CN116916935A - 抑制乙型肝炎病毒表达的RNAi制剂以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种用于抑制乙型肝炎病毒的表达的RNAi制剂和其用途，具体地，涉及一种用于抑制乙型肝炎病毒表达的RNAi制剂和一种包括所述RNAi制剂的药物组合物，所述药物组合物用于改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病。

Description

抑制乙型肝炎病毒表达的RNAi制剂以及其用途
技术领域
本申请涉及一种抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)表达的RNAi制剂以及其用途。
背景技术
乙型肝炎(Hepatitis B)是指一种起因于乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染的传染性疾病，在潜伏期出现疲倦感、食欲不振、疲劳、恶心、呕吐、右侧上腹部不适感，在症状严重时引起黄疸和瘙痒症。已知，在全球上每年200万或更多人感染于HBV。虽然HBV疫苗的开发导致了HBV保持率减少至3％左右，国内带菌者仍然多达约125万人。对乙型肝炎患者治疗的最大障碍为对HBV治疗剂频繁出现的药物耐性，因此，需要开发一种新型治疗剂。
乙型肝炎病毒为由3,200bp尺寸的不完全双链组成的DNA病毒，在完全的原型负链DNA内侧存在具有不完全互补性结构的正链DNA。乙型肝炎病毒基因组由4个开放阅读框(open reading frame,ORF)围绕，其中，编码(encoding)聚合酶的聚合酶ORF最长，其次是编码病毒表面蛋白的表面(surface)ORF，这在以重叠的形式存在于聚合酶ORF内。另一方面，前核(precore)/核(core)ORF和核心启动子(core promoter)/X ORF以与聚合酶ORF部分地重叠的状态存在。
具有这种结构的乙型肝炎病毒的增殖从病毒贴附于肝细胞表面而侵入细胞质内起开始。侵入细胞质内的乙型肝炎病毒的核壳体在核膜中除去外壳的过程后移动到肝细胞核内。在核内，乙型肝炎病毒基因组使用人体内的酶而从具有不完整双链的松弛环状(relaxed circular)DNA形式转换为具有完整双重结构的共价闭合环(cccDNA，covalentlyclosed circular DNA)形式。在转录所有乙型肝炎病毒mRNA时，这种形式作为最关键的模具。接着，进行从cccDNA形式的病毒小染色体中转录5个RNA的过程。由两个增强子(enhance)调节所述转录过程。增强子Ⅰ位于S与X蛋白之间，增强子Ⅱ位于核启动子(corepromoter)正上方，所述增强子Ⅰ、Ⅱ通过上调启动子来促进病毒增殖。由4个启动子产生的转录体为3.5kb的前基因组RNA(pregenomic RNA)和其大小稍微大于3.5kb的前核RNA(precore RNA)，以及2.4kb、2.1kb、0.7kb的亚基因组RNA(subgenomic RNA)。一群的启动子调节转录体的激活程度，并且，RNA转录体通过翻译过程产生蛋白质。2.4kb的RNA转录体产生preSI蛋白，2.1kb的RNA转录体产生preS2和S蛋白，0.7kb的转录体产生X蛋白。然后，前核RNA产生HBeAg，前基因组RNA与病毒的核壳体(core蛋白，HBcAg)形成聚合酶且用作逆转的模具。随后，在细胞质内前基因组RNA的包装信号(encapsidation signal or epsilon(ε))和聚合酶反应而一起包装(encapsidation)在核壳体内，且在所述核壳体内部通过逆转过程形成负链DNA。此时，由11个核苷酸组成的直接重复1(direct repeat 1，DR1)用作产生负链DNA的原始物。一旦如上所述产生负链DNA，具有与DR1几乎相同的序列deDR2在对面正链的5'端处重新开启，开始产生正链DNA，RC DNA形成为不完整却双链的DNA，并且，核壳体逐渐成熟。然后，核壳体再进入肝细胞核内并逐渐增加肝内cccDNA量或在细胞质细网中形成外皮膜，然后经过高尔基体以新型病毒粒子(virion)的形式排放到肝细胞外部。
另一方面，使用RNA干扰(RNA interference)现象的疾病的治疗靶向mRNA并使用在翻译水平(translational level)调节基因表达的siRNA，由此可以更安全地治疗疾病。小干扰RNA(small interfering RNA；siRNA)由其序列与靶mRNA相同的有义链(sensestrand)和其序列与所述有义链序列互补的反义链(antisense strand)组成。常规的siRNA具有19bp至21bp的短的双链体(Duplex)，且在两侧链的3'端具有两个突出的核苷酸。siRNA进入细胞内，粘附靶mRNA来降解靶mRNA，并抑制靶基因的表达。通过改变寡聚物(oligo)，可以靶向所有mRNA，从而可以抑制结构复杂的蛋白质的表达，因此可以实现对目前难以治疗的癌症、病毒感染、遗传疾病等疾病的治疗。然而，导入细胞内的siRNA可能导致注入免疫反应诱发、非靶基因的抑制等的副作用，其中，将siRNA导入细胞内的传递系统(deliverysystem)在使用siRNA的治疗剂开发中成为最大的问题。
siRNA由于磷酸盐骨干(phosphate backbone)带负电荷，与带负电荷的细胞膜具有排斥力，因此，为了将siRNA导入细胞内需要传递系统。作为传递系统的一个例子，通常使用的方法是使用带正电荷的脂质体或聚合物封包siRNA而抵消负电荷并将所述siRNA导入细胞内。然而，带正电荷的传递载体可能引起各种副作用，例如，粘附于带负电荷的细胞膜而显示不期望的毒性或通过与细胞内的各种蛋白质进行互动来形成不期望的复合物。并且，由于siRNA由血液内的核酸酶(nuclease)迅速地降解，因此，到达靶细胞的siRNA的量可能不足以相当减少靶基因的表达。因此需要一种能够将siRNA安全且有效地传递至靶细胞内地方法。
因此，本发明人为了开发靶向HBV且在没有传递载体的帮助而被输送至细胞内且对核酸水解酶具有高抵抗性的siRNA研究并努力，结果，通过抑制针对乙型肝炎病毒基因组中的聚合酶(Polymerase)、S蛋白(表面抗原S)或XBx(X蛋白)区域中的ORF的转录体，设计了能够抑制HBV增殖的siRNA。进而，通过功效筛选选择最有效的siRNA，并确认可以通过修饰(modification)克服细胞内传递问题，从而完成了本发明。
记载于本背景技术部分的所述信息仅用于提高对本发明的背景的理解，并且，可以不包括形成对本发明所属领域的普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种RNAi制剂，所述RNAi制剂用于抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)表达。
本发明的另一目的在于提供一种包括所述RNAi制剂的药物组合物，所述药物组合物用于改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病，或者改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病的方法。
技术方案
为了到达所述目的，本发明提供一种RNAi制剂，其包括与乙型肝炎病毒基因组中的HBV S或HBV X基因的mRNA具有互补的序列的反义链，以及与所述反义链形成互补键的有义链，其中，所述反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端(blunt end)。本发明还提供一种包括所述RNAi制剂的药物组合物，所述药物组合物用于改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染。
本发明还提供一种改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病的方法，所述方法包括将所述RNAi制剂施用于个体。
有益效果
根据本发明，可以提供一种非对称siRNA，所述非对称siRNA能够有效地抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)。另外，由于所述siRNA在没有载体协助的情况下导入细胞内且经过化学修饰以对核酸水解酶具有抵抗性，可以在体内(in vivo)更有效地抑制HBV，从而可以用作对起因于乙型肝炎病毒感染的疾病的有用治疗剂。
附图说明
图1为图示非对称乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)asiRNA的结构示意图。
图2示出使用HBV asiRNA处理Hela细胞后确认HBV增殖抑制能力的结果。
图3示出使用HBV asiRNA 4种处理小鼠肝细胞后确认HBV增殖抑制能力的结果。
图4示出在使用8种HBV cp-asiRNA处理小鼠肝细胞后确认HBV增殖抑制能力的结果。
图5为示出根据一实施例的评估HBV cp-asiRNA效能的小鼠模型试验过程的示意图。
图6示出将2种HBV cp-asiRNA施用于小鼠后确认HBV增殖抑制能力的结果。
图7为示出在用于根据一实施例的评估HBV cp-asiRNA效能的小鼠模型中的功效测定(Efficacy assay)和持续时间测定(Duration assay)实验过程的示意图。
图8为示出21种HBV cp-asiRNA的Efficacy assay结果的图。
图9为示出21种HBV cp-asiRNA的Duration assay结果的图。
图10为示出评估在根据一实施例的HBV cp-asiRNA效能的细胞模型中的实验过程的示意图。
图11为示出确认HBV asiRNA和其cp-asiRNA的HBV增殖抑制能力的结果的图。
图12为示出评估在根据一实施例的HBV cp-asiRNA效能的腺相关病毒-乙型肝炎病毒(AAV-HBV)小鼠模型中的实验过程的示意图。
图13为示出确认HBV-cp asiRNA在AAV-HBV小鼠模型中的HBV增殖抑制能力的结果的图。
图14示出使用免疫组织化学法确认HBV cp-asiRNA在AAV-HBV小鼠模型中的HBV增殖抑制能力的结果。
图15示出使用20种HBV cp-asiRNA处理小鼠肝细胞后确认HBV增殖抑制能力的结果。图16为示出用于评估根据一实施例的HBV cp-asiRNA效能的小鼠模型中的Efficacyassay和Duration assay实验过程的示意图。
图17示出7种HBV cp-asiRNA的Efficacy assay结果。
图18示出4种HBV cp-asiRNA的Duration assay结果。
图19示出3种HBV cp-asiRNA的IC50测试结果。
图20示出确认导入E-VP修饰的3种HBV cp-asiRNA的HBV增殖抑制能力的结果。
具体实施方式
除非另有定义，在本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域中普通技术人员通常理解的相同的含义。在一般情况下，在本说明书中使用的命名法是在本技术领域中熟知且常用的。
在本发明的具体实施方式等中使用的主要术语的定义如下。
“RNAi(RNA interference；RNA干扰)”是指一种机制，其通过将双链RNA(dsRNA)导入细胞等诱导靶基因mRNA的降解来抑制靶基因的表达，所述双链DNA由具有与靶基因的mRNA相同的序列的链和具有与所述链互补的序列的链组成。
“RNAi诱导用核酸分子(nucleic acid molecules inducing RNAi)、RNAi制剂，或RNAi诱导用制剂”是指一种核酸分子，所述核酸分子能够通过以序列特异性方式介导所述RNA干扰抑制或下调基因表达或病毒复制的任意的核酸分子。所述术语可以是对个别的核酸分子、多个所述核酸分子，或者所述核酸分子的核苷酸库(pool)的总称。在一个实施方式中，所述RNAi诱导用核酸分子可以是siRNA。
“siRNA(small interfering RNA；小干扰RNA)”是指序列特异性介导有效的基因表达沉默(gene silencing)的较短的双链RNA(dsRNA)。
“反义链(antisense strand)”是指与所关注的靶核酸(target nucleic acid)实际上或100％互补的聚核苷酸，例如可以与信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)、mRNA之外的RNA序列(例如，microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA以及hnRNA)或编码或非编码DNA序列整体上或一部分互补。
“有义链(sense strand)”是指具有与靶核酸相同的核酸序列的聚核苷酸，即与mRNA、mRNA之外的RNA序列(例如，microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA以及hnRNA)或与编码或非编码DNA序列整体上或一部分相同的多核苷酸。
“基因”应当被视为最广泛的意义，且可以对结构蛋白或调节蛋白进行加密。此时，调节蛋白包括转录因子、热冲击蛋白或参与DNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白。在本发明中，需要抑制其表达的靶基因是在病毒基因组中内在的，且可以并入动物基因或以染色体外的组成要素存在。例如，靶基因可以是HBV基因组上的基因。此时，siRNA分子有用于灭活哺乳动物细胞内HBV基因的翻译。
“乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)”是一种属于嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)家族的病毒，且侵入肝细胞来诱发急性和慢性肝炎等。所述HBV会经过粘附于肝细胞表面并进入细胞内的过程、从细胞质剥离外壳后进入细胞核内并经过DNA复制而增殖的过程、在细胞质中积累壳子并将其重组为完整的病毒形式的组配过程、以及被排放到肝细胞外部的排放过程，还会粘附于其他肝细胞而反复经过如上所述的增殖过程。其中，共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)存在于被HBV感染的肝细胞核内且用作HBV转录模具，因此，抑制由其介导的基因的转录、翻译过程可能对治疗起因于译性感染病毒感染的疾病有效。
尤其，由于HBV基因组的转录导致多顺反子性重叠RNA，靶向单一HBV基因的根据一方面的RNAi制剂可以对大部分或所有HBV转录体表达造成显著的抑制。例如，靶向HBV基因组中的S基因的RNAi制剂不仅能够导致对S基因表达的抑制，而且能够对“下游”基因表达的抑制，并且，靶向HBV基因组中的X基因的RNAi制剂也不仅能够导致对X基因表达的抑制而且能够导致对“下游”基因表达的抑制。因此，通过抑制在HBV基因组中的HBV S或HBV X基因的表达，可以抑制乙型肝炎病毒的复制或增殖。根据一个实施方式，转录本对所述乙型肝炎病毒基因组中S蛋白(表面抗原S)或HBx(X蛋白)区域的ORF的抑制可能在与乙型肝炎病毒基因组的聚合酶(Polymerase)区域的ORF重叠的区域中发生。
本发明的目的可以大致表示为两个：第一，设计靶向HBV基因的siRNA，并通过筛选选择最有效地抑制HBV的复制或增殖的siRNA；第二，导入化学修饰以在没有具体的载体的情况下将siRNA传递至细胞内并提高对核酸水解酶的抵抗性。为了穿透由磷脂质组成的细胞膜，siRNA必须具有较小的尺寸或疏水性。然而，siRNA由于由于磷酸盐骨干(phosphatebackbone)带负电荷，因此，在透过细胞膜时有困难。另外，需要提高siRNA对核酸水解酶的抵抗性并使所述siRNA在血清(serum)中较长的水命，使得到达靶的量足以引起有效的RNAi。因此，通过导入修饰(modification)克服了siRNA的传递(delivery)问题。
在本发明的一实施例中，首先设计靶向HBV基因组中的S或X基因的asiRNA，并从被HBV质粒转染的细胞中选择具有优异的HBV增殖抑制能力的asiRNA。然后，将以下4种修饰(modification)导入所选择的siRNA中，并修改asiRNA以具有细胞穿透能和对核酸水解酶的抵抗性。第一，将N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物结合至有义链的3'端以实现到肝组织的传递。第二，使用硫代磷酸酯(phosphorothioate)取代有义链或反义链的5'端或3'端附近的磷酸盐骨干以对核酸酶具有抵抗性，且实现到细胞内的吸收和siRNA在体内的生物学使用。第三，使用O甲基修饰糖的2'来赋予对核酸酶的抵抗性，降低siRNA免疫原性，并减少脱靶(off-target)效应。第四，使用氟代(fluoro)修饰糖的2'来给双链体(double strandduplex)赋予稳定性，且提高其在血清中的稳定性并实现在体外和体内的有效沉默(silencing)。通过对siRNA进行如上所述的修改(modification)，siRNA获得细胞穿透能，且在血清中滞留更长的时间，因此，随着充分量的siRNA输送至表细胞，可以实现更有效的基因沉默。
因此，根据一方面，本发明涉及一种包括有义链和反义链的RNAi制剂，其抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)的表达，其中，所述反义链具有19nt至23nt的长度；所述有义链具有15nt至17nt的长度且与所述反义链形成互补键，包括选自由序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、37、39、41、43、45、47、49、51和53组成的组中的序列，且包括多价的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺衍生物；以及所述反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端(bluntend)。
并且，在一方面，本发明涉及一种包括有义链和反义链的RNAi制剂，其抑制乙型肝炎病毒的表达，其中，所述反义链具有19nt至23nt的长度；所述有义链具有15nt至17nt的长度，与所述反义链形成互补键，且包括选自由序列号21、23、25、27、29、31、33、35、55、57、69、61、63、65、67、69、71、73和75组成的组中的序列，还包括多价的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺衍生物；以及，所述反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端。
并且，本发明的一方面涉及一种RNAi制剂，其包括反义链和有义链，其中，反义链包括与对HBV的聚合酶和表面抗原S进行加密的重叠开放阅读框或对HBV聚合酶和X蛋白(HBx)进行加密的重叠开放阅读框互补的序列；并且有义链与所述反义链形成互补键，以及一种包括所述RNAi制剂的药物组合物，所述药物组合物用于改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病。
本发明中的siRNA为包括具有常规的RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用的所有物质的概念。RNAi是在1998年由Caenorthabditis elegans最初发现的细胞内基因调节机制，已知，在其作用机制中，投入细胞内的RNA双链中的反义链与靶基因的mRNA互补性结合以诱导靶基因的降解。其中，siRNA是在“体外(in vitro)”抑制基因表达的方法。19bp至21bp的siRNA在理论上可以选择性地抑制几乎所有基因，因此可以开发为用于癌症、病毒性感染等各种基因相关疾病的治疗剂，且为最近最受关注的新药开发候选技术。在2003年度中间首次尝试在哺乳动物中使用siRNA的体内治疗，然后，已有关于对应用研究的很多尝试和体内治疗的许多报告。
然而，与siRNA的可能性相反，也由不断的报告指出siRNA的副作用和缺点。为了开发基于RNAi的治疗剂，需要克服如下的障碍：1)有效传递系统的缺乏、2)脱靶效应、3)免疫反应诱导、4)细胞内RNAi机构的饱和。虽然siRNA为能够直接调节靶基因表达的有效方法，这些问题对治疗剂开发造成困难。对此，非对称siRNA(asymmetric shorter duplexsiRNA，asiRNA)是一种非对称RNAi诱导结构，其具有与现有的siRNA的19+2结构相比较短的双螺旋长度。非对称siRNA为已克服了在现有的siRNA结构技术中确认的脱靶效应、RNAi机制的饱和、由于TLR3引起的免疫反应等问题的技术，从而可以开发副作用较少的RNAi新药。
基于此，一实施例提出一种非对称siRNA，其包括有义链和与所述有义链互补的反义链。根据一实施例的siRNA不会引起脱靶效应、RNAi机制饱和等问题，因此可以稳定地维持高输送效率的同时有效地抑制对HBV靶基因的表达至所需的程度。在本发明中，所述RNAi制剂的特征可以在于，所述有义链具有15nt至17nt的长度且所述反义链具有18nt或更大的长度。虽然不限于此，所述RNAi制剂的特征还可以在于，所述反义链具有18nt至31nt的长度，优选地，18nt至23nt的长度。更优选地，所述RNAi制剂的特征也可以在于，所述有义链具有16nt至17nt的长度，且与所述有义链互补的反义链具有19nt、20nt、21nt或22nt，但不限于此。
所述有义链的3'端和反义链的5'端形成钝端(blunt end)。反义链的3'端例如可以包括1nt至16nt的悬挂(overhang)。
根据本发明的一实施例，设计了一种HBV asiRNA，其靶向HBV基因组中的S或X基因，并在被HBV转染的细胞或瞬时表达HBV的过度细胞(transient cell)中，确认了所述HBVasiRNA抑制HBV的功效。
在根据本发明的RNAi制剂中，有义链可以选自由序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、37、39、41、43、45、47、49、51和53组成的组中，优选地，可以选自序列号7、13、19、33、65或67。
在根据本发明的RNAi制剂中，反义链可以选自由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、38、40、42、44、46、48、50、52，以及54组成的组中，优选地，可以选自序列号8、序列号14、序列号30、序列号34或序列号66。
在根据本发明的另一RNAi制剂中，有义链可以选自由序列号21、23、25、27、29、31、33、35、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73以及75组成的组中，优选地，可以选自序列号29、33、65、67、73或75。
在根据本发明的另一RNAi制剂中，反义链可以选自由序列号22、24、26、28、30、32、34、36、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74以及76组成的组中，优选地，可以选自序列号30、34、66、68、74或76。
本发明的特征可以在于，所述RNAi制剂的有义链或反义链包括一个或多个化学修饰(chemical modification)。
通常的siRNA由于磷酸盐骨干结构引起的高负电荷和高分子量等理由无法穿透细胞膜，且在血液中迅速地被降解并消除，因此，对向实际靶部位传递足以诱导RNAi的量有困难。目前，对于in vitro传递而言，已有开发很多使用阳离子脂质体(cationic lipids)和阳离子聚合物(cationic polymers)的高效率的传递方法。然而，对于in vivo而言，问题在于，难以以相当于in vitro的高效率传递siRNA，并且，存在于生物体内的各种蛋白质和互动导致siRNA传递效率减少。
因此，本发明人通过将化学修饰导入非对称siRNA来开发了一种asiRNA结构物(cp-asiRNA)，其具有在没有其他输送载体的情况下能够有效地进行细胞内输送的自我输送能。
在本发明中，所述有义链可以包括三价N-乙酰半乳糖胺衍生物。
根据本发明，在所述有义链或反义链中的化学修饰可以包括选自以下修饰组成的组中的一种以上：在核苷酸内糖结构的2'碳位置的-OH基被-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-甲硫基乙酸乙酯、-O-3-氨丙基，或-O-3-二甲胺基丙基取代；核苷酸内糖(sugar)结构的氧被硫取代；核苷酸结合被修饰为硫代磷酸酯、磷酸硼，或磷酸甲酯；被修饰为肽核酸、锁核酸，或未锁核酸形式；以及与磷酸基、E-磷酸乙烯酯或细胞侵入肽结合。
根据一实施方式，所述反义链可以包括选自以下的一种或更多化学修饰：接近3'端或5'端的3个至5个核苷酸键被修饰为硫代磷酸酯、磷酸硼，或磷酸甲酯；在两个或更多核苷酸内的糖结构的2'碳位置处，-OH基被-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲基乙基-O-丙基、-O-2-(甲硫基)乙基、-O-3'氨丙基，或-O-3-二甲氨基丙基取代；以及在5'端处与磷酸基或E-磷酸乙烯酯或细胞进入肽结合。
根据一个实施方式，所述有义链可以包括选自以下的任意一种或更多化学修饰：接近于5'端的2个至4个核苷酸键被修饰为硫代磷酸酯、磷酸硼，或磷酸甲酯；在两个或更多核苷酸内糖结构的2'碳位置处，-OH基被-CH3(甲基)、-OCH3(甲氧基)、-NH2、-F(氟)、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-O-2-(甲硫基)乙基、-O-3-氨丙基、-O-3-二甲氨基丙基取代；乙基在3'端处与细胞侵入肽的结合。
根据另一实施方式，其特征在于，包括选自有以下组成的组中的一种或更多修饰：在所述有义链或反义链中两个或更多核苷酸内糖结构的2'碳位置处的-OH基被-OCH3(甲氧基)或-F(氟)取代的修饰；在有义链或反义链中10％或更多核苷酸键被修饰为硫代磷酸酯(phosphorothioate)；以及在反义链的5'端处的磷酸基键或E-磷酸乙烯酯键。
在根据本发明的RNAi制剂中，反义链可以选自由以下表1中的(a)至(d)组成的组中，有义链可以选自由以下表1中的(e)至(h)组成的组中。优选地，所述反义链可以是以下表1中的(a)或(c)中的任一个，所述有义链可以是以下表1中的(e)或(g)中的任一个。
【表1】
序列号(5'>3')
(a) P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU
(b) P-mU*fA*mCmGmAfAmCfCfAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU
(c) P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC
(d) P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC
(e) mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc
(f) mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGmUmUmCmGmUmA-GalNAc
(g) mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc
(h) mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUmCmUmA-GalNAc
在所述序列中，*是指硫代磷酸酯键(phosphorothioated bond)，m是指2'-O-甲基(Methyl)，2'-F-是指2-氟代(Fluoro)、P是指5-磷酸基(Phosphate group)，GalNAc是指与N-乙酰半乳糖胺衍生物(GalNAc)结合。
在根据本发明的另一RNAi制备中，反义链可以为选自由以下表2中的(a1)至(u1)组成的组中的任一个，有义链可以为选自由以下表2中的(a2)至(u2)组成的组中的任一个。优选地，所述反义链可以为以下表2中的(a1)、(b1)、(j1)、(q1)、(s1)、(t1)或(u1)中的任一个，所述有义链可以为以下表2中的(a2)、(b2)、(j2)、(q2)、(s2)、(t2)或(u2)中的任一个。更优选地，所述反义链可以为以下表2中的(a1)、(j1)、(s1)、(t1)或(u1)中的任一个，所述有义链可以为以下表2中的(a2)、(j2)、(s2)、(t2)或(u2)中的任一个。
【表2】
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在所述序列中，*是指硫代磷酸酯键(phosphorothioated bond)，m是指2'-O-甲基(Methyl)，2'-F-是指2'-氟代，P是指5'-磷酸基，EVP是指5'E-乙烯基磷酸酯(E-Vinylphosphonate)，GalNAc是指与N-乙酰半乳糖胺衍生物结合。
在根据本发明的另一RNAi制剂中，反义链可以选自由以下表3的(a1)至(u1)组成的组中，有义链可以选自由以下表3的(a2)至(u2)组成的组中。优选地，所述反义链为以下表3中的(e1)、(k1)、(l1)、(n1)或(v1)，所述有义链为以下表3中的(e2)、(k2)、(l2)、(n2)或(v2)。更优选地，所述反义链为以下表3中的(k1)、(l1)、(n1)或(v1)，所述有义链为以下表3中的(k2)、(l2)、(n2)或(v2)。
【表3】
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在另一方面，本发明涉及一种包括所述RNAi制剂的药物组合物，所述药物组合物用于改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病。
在本发明中，所述起因于乙型肝炎病毒感染的疾病是指由HBV感染和/或复制导致或与HBV感染和/或复制相关的疾病或障碍，且可以包括由于HBV基因表达和/或复制的减少将要得到利益的疾病、障碍或病症。所述疾病例如可以为丁型肝炎病毒感染、δ肝炎、急性乙型肝炎、急性暴发性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝功能不全，或肝癌，但不限于此。
所述药物组合物可以被制备成除了作为有效成分的RNAi制剂之外进一步包括一种或更多药学上可接受的载体。药学上可接受的载体应当能够本发明的有效成分共存，且可以使用食盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲食盐水、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇中的一种成分或其中的两种或更多成分，并且，可以根据需要添加其他常规添加剂，例如，抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。并且，可以通过附加稀释剂、散剂、表面活性剂、结合剂以及润滑剂来将所述药物组合物制备成诸如水溶液、悬浮液、乳浊液的注射用剂型。尤其，优选将所述载体制备成冻干(lyophilized)形式的剂型以提供。为了制备冻干剂型，可以使用本发明所属技术领域中公知的方法，也可以添加用于冻干的稳定剂。
所述药物组合物的使用方法是基于普通患者的症候和疾病的严重程度由本技术领域的普通技术人员确定的。并且，所述药物组合物可以被制备成散剂、锭剂、胶囊剂、液剂、注射剂、软膏剂、糖浆剂等各种形式，也可以使用单位施用量或多次施用量容器提供，例如，封闭的安瓶和瓶等。
本发明的药物组合物可以口服或肠胃外施用。根据本发明的组合物的施用路径可以是例如，口腔、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、更膜内、心脏内、经皮、皮下、腹腔内、肠道、舌下或局部，但不限于此。根据本发明的组合物的施用量范围根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食摄取、施用时间、方法、排泄率或疾病严重程度不同，且可以由本领域普通技术人员容易确定。并且，为了临床施用，可以使用公知技术将本发明的组合物制备成合适的剂型。
根据另一方面，本发明涉及一种改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病的方法，所述方法包括将所述RNAi制剂施用于个体。包括在根据本发明的改善或治疗方法中的构成与包括在前述的发明中的组成相同，因此，前述的内容可以同样适用于改善或治疗方法。
下面，将通过实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅用于提供本发明的示例且本发明的范围应当不解释为限于这些实施例是对本领域普通技术人员而言显而易见的。
实施例1：靶向HBV的RNAi诱导双链核酸分子的筛选
根据HBV增殖抑制能力的HBV asiRNA导出
在本实施例中，将用于筛选的HBV非对称siRNA(asymmetric siRNA,asiRNA)设计成16mer(有义链)-19mer(反义链)的非对称asiRNA(图1)。另外，将所述HBV asiRNA设计成靶向HBV基因组中的HBV S或HBV X区域的开放阅读框的转录体，即3.5Kb前基因组RNA、3.5Kb前核mRNA、2.4Kb前S1 mRNA，和/或2.1Kb前S2/S mRNA、0.7Kb Hbx mRNA，以抑制其表达。
随后，将HBV质粒和HBV asiRNA转染(transfection)至Hela细胞，然后确认由此导致的HBV抑制能力。具体地，使用lipofectamine 2000(ThermoFisher,Cat.11668019，0.25μl/孔)以将HBV asiRNA(1nM)和HBV质粒(25ng/孔)传递至Hela细胞内，并且，在从实施细胞内传递的时间点起24小时后，使用双荧光素酶报告基因系统(Dual luciferase reporterassay system)(Promega,Cat.E1960)来测量海肾(Renilla)和萤火虫荧光素酶强度(Firefly luciferase intensity)，并对测量结果与仅传递HBV plasmid(只有plasmid)的组的强度(intensity)进行比较来确认了asiRNA的HBV增殖抑制水平。
结果，如图2所示，确认了能够显著抑制HBV增殖的HBV asiRNA，其具体序列信息如以下表4所示。
【表4】
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(2)HBV asiRNA的增殖抑制能力评估
在本实施例中，针对上面导出的HBV asiRNA中的4种(asiHBV-020、asiHBV-032、asiHBV-044、asiHBV-082)评估了在小鼠肝细胞种的HBV抑制能力。具体地，通过流体动力注入法(Hydrodynamic injection)将HBV plasmid(20μg/小鼠)施用于小鼠，在从此6小时后，从所述小鼠分离出肝细胞。然后，使用lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher,Cat.13778150，0.1μl/100μl)将4种HBV asiRNA分别以1nM、10nM传递至细胞内。在从实施细胞内传递的时间点起24小时后，使用双荧光素酶报告基因测定系统(Dual luciferasereporter assay system)(Promega,Cat.E1960)使用了海肾和萤火虫荧光素酶强度，并对测量结果与仅使用lipofectamine RNAiMAX进行处理的组(Mock)的强度(intensity)进行比较来确认了HBV asiRNA的HBV增殖抑制水平。使用仅输送HBV plasmid的组(只有HDI)作为对照组。
结果，如图3所示，确认了根据HBV asiRNA(asiHBV-020、asiHBV-032、asiHBV-044、asiHBV-082)处理的HBV增殖抑制效果。这种效果是相比于仅传递HBV plasmid的组(只有HDI)和仅使用lipofectamine RNAiMAX处理的组更为显著，且显示出了取决于浓度的倾向。
实施例2：设计并制备导入化学修饰的HBV asiRNA。
在本实施例中，针对在所述实施例1中已确认增殖抑制效果的HBV asiRNA中的2种(asiHBV-032、asiHBV-082)设计了导入化学修饰的非对称siRNA(cell penetrating-asymmetric siRNA：cp-asiRNA)。在本实施例中，与所述asiRNA相比，所设计的cp-asiRNA是经过各种化学修饰(2'OMe、PS、氟代(Fluoro))的，且是一种至肝细胞内部的传递得以改善的非对称asiRNA。
在本实施例中制备的总8种cp-asiRNA的序列号如以下表5所示。
【表5】
*所述GalNAc为三价N-乙酰半乳糖胺(trivalent GalNAc)衍生物。
在所述表5中，由与有义链3'端结合的“trivalent GalNAc”表示的衍生物结构如由以下化学式1所示。
【化学式1】
并且，在所述表5中使用“*”、“m”、“f”、“P”、“EVP”标记的化学修饰如由以下表6所示。
【表6】
具体地，在所述表6中，“*”是指现有的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代，“m”是指现有的2'-OH被2'-O甲基取代。并且，例如对fG而言，“f”是指现有的(鸟嘌呤)的2'-OH被氟代取代，“P”是指磷酸基结合至5'端，“EVP”是指E-磷酸乙烯酯键结合至5'-端。例如，EVP-mU是指现有的U(鸟嘌呤)的2'-OH被2'-O-甲基取代且E-磷酸乙烯酯键结合至5'端。
实施例3：导入化学修饰的HBV asiRNA的增殖抑制能力评估
在本实施例中，针对在实施例2中导入化学修饰的8种HBV cp-asiRNA评估了在小鼠肝细胞内的HBV抑制能力。具体地，通过流体动力注入法将HBV plasmid(20μg/小鼠)施用于小鼠，并从此6小时后从所述小鼠分离出肝细胞。然后，使用各1nM、20nM或200nM的lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，Cat.13778150，0.1μl/100μl)将8种HBV cp-asiRNA传递至细胞内。在从实施细胞内传递的时间点起24小时后，使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量海肾和萤火虫荧光素酶强度，并对测量结果与仅传递HBV plasmid的组(只有HDI)的强度进行比较来确认了HBV ci-asiRNA的HBV增殖抑制水平。仅使用lipofectamine RNAiMAX进行处理的组(Mock)用作针对1nM转染组的阴性对照组。
结果，确认了根据8种HBV cp-asiRNA的处理的HBV增殖抑制效果，如图4所示。然后，针对在上文中导入化学修饰的HBV cp-asiRNA中的2种(OLX703A-032-1、OLX703A-082-1)，使用小鼠模型评估了HBV抑制能力。具体地，如图5所示，使用流体动力注入法将HBVplasmid(10μg/小鼠)施用于小鼠来构建HBV Plasmid HDI小鼠模型。同时，将2种HBV cp-asiRNA分别以3mg/kg，或9mg/kg皮下注入所述小鼠模型。在从实施所述皮下注入的时间点起48小时后，使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)来测量海肾和萤火虫荧光素酶强度，并对测量结果与仅传递HBV plasmid的组(Mock control)进行比较来确认了HBV cp-asiRNA的HBV增殖抑制水平。对各组使用了三只小鼠，对各只小鼠分析了肝组织内的2个区域。
结果，在体内确认了根据2种HBV cp-asiRNA处理的HBV增殖抑制效果，如图6所示。所述实验结果示出，根据一实施例的HBV asiRNA/HBV cp-asiRNA可以用于治疗与乙型肝炎病毒感染有关的疾病。
实施例4：附加设计并制备导入化学修饰的HBV asiRNA
在本实施例中，针对在所述实施例1中确认其增殖抑制效果的HBV asiRNA中6种(asiHBV-020、asiHBV-032、asiHBV-044、asiHBV-046、asiHBV-080、asiHBV-082)，附加设计了导入化学修饰的非对称siRNA(cell penetrating-asymmetric siRNA：cp-asiRNA)。在本实施例中，与所述asiRNA相比，所设计的cp-asiRNA是经过各种化学修饰的，且是一种至肝细胞内部的传递得以改善的非对称asiRNA。
另外，在用于确认本发明的HBV asiRNA和cp-asiRNA的以下实施例中，使用靶向Factor 9基因的cp-asiRNA(OLX700A-001-8)作为阴性对照组(negative control,NC)。
在本实施例中制备的总19种cp-asiRNA的序列信息记载于以下表7种，并在表8中记载了所述NC的序列信息。(*所述GalNAc为三价的N-乙酰半乳糖胺)。
【表7】
【表8】
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另一方面，在所述表7和表8中，与有义链3'端结合的GalNAc的结构如由所述化学式1表示。并且，在所述表7和表8中使用“*”、“m”、“f”、“P”以及“EVP”表示的化学修饰如由所述表6表示。
实施例5：导入化学修饰的HBV asiRNA增殖抑制能力评估
(1)In vivo水平的HBV增殖抑制能力评估
在本实施例中，对在所述实施例2和4中导入化学修饰的HBV cp-asiRNA使用Efficacy assay和Duration assay评估了HBV抑制能力(图7)。
首先，为了Efficacy assay，通过流体动力注入法将HBV质粒(20μg/小鼠)施用于BALB/c小鼠的尾静脉。将各GalNAc-asiRNA以3mg/kg浓度皮下注入于肩胛骨之间。在3天后，获得小鼠的肝组织中两个区域(左叶(left lobe)、尾状骨(caudate lobe))并将其投入1ml的1X蛋白裂解缓冲液(protein lysis buffer)中并使用均质机进行破碎。在13,000rpm、4℃下进行离心15分钟，并仅将上清移动至另外的管中。使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度。对测量结果与仅传递HBVplasmid的组(对照组)的强度进行比较来确认了GalNAc-asiRNA的HBV抑制程度。
结果，确认了根据18种HBV cp-asiRNA的HBV增殖抑制效果，其结果如图8所示。接着，为了Duration assay，将各GalNAc-asiRNA以3mg/kg浓度皮下注入于肩胛骨之间，在14天后，通过流体动力注入法将HBV plasmid(20μg/小鼠)施用于尾静脉。在3天后，获得小鼠的肝组织中两个区域(左叶(left lobe)、尾状骨(caudate lobe))并将其投入1ml的1X蛋白裂解缓冲液(protein lysis buffer)中并使用均质机进行破碎。在13,000rpm、4℃下进行离心15分钟，并仅将上清移动至另外的管中。使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度。对测量结果与仅传递HBV plasmid的组(对照组)的强度进行比较来确认了GalNAc-asiRNA的HBV抑制程度。
结果，如图9所示，确认了根据6种HBV cp-asiRNA处理的HBV增殖抑制效果，还确认了所述HBV cp-asiRNA可以在活体内在长时间稳定地显示出活性。
(2)In vitro水平的HBV增殖抑制能力评估
在本实施例中，针对在所述实施例2和4中的导入化学修饰的HBV cp-asiRNA中的6种，评估了在细胞水平(In vitro)的HBV抑制能力。
具体地，使用表达HBV的HepG2.2.15细胞株执行了实验，并使用了3种asiRNA(asiHBV-020、asiHBV-046、asiHBV-082)以及其GalNAc-asiRNA。使用lipofectamineRNAiMAX(ThermoFisher，Cat.13778150，4ml/孔)将所述siRNA以10nM浓度传递至细胞内。在培养3天后，使用ELISA，从上清中确认出HBsAg、ABeAg的水平，从细胞中使用qPCR确认出HBVDNA的表达水平。
结果如图11所示，确认了靶向P/S和P/S/X的所述HBV asiRNA以及其GalNAc-asiRNA都有效地抑制HBV。
(3)使用AAV-HBV小鼠模型的HBV增殖抑制能力评估
在本实施例中，针对在所述实施例4中的导入化学修饰的HBV cp-asiRNA中的3种，在AAV-HBV小鼠模型中使用Efficacy assay评估了HBV抑制能力(图12)。
具体地，由Wuxi AppTec Co.,Ltd.执行在AAV-HBV小鼠模型中的efficasy assay。在使用物质30天前，将AAV-HBV 1.0×1011viral titer静脉注入(i.v injection)C57B/L6小鼠来产生AAV-HBV小鼠模型。在物质施用日(第0天)，将GalNAc-asiRNA以9mg/kg通过皮下注入施用于所述小鼠模型。以两次/周采集血液总28天，通过ELISA测量了血中HBsAg、HBeAg的水平，并通过qPCR测量了HBV DNA的表达水平。在施用物质30天后，通过小鼠肝组织，并通过免疫组化(immunohistochemical；IHC)确认了HBsAg。
结果，确认所处理的3种HBV cp-asiRNA可以在长时间有效地抑制HBV增殖，如图13所示。并且，根据获得小鼠肝组织并执行免疫组化的结果，确认HBsAg在Saline组中表达在细胞质或细胞膜中，但在施用HBV cp-asiRNA的组织中的表达却显著减少了，如图14所示。
实施例6：对靶向HBV的RNAi诱导双联核酸分子的改良
在本实施例中，制备了通过修饰在所述实施例5中表现出优异的HBV增殖抑制能力的asiHBV-082的有义链或反义链序列的长度而获得的HBV asiRNA，其具体序列信息如以下表9所示。
【表9】
随后，针对所示HBV asiRNA设计了导入化学修饰的非对称siRNA(cellpenetrating-asymmetric siRNA：cp-asiRNA)。在本实施例中，与所述asiRNA相比，所设计的cp-asiRNA是经过各种化学修饰的，且是一种至肝细胞内部的传递得以改善的非对称asiRNA。
在本实施例中制备的总22种cp-asiRNA的序列信息如以下表10所示(*所述GalNAC为trivalent GalNAc衍生物)。
【表10】
另一方面，在所述表10中，与有义链3’端结合的GalNAc的结构如由所述化学式1表示。并且，在所述表9中，使用“*”、“m”、“f”、“P”以及“EVP”标记的化学修饰如所述表6所示。
实施例7：对导入化学修饰的HBV asiRNA的增殖抑制能力评估
(1)In vitro水平的HBV增殖抑制能力评估
在本实施例中，针对在所述实施例6中的导入化学修饰的HBV cp-asiRNA中的20种，评估了在细胞水平(In vitro)的HBV抑制能力。
具体地，从C57B/L6小鼠中分离出肝细胞(hepatocyte)以1×104细胞/孔进行接种后，使用两种浓度(200nM、20nM)对16/21(asiHBV-103)和17/21(asiHBV-107)形式的GalNAc-asiRNA进行处理。在24小时后，使用lipofectamine 2000(ThermoFisher,Cat.11668019，0.2μl/孔)将HBV plasmid 50ng传递至细胞内。在24小时后，使用维持培养基(maintenance media)替代培养基，再培养24小时后，使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度。对测量结果和进行NC处理的对照组的intensity进行比较来确认了GalNAc-asiRNA的HBV抑制程度。
结果，确认了根据20种HBV cp-asiRNA处理的HBV增殖抑制效果，如图15所示。
(2)In vivo水平的HBV增殖抑制能力评估
在本实施例中，对在所述实施例6中导入化学修饰的HBV cp-asiRNA中的6种或3种使用Efficacy assay和Duration assay评估了HBV抑制能力(图16)。
首先，为了功效测定，通过流体动力注射将HBV质粒(10μg/小鼠)施用于BALB/c小鼠的尾静脉。将各GalNAc-asiRNA以0.5mg/kg浓度皮下注入于肩胛骨之间。在3天后，获得小鼠的肝组织中两个区域(左叶(left lobe)、尾状骨(caudate lobe))并将其投入0.5ml的1X蛋白裂解缓冲液(protein lysis buffer)中并使用均质机进行破碎。在13,000rpm、4℃下进行离心15分钟，并仅将上清移动至另外的管中。使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度。对测量结果与仅传递HBVplasmid的组(对照组)的强度进行比较来确认了GalNAc-asiRNA的HBV抑制程度。
结果，确认了7种HBV cp-asiRNA具有优异的HBV增殖抑制效果，如图17所示。接着，为了功效测定，将各GalNAc-asiRNA以1mg/kg浓度皮下注入于肩胛骨之间，在14天后，通过流体动力注入法将HBV plasmid(10μg/小鼠)施用于尾静脉。在3天后，获得小鼠的肝组织中两个区域(左叶(left lobe)、尾状骨(caudate lobe))并将其投入0.5ml的1X蛋白裂解缓冲液(protein lysis buffer)中并使用均质机进行破碎。在13,000rpm、4℃下进行离心15分钟，并仅将上清移动至另外的管中。使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度。对测量结果与仅传递HBV plasmid的组(对照组)的强度进行比较来确认了GalNAc-asiRNA的HBV抑制程度。
结果，确认了4种HBV cp-asiRNA能够在活体内在长时间表现出优异的HBV增殖抑制功效，如图18所示。
(3)IC50评估
在本实施例中对3种HBV asiRNA(OLX703A-83、OLX703A-103以及OLX703A-107)的IC50。
具体地，将Hela细胞株8×103/孔接种于96孔板中，第2天，使用lipofectamine2000(0.2μm/100ml)对各物质与HBV plasmid 25ng以0.001nM至3nM浓度进行共转染(co-transfection)。培养24小时后，用新培养基替代培养基，并再培养24小时。使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度，对测量结果与仅传递HBV plasmid的组(对照组)的intensity进行了比较与确认。
结果，确认了3种HBV cp-asiRNA表现出显著地低的IC50，如图19所示。
实施例8：导入E-VP修饰的HBV asiRNA的增殖抑制能力评估
在本实施例中，评估了通过将E-VP(E-Vinylphosphonate)附加导入已导入化学修饰的HBV cp-asiRNA中的反义链序列的5'端而获得的变体的HBV抑制能力。
具体地，将E-VP修饰导入OLX703A-082-12、OLX703A-103-91以及OLX703A-107-19的反义链序列的5'，并各自命名为OLX703A-082-17、OLX703A-103-101以及OLX703A-107-55。随后，通过流体动力注入法将HBV plasmid(20μg/小鼠)施用于BALB/c小鼠的尾静脉。将各GalNAc-asiRNA以不同浓度(3mg/kg、9mg/kg)皮下注入于肩胛骨之间。在3天后，获得小鼠的肝组织中两个区域(左叶(left lobe)、尾状骨(caudate lobe))并将其投入0.5ml的1X蛋白裂解缓冲液(protein lysis buffer)中并使用均质机进行破碎。使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega，Cat.E1960)测量了海肾和萤火虫荧光素酶强度。通过与对NC的HBV一直浓度的强度确认了GalNAc-asiRNA的HBV抑制程度。
结果，确认了导入EVP的3种HBV cp-asiRNA具有优异的HBV增殖抑制效果，如图20所示。
虽然上文中详细描述了本发明内容中的特定部分，对于本领域普通技术人员，这些具体技术仅是优选的实施方式且本发明的范围不限于本发明是显而易见的。因此，本发明的实际范围应当取决于所附权利要求书和其等同物。
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<400> 67
ugugccuucu caucua 16
<210> 68
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-082 antisense
<400> 68
uagaugagaa ggcacagac 19
<210> 69
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-085 sense
<400> 69
ugccaacugg auccua 16
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-085 antisense
<400> 70
uaggauccag uuggcagca 19
<210> 71
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-086 sense
<400> 71
ugcugccaac uggaua 16
<210> 72
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-086 antisense
<400> 72
uauccaguug gcagcacag 19
<210> 73
<211> 16
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-103 sense
<400> 73
ugugccuucu caucua 16
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-103 antisense
<400> 74
uagaugagaa ggcacagacg g 21
<210> 75
<211> 17
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-107 sense
<400> 75
cugugccuuc ucaucua 17
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> asiHBV-107 antisense
<400> 76
uagaugagaa ggcacagacg g 21

Claims (11)

1.一种用于抑制乙型肝炎病毒表达的RNAi制剂，所述RNAi制剂包括有义链和反义链，其中，
所述反义链具有19nt至23nt的长度；
所述有义链具有15nt至17nt的长度，与所述反义链形成互补键，且包括选自由序列号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、37、39、41、43、45、47、49、51和53组成的组中的序列，还包括多价的半乳糖或N-乙酰半乳糖胺衍生物；以及
所述反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端。
2.根据权利要求1所述的RNAi制剂，其中，所述反义链包括选自由序列号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、38、40、42、44、46、48、50、52和54组成的组中的序列。
3.根据权利要求1或2所述的RNA制剂，其中，所述有义链包括三价的N-乙酰半乳糖胺衍生物。
4.根据权利要求1或2所述的RNA制剂，其中，所述RNAi制剂的有义链或反义链包括选自以下的一个或多个化学修饰：
在核苷酸内糖结构的2'碳位置的-OH基被-CH3、-OCH3、-NH2、-F、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-0-2-(甲硫基)乙基、-0-3-氨丙基，或-0-3-二甲氨基丙基取代；
核苷酸内糖结构内的氧被硫取代；
核苷酸键被修饰为硫代磷酸酯、磷酸硼，或磷酸甲酯；
被修饰为肽核酸、锁核酸，或未锁核酸形式；以及
与磷酸基、E-磷酸乙烯酯或细胞侵入肽结合。
5.一种用于抑制乙型肝炎病毒表达的RNAi制剂，所述RNAi制剂包括有义链和反义链，其中，
所述反义链具有19nt至23nt的长度；
所述有义链具有15nt至17nt的长度，与所述反义链形成互补键，包括选自由序列号21、23、25、27、29、31、33、35、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73和75组成的组中的序列，还包括多价半乳糖或N-乙酰半乳糖胺衍生物；以及
所述反义链的5'端和有义链的3'端形成钝端。
6.根据权利要求5所述的RNAi制剂，其中，所述反义链选自由序列号22、24、26、28、30、32、34、36、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74和76组成的组中的序列。
7.根据权利要求5或6的RNAi制剂，其中，所述有义链包括三价N-乙酰半乳糖胺衍生物。
8.根据权利要求5或6的RNAi制剂，其中，所述RNAi制剂的有义链或反义链包括选自以下的一个或更多化学修饰：
在核苷酸内糖结构的2'碳位置的-OH基被-CH3、-OCH3、-NH2、-F(氟代)、-O-2-甲氧基乙基-O-丙基、-0-2-(甲硫基)乙基、-0-3-氨丙基，或-0-3-二甲氨基丙基取代；
核苷酸内糖结构的氧被硫取代；
核苷酸键被修饰为硫代磷酸酯、磷酸硼，或磷酸甲酯；
被修饰为肽核酸、锁核酸，或未锁核酸形式；以及
与磷酸基、E-磷酸乙烯酯或细胞侵入肽结合。
9.一种RNAi制剂，包括有义链和反义链且用于抑制乙型肝炎病毒，其中，所述RNAi制剂包括选自由以下(a)至(m)组成的组中的一条反义链：
(a)P-mU*fA*mCfGmAfAmCfCmAfCmUmGmAfAmC*fA*mA*fA*mU；
(b)P-mU*fA*mCmGmAfAmCfCfAmCmUmGmAfAmC*fA*mA*mA*mU；
(c)P-mU*fA*mGfAmUfGmAfGmAfAmGmGmCfAmC*fA*mG*fA*mC；
(d)P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC；
(e)P-mU*fA*mGfAmGfGmAfCmAfAmAmCmGfGmG*fC*mA*fA*mC；
(f)P-mU*fC*mAfGmAfUmGfAmGfAmAmGmGfCmA*fC*mA*fG*mA；
(g)P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC；
(h)P-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC；
(i)EVP-mU*fA*mGmAmUmGfAmGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC；
(j)P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG；
(k)EVP-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmC*fA*mG*mA*mC*mG*mG；
(l)P-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG；以及
(m)EVP-mU*fA*mGmAmUfGmAfGfAmAmGmGmCfAmCfAmG*mA*mC*fG*mG；
其中，*是指被修饰为硫代磷酸酯键，m是指被2'-OCH3的取代，f是指被2'-F取代、P是指与5'-磷酸基结合，EVP是指与5'-E-磷酸乙烯酯结合。
10.一种RNAi制剂，其包括有义链和反义链且用于抑制乙型肝炎病毒，其中，所述RNAi制剂包括选自由以下(A)至(M)组成的组中的一条有义链：
(A)mU*fG*mUfUfCfAmGfUmGfGmUfUmCfGmUfA-GalNAc；
(B)mU*fG*mUfUfCfAmGmUmGmGmUmUmCmGmUmA-GalNAc；
(C)mU*fG*mUfGfCfCmUfUmCfUmCfAmUfCmUfA-GalNAc；
(D)mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUmCmUmA-GalNAc；
(E)mG*fC*mCfCfGfUmUfUmGfUmCfCmUfCmUfA-GalNAc；
(F)mG*fU*mGfCfCfUmUmCmUmCmAmUmCmUmGmA-GalNAc；
(G)mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc；
(H)mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCmAmUfCmUfA-GalNAc；
(I)mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc；
(J)mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc；
(K)mU*fG*mUfGfCfCmUmUmCmUmCfAmUmCmUmA-GalNAc；
(L)mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc；以及
(M)mC*mU*fGmUfGfCfCmUmUmCmUfCfAmUmCmUmA-GalNAc；
其中，*是指被修饰为硫代磷酸酯键，m是指被2'-OCH3取代，f是指被2'-F取代，且GalNAc是指结合至3'端的三价N-乙酰半乳糖胺衍生物。
11.一种用于改善或治疗起因于乙型肝炎病毒感染的疾病的药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1、权利要求2、权利要求5、权利要求6、权利要求9，以及权利要求10中的任一项所述的RNAi制剂作为有效成分。
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