；72℃延伸5min，降温至4℃。
优选的，所述S3中的酶切方法为利用限制性内切酶Kpn I、Hind III酶切。
优选的，所述S3中的质粒载体为pBBR1MCS-2。
优选的，所述S4中重组表达载体的转化方法为：
(1)制备宿主菌菌液和含有重组表达载体的供体菌菌液，洗涤菌体后重悬，得宿主菌重悬菌液和供体菌重悬菌液；
(2)将宿主菌重悬菌液和供体菌重悬菌液按照菌浓比1:3～7混合，将混合后的菌液点种于相应固体培养基上放置的0.22μm无菌滤膜上，静置培养使其发生接合转移，筛选获得含有重组表达载体的宿主菌。
一种重组表达载体，含有上述编码基因ibpA。
一种重组菌，含有上述重组表达载体或上述编码基因ibpA。
优选的，所述重组菌的宿主菌为类球红细菌或大肠杆菌。
本发明在前期研究中发现，类球红细菌ATCC 17023在受到高温热激处理(75℃热激10min)后，菌体内的小分子热休克蛋白编码基因ibpA表达水平显著上调，使得类球红细菌ATCC 17023菌体对高温有了抗性，并且小分子热休克蛋白IbpA的表达量越高，差异表达越明显，类球红细菌ATCC 17023抵抗热胁迫的能力越强；进一步研究发现，类球红细菌ATCC17023中的小分子热休克蛋白IbpA可能会增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞正常的代谢功能，与生物在逆境下的生存能力关系密切。因此，本发明利用转基因技术将类球红细菌ATCC 17023中小分子热休克蛋白的编码基因ibpA在宿主菌中进行过表达，以提高宿主菌的抗热胁迫能力和对其它不利环境的耐受性。
本发明的有益效果：本发明通过在宿主菌中过表达小分子热休克蛋白IbpA，所获得的重组菌在高温、高酸、高碱、高盐、高浓度金属离子和高浓度糠醛等胁迫条件下的抗性大大增加，能够提高宿主菌在多种逆境下的生存能力。
附图说明
图1为IbpA重组表达载体的构建示意图；
图2为IbpA过表达工程菌的筛选过程，其中：(a)图为ibpA基因扩增电泳图；(b)图为pBBR1MCS-2质粒酶切电泳图；(c)图为重组大肠杆菌PCR扩增电泳图；
图3为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高温条件下(85℃热激10min)的存活率；
图4为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高酸条件下(pH 5.0)的存活率；
图5为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高碱条件下(pH 11.0)的存活率；
图6为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高盐条件下(盐度5％)的存活率；
图7为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度Cr6+条件下(350mg/L)的存活率；
图8为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度Pb2+条件下(650mg/L)的存活率；
图9为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度Cd2+条件下(350mg/L)的存活率；
图10为类球红细菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度糠醛条件下(40g/L)的存活率；
图11为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高温条件下(85℃热激10min)的存活率；
图12为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高酸条件下(pH 5.0)的存活率；
图13为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高碱条件下(pH 11.0)的存活率；
图14为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高盐条件下(盐度5％)的存活率；
图15为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度Cr6+条件下(450mg/L)的存活率；
图16为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度Pb2+条件下(350mg/L)的存活率；
图17为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度Cd2+条件下(200mg/L)的存活率；
图18为大肠杆菌野生菌和IbpA过表达工程菌在高浓度糠醛条件下(6g/L)的存活率；
图19为类球红细菌来源的IbpA与大肠杆菌来源的IbpA在类球红细菌中过表达后在高温条件下(85℃热激10min)的存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明：
实施例1：
小分子热休克蛋白编码基因ibpA的克隆与重组表达载体的构建
S1，利用基因组DNA提取试剂盒从类球红细菌ATCC 17023中提取出总DNA；
S2，以提取的总DNA为模版，设计引物，通过PCR扩增得到小分子热休克蛋白编码基因ibpA，即克隆产物，所得克隆产物的琼脂糖凝胶电泳图如图2中的(a)图所示；PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸2min，重复35个循环；72℃延伸5min，降温至4℃；
所用引物为：
上游引物：5’-CGGGGTACCATGCGTAGCTATGATTTCTCGCCGC-3’，SEQ ID NO.3；
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGGCCTCGACCGGCTCCTTCAC-3’，SEQ ID NO.4；
S3，将克隆产物和pBBR1MCS-2质粒利用限制性内切酶Kpn I、Hind III分别双酶切后采用T4 DNA连接酶酶连，其中，pBBR1MCS-2质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图如图2中的(b)图所示；酶连时克隆产物和pBBR1MCS-2质粒的摩尔比为4:1，酶连反应总体积为20μL；酶连反应将克隆产物插入pBBR1MCS-2质粒，将酶连产物转入大肠杆菌S17-1感受态细胞，通过扩增与筛选，获得重组表达载体，以及含有重组表达载体的重组大肠杆菌S17-1；其中，重组大肠杆菌S17-1的菌落PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图如图2中的(c)图所示。
其中，所述小分子热休克蛋白编码基因ibpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述小分子热休克蛋白IbpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；构建重组表达载体的示意图如图1所示。
实施例2：
小分子热休克蛋白IbpA的转化与表达
(1)将类球红细菌ATCC 17023接种于LB液体培养基，32℃、200rpm，光照或无光照培养2～3天，得类球红细菌菌液；
其中，所述LB液体培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH7.0；
(2)将实施例1制备的含有重组表达载体的重组大肠杆菌S17-1(供体菌)在添加有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜；吸取过夜培养的菌液转接至新鲜LB液体培养基，培养至OD600为0.5左右，得重组大肠杆菌菌液；
(3)将步骤(1)中的类球红细菌菌液和步骤(2)中的重组大肠杆菌菌液各取1mL，5000rpm离心4min，弃上清；各用1mL新鲜LB液体培养基非常轻缓地重悬菌体，5000rpm离心4min，弃上清，过程重复两次，最后用100μL新鲜LB液体培养基非常轻缓地重悬菌体，得类球红细菌重悬菌液和重组大肠杆菌重悬菌液；
(4)按照菌浓比1:5的比例混合步骤(3)中的类球红细菌重悬菌液和重组大肠杆菌重悬菌液，将混合后的菌液点在含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL亚碲酸钾两种抗生素的LB固体培养基上放置的0.22μm无菌滤膜上；光照或无光照条件下，32℃静置培养1天，使其发生接合转移；
(5)刮下步骤(4)中滤膜上的菌苔，用新鲜LB液体培养基重悬，涂布至含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL亚碲酸钾两种抗生素的LB固体培养基上，32℃静置培养3天以上，直至培养基上有小的黑色菌落出现为止；
其中，所述LB固体培养基的组分为：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，pH 7.0；
(6)将步骤(5)中的黑色菌落挑出，用新鲜LB液体培养基重悬，稀释后涂布至含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL亚碲酸钾两种抗生素的LB固体培养基上，32℃静置培养3天以上，直至平板上有单独的菌落出现为止，挑取菌落提取质粒并鉴定，得重组类球红细菌；
将上述筛选得到的重组类球红细菌接种于含25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养，即可实现小分子热休克蛋白IbpA的过表达；pBBR1MCS-2质粒为组成型表达，无需加入诱导剂诱导。
实验例1：
类球红细菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对温度的抗性测试
取实施例2中导入重组表达载体的重组类球红细菌ibpA/op和导入空载体的类球红细菌WT/op，分别接种于LB液体培养基中活化，32℃，200rpm振荡培养48h，其中含有ibpA/op的培养基中添加25μg/mL卡那霉素；将活化后的菌液以新培养基体积2％的接种量转接到新的LB液体培养基中，32℃、200rpm，振荡培养24h；在波长为600nm的条件下，测定菌液的OD600值，调整ibpA/op菌液和WT/op菌液至相同浓度，OD600值为1.0。
将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在85℃高温下保温10min，检测菌株在高温下的存活率，结果如表1和图3所示；
表1.类球红细菌菌株在高温条件下的平均存活率
菌株 WT/op ibpA/op
存活率(％) 0.001 23
由表1和图3可得，重组类球红细菌ibpA/op对高温的适应性明显高于对照菌株；85℃高温胁迫10min后，ibpA/op的平均存活率可达23％，而WT/op的平均存活率仅为0.001％，这说明过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组类球红细菌对高温有较高的抗性。
实验例2：
类球红细菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对pH的抗性测试
①高酸度条件
与实验例1不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后用pH为5.0的LB液体培养基重悬，32℃分别培养2h、4h、8h，检测菌株在高酸度条件下的存活率，结果如表2和图4所示；
表2.类球红细菌菌株在高酸度条件下的平均存活率
存活率(％) 2h 4h 8h
WT/op 18 21 3
ibpA/op 15 27 24
由表2和图4可得，重组类球红细菌ibpA/op对高酸度的耐受性总体高于对照菌株WT/op；在pH为5.0的高酸度条件下培养4h，ibpA/op的平均存活率可达27％，相比WT/op的21％提高了6％；在pH为5.0的高酸度条件下培养8h，ibpA/op的平均存活率在24％，而WT/op的平均存活率为3％，这说明过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组类球红细菌对高酸度有较高的抗性。
②高碱度条件
与实验例1不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后用pH为11.0的LB液体培养基重悬，32℃分别培养2h、4h、8h，检测菌株在高碱度条件下的存活率，结果如表3和图5所示；
表3.类球红细菌菌株在高碱度条件下的平均存活率
存活率(％) 2h 4h 8h
WT/op 24 11 1
ibpA/op 33 37 24
由表3和图5可得，重组类球红细菌ibpA/op对高碱度的耐受性总体高于对照菌株WT/op；在pH为11.0的高碱度条件下培养2～8h，ibpA/op的平均存活率均远高于WT/op，尤其是在pH为11.0的高碱度条件下培养8h后，ibpA/op的平均存活率为24％，而WT/op的平均存活率仅为1％，这说明过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组类球红细菌对高碱度有较高的抗性。
实验例3：
类球红细菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对盐离子的抗性测试
与实验例1不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后用NaCl浓度为5％(w/w)的LB液体培养基重悬，32℃条件下分别培养2h、4h、8h，检测菌株在高盐度条件下的存活率，结果如表4和图6所示；
表4.类球红细菌菌株在高盐度条件下的平均存活率
存活率(％) 2h 4h 8h
WT/op 63 51 1
ibpA/op 42 24 45
由表4和图6可得，虽然在高盐条件下培养2～4h时ibpA/op的平均存活率要小于WT/op，但在高盐度条件下培养4h后，ibpA/op逐渐适应高盐环境，菌株进一步增殖；从而在高盐度条件下培养8h后，ibpA/op的平均存活率明显提升至45％以上，而WT/op的平均存活率仅为1％，这说明过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组类球红细菌对高盐度有较高的耐受性。
实验例4：
类球红细菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对重金属离子和糠醛的抗性测试
与实验例1不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后分别用含Cr6+(350mg/L)、Pb2+(650mg/L)、Cd2+(350mg/L)、糠醛(40g/L)的LB液体培养基重悬，并在32℃条件下培养4h，检测菌株在重金属离子和有机化合物糠醛下的存活率，结果如表5和图7～10所示；
表5.类球红细菌菌株在重金属离子和有机化合物糠醛下的平均存活率
存活率(％) Cr6+(350mg/L) Pb2+(650mg/L) Cd2+(350mg/L) 糠醛(40g/L)
WT/op 7 8 10 51
ibpA/op 23 25 22 76
由表5和图7～10可得，在重金属离子和有机化合物糠醛的影响下，ibpA/op的平均存活率均高于WT/op，这说明过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组类球红细菌对重金属离子和有机化合物糠醛有较高的耐受性。
实验例5：
大肠杆菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对温度的抗性测试
取实施例1中导入重组表达载体的重组大肠杆菌ibpA/op和导入空载体的大肠杆菌WT/op，分别接种于LB液体培养基中活化，32℃，200rpm振荡培养48h，其中含有ibpA/op的培养基中添加50μg/mL卡那霉素；将活化后的菌液以新培养基体积2％的接种量转接到新的LB液体培养基中，32℃、200rpm，振荡培养24h；在波长为600nm的条件下，测定菌液的OD600值，调整ibpA/op菌液和WT/op菌液至相同浓度，OD600值为1.0。
将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在85℃高温下保温10min，检测菌株在高温下的存活率，结果如图11所示，ibpA/op的平均存活率为15％，WT/op的存活率为0，可见过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组大肠杆菌对高温有较高的抗性。
实验例6：
大肠杆菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对pH的抗性测试
与实验例5不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后分别用pH为5.0和pH为11.0的LB液体培养基重悬，32℃条件下分别培养2h、4h、8h，检测菌株在高酸度和高碱度条件下的存活率，结果如表6、图12和图13所示，可见过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组大肠杆菌对高酸度和高碱度有较高的抗性。
表6.大肠杆菌菌株在高酸、碱度条件下的平均存活率
实验例7：
大肠杆菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对盐离子的抗性测试
与实验例5不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后用NaCl浓度为5％(w/w)的LB液体培养基重悬，32℃条件下分别培养2h、4h、8h，检测菌株在高盐度条件下的存活率，结果如表7和图14所示，可见过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组大肠杆菌对高盐度有较高的耐受性。
表7.大肠杆菌菌株在高盐度条件下的平均存活率
存活率(％) 2h 4h 8h
WT/op 55 44 1
ibpA/op 62 57 42
实验例8：
大肠杆菌过表达小分子热休克蛋白IbpA对重金属离子和糠醛的抗性测试
与实验例5不同的是，本实验例将调整至相同浓度的ibpA/op菌液和WT/op菌液分别在8000rpm离心5min，收集菌体，然后分别用含Cr6+(450mg/L)、Pb2+(350mg/L)、Cd2+(200mg/L)、糠醛(6g/L)的LB液体培养基重悬，并培养4h，检测菌株在重金属离子和有机化合物糠醛下的存活率，结果如表8和图15～18所示，可见过表达小分子热休克蛋白IbpA的重组大肠杆菌对重金属离子和有机化合物糠醛有较高的耐受性。
表8.大肠杆菌菌株在重金属离子和有机化合物糠醛下的平均存活率
存活率(％) Cr6+(450mg/L) Pb2+(350mg/L) Cd2+(200mg/L) 糠醛(6g/L)
WT/op 2 1 1 20
ibpA/op 17 19 12 42
对比例1：
分别将大肠杆菌S17-1来源的小分子热休克蛋白IbpA和类球红细菌ATCC 17023来源的小分子热休克蛋白IbpA过表达于类球红细菌ATCC 17023，并分别命名为“ibpA(E.coli)/op”和“ibpA/op”；其中，大肠杆菌S17-1来源的小分子热休克蛋白IbpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
将相同浓度的ibpA(E.coli)/op菌液和ibpA/op菌液分别在85℃高温下保温10min，检测不同来源的小分子热休克蛋白IbpA过表达于宿主菌后的重组菌株在高温下的存活率；结果如图19所示，其中ibpA/op的平均存活率为22％，而ibpA(E.coli)/op的平均存活率仅为8％，可见来源于类球红细菌ATCC 17023的小分子热休克蛋白IbpA对高温具有更高的抗性。
综上所述，本发明提供了一种来源于类球红细菌ATCC 17023且能够提高宿主菌环境耐受性的小分子热休克蛋白IbpA，将其在宿主菌中过表达后，所获得的重组菌在高温、高酸、高碱、高盐、高浓度金属离子和高浓度糠醛等胁迫条件下的抗性大大增加，能够显著提高宿主菌在多种逆境下的生存能力。

Claims (10)

1.一种小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用，所述小分子热休克蛋白IbpA来源于类球红细菌ATCC 17023，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子热休克蛋白IbpA的编码基因ibpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述宿主菌为类球红细菌或大肠杆菌。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，应用方法是将类球红细菌ATCC 17023中的小分子热休克蛋白编码基因ibpA克隆并构建重组表达载体，将重组表达载体转入宿主菌中，使得宿主菌过表达小分子热休克蛋白IbpA。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，应用方法具体包括如下步骤：
S1，从类球红细菌ATCC 17023中提取出总DNA；
S2，以提取的总DNA为模板，设计引物，通过PCR扩增得到小分子热休克蛋白编码基因ibpA，即克隆产物；所述引物为：
上游引物：5’-CGGGGTACCATGCGTAGCTATGATTTCTCGCCGC-3’，SEQ ID NO.3；
下游引物：5’-CCCAAGCTTTCAGGCCTCGACCGGCTCCTTCAC-3’，SEQ ID NO.4；
S3，将克隆产物酶切后插入酶切后的质粒载体中构建重组表达载体；优选的，所述质粒载体为pBBR1MCS-2；
S4，采用接合转移的方式将重组表达载体转化到宿主菌中，过表达小分子热休克蛋白IbpA，提高宿主菌环境耐受性。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述S2中的PCR扩增反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，70℃退火15s，72℃延伸2min，重复35个循环；72℃延伸5min，降温至4℃；
优选的，所述S3中的酶切方法为利用限制性内切酶Kpn I、Hind III酶切。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述S4中重组表达载体的转化方法为：
(1)制备宿主菌菌液和含有重组表达载体的供体菌菌液，洗涤菌体后重悬，得宿主菌重悬菌液和供体菌重悬菌液；
(2)将宿主菌重悬菌液和供体菌重悬菌液按照菌浓比1:3～7混合，将混合后的菌液点种于相应固体培养基上放置的0.22μm无菌滤膜上，静置培养使其发生接合转移，筛选获得含有重组表达载体的宿主菌。
8.一种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的编码基因ibpA。
9.一种重组菌，其特征在于，含有权利要求8所述的重组表达载体或权利要求2所述的编码基因ibpA。
10.如权利要求9所述的一种重组菌，其特征在于，所述重组菌的宿主菌为类球红细菌或大肠杆菌。
CN202310685601.XA 2023-06-08 2023-06-08 小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用 Pending CN116926097A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310685601.XA CN116926097A (zh) 2023-06-08 2023-06-08 小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310685601.XA CN116926097A (zh) 2023-06-08 2023-06-08 小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116926097A true CN116926097A (zh) 2023-10-24

Family

ID=88383437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310685601.XA Pending CN116926097A (zh) 2023-06-08 2023-06-08 小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116926097A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108165515B (zh) 一种可降解生物胺的多铜氧化酶重组酶
CN109609530B (zh) 一种海藻糖合成酶及其在海藻糖生产中的应用
CN108456652B (zh) 一种鞘氨醇单胞菌基因工程菌及其构建方法与应用
CN111876399B (zh) 北极来源的β-葡萄糖苷酶基因、及其编码的蛋白和应用
CN106566823A (zh) 一种新型谷氨酸脱羧酶基因的克隆及其应用
CN109468288A (zh) 一种高效降解组胺的新多铜氧化酶
CN114107146B (zh) 一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用
CN113430181B (zh) 一种来源亚洲象肠道宏基因组的细菌漆酶及其基因
CN111154776A (zh) 一种耐盐基因及其在培育耐盐微生物中的应用
CN110627878B (zh) 一种热休克蛋白Hsp20的基因克隆、制备方法及其应用
CN114736880B (zh) 酸稳定性提高葡萄糖氧化酶GoxM10的突变体D497N及其衍生突变体和应用
CN116926097A (zh) 小分子热休克蛋白IbpA在提高宿主菌环境耐受性中的应用
CN116925196A (zh) 小分子热休克蛋白rsp_1572在提高宿主菌环境耐受性中的应用
CN111286464B (zh) 一种表达几丁质酶的工程菌及植物促生长应用
CN110862952B (zh) 5-氨基乙酰丙酸生产菌株及其构建方法和应用
CN113817758A (zh) 编码贝莱斯芽孢杆菌的壳聚糖酶基因、壳聚糖酶及其制备方法和应用
CN116555156B (zh) 一种提高l-缬氨酸产量的方法及其使用的重组菌
CN116536237B (zh) 改造的大肠杆菌及其在发酵生产l-缬氨酸中的应用
CN116555150B (zh) 用于发酵生产l-缬氨酸的重组大肠杆菌
AU2021100409A4 (en) Recombinant low-temperature catalase, recombinant vector and engineered strain thereof
CN109439606B (zh) 一种提高间苯三酚产量的基因工程菌及其构建方法与应用
WO2022186216A1 (ja) 改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法
EP1673442B1 (en) Transgenic organisms with lower growth temperature
CN102250853B (zh) 一种具有双结构域的低温中性植酸酶PhyH及其基因和应用
Saadati et al. Cloning and Production of Protease Enzyme from Aeribacillus pallidus P18 Strain.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination