CN115087451A - 用于抑制乙型肝炎和丁型肝炎病毒感染的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及通过抑制酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12和/或微管‑肌动蛋白交联因子1的活性用于抑制参与HBV SVP的组装和或分泌的蛋白的方法。

Description

用于抑制乙型肝炎和丁型肝炎病毒感染的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请主张2020年2月21日提交的美国临时申请号62/979,442和2020年9月16日提交的美国临时申请号63/078,939的优先权，该申请的内容以其全部作为参考并入本文。
技术领域
本公开涉及通过靶向参与HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和分泌的多种新型蛋白用于抑制乙型肝炎(HBV)或丁型肝炎(HDV)病毒感染的组合物和方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是肝病毒科(Hepadnaviridae)的包膜病毒。这种病毒是造成最大规模的已知大流行性病毒感染的原因，其影响全世界超过20亿人并且使这些个体中超过3亿人患有慢性肝感染。每年，有约870,000例可归因于HBV感染影响的死亡。为了满足这种疾病治疗的需要，已批准了几种药物用于HBV治疗，其包括免疫疗法，如PEG化干扰素和胸腺素α1以及多种HBV反转录酶的核苷(酸)类似物抑制剂，如恩替卡韦和替诺福韦酯延胡索酸盐。然而，尽管这些药物可以抑制病毒在肝脏中的复制，但是它们对HBV亚病毒颗粒(SVP)的产生具有很少或没有效果。这些SVP提供循环乙型肝炎表面抗原蛋白(HBsAg)的本体并且可以使用整合的HBV DNA作为基因来源由复制独立产生。循环HBsAg是最丰富的循环病毒抗原并且在抑制对HBV感染的免疫应答中具有重要功能。广泛承认在不存在治疗的情况下HBsAg的持续清除是感染免疫控制的正确恢复以及正常肝功能恢复(功能性治愈)的最佳标志物并且是目前处于开发中的新疗法的目标。照此，仍需要可以有效靶向SVP生产的更有效的HBV治疗。
目前仅有的处于开发中的已证实在HBV和HDV感染的疗法和功能性治愈(在不存在疗法的情况下HDV RNA的持续清除)期间实现HBsAg高速清除的能力的疗法是核酸聚合物(NAP)。NAP选择性干扰SVP的组装和分泌且不影响病毒颗粒或其它病毒抗原如肝炎E抗原的产生或分泌。然而，到目前为止对于SVP或者驱动它们在HBV和HDV感染中的抗病毒作用的NAP的靶标的组装和分泌的潜在分子机制知之甚少。
HDV是缺陷型病毒，它被认为是需要来源于HBV基因组的HBsAg以形成其包膜的HBV的卫星感染。HDV的HBsAg同工型组成与HBV SVP的相同，这表明对于HBV SVP和HDV的组装和或分泌使用了类似的机制。因此，将期望通过抑制参与HBV SVP和HDV的组装和或分泌的靶标，提供用于HBV和或HDV感染的更有效的治疗。
发明内容
根据本公开，目前提供了用于抑制HBV感染或HBV/HDV共感染的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者抑制以下蛋白中的一种或多种的功能的药用小分子：酪蛋白激酶I同工型δ(casein kinase I isoform delta)、DNAJB12或者微管-肌动蛋白交联因子1(microtubule-actin crosslinking factor 1)。
还提供了用于抑制HBV感染或HBV/HDV共感染的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者与以下蛋白中的一种或多种的mRNA的任意部分互补的药用反义寡核苷酸：酪蛋白激酶I同工型δ、DNAJB12或者微管-肌动蛋白交联因子1。
还提供了用于抑制HBV感染或HBV/HDV共感染的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者与以下蛋白中的一种或多种的mRNA的任意部分互补的药用合成干扰RNA(siRNA)：酪蛋白激酶I同工型δ、DNAJB12或者微管-肌动蛋白交联因子1。
还提供了用于抑制HBV感染或HBV/HDV共感染的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者与以下蛋白中的一种或多种的mRNA的任意部分互补的药用CRISPR相关核酸内切酶和向导RNA(gRNA)：酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12或者微管-肌动蛋白交联因子1。
还提供了组合物，该组合物包含抑制以下蛋白中的一种或多种的功能的药用小分子：酪蛋白激酶I同工型δ、DNAJB12或微管-肌动蛋白交联因子1。
还提供了组合物，该组合物包含与以下蛋白中的一种或多种的mRNA的任意部分互补的药用反义寡核苷酸：酪蛋白激酶I同工型δ、DNAJB12或微管-肌动蛋白交联因子1。
还提供了组合物，该组合物包含与以下蛋白中的一种或多种的mRNA的任意部分互补的药用合成干扰RNA(siRNA)：酪蛋白激酶I同工型δ、DNAJB12或微管-肌动蛋白交联因子1。
还提供了用于抑制HBV感染或HBV/HDV共感染的组合物，该组合物包含与以下蛋白中的一种或多种的mRNA的任意部分互补的药用CRISPR相关核酸内切酶和向导RNA(gRNA)：酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12或者微管-肌动蛋白交联因子1。
在一个实施方式中，小分子是寡核苷酸。
在其它实施方式中，寡核苷酸是与酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12或微管-肌动蛋白交联因子1的mRNA的任意部分互补的反义寡核苷酸、合成干扰RNA或者CRISPR相关核酸内切酶和向导RNA(gRNA)。
在一个实施方式中，小分子是具有SEQ ID NO：12、13或17中所示序列的反义寡核苷酸。
在替代实施方式中，小分子是具有SEQ ID NO：5、6、10、12、13或17中所示序列的合成干扰RNA。
在其它实施方式中，小分子是具有包含SEQ ID NO：5、6、10、12、13或17中所示序列的向导RNA的CRISPR-Cas9。
在其它实施方式中，寡核苷酸包含修饰的核碱基。
在补充实施方式中，寡核苷酸是单链或双链的。
在另一个实施方式中，寡核苷酸是Speigelmer或适体。
在一个实施方式中，寡核苷酸包含磷酸二酯键中、糖上和碱基上的至少一种修饰。
在另一个实施方式中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、2'-O-甲基修饰、2'-氨基修饰、2'-卤代修饰、非环核苷酸类似物、3'-帽和/或5'-帽、胞嘧啶碱基的5'甲基化和尿嘧啶碱基的4'巯基化(thioation)中的至少一种。
在其它实施方式中，本文所涵盖的组合物还包含由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4组成的至少一种核酸聚合物。
在另一个实施方式中，本文所限定的方法和组合物抑制HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌。
还提供了抑制患者中HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌的方法，包括给予本文所限定的组合物的任一种。
还提供了本文所限定的组合物用于抑制患者中HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌的用途。
还提供了用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎感染的方法，包括给予需要治疗的受试者有效量的抑制酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12和微管-肌动蛋白交联因子1的活性的药用小分子。
还提供了本文所限定的组合物用于抑制患者中HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌的用途。
附图说明
现将参考附图，并且其中：
图1显示了选择性蛋白靶标与REP 2139相对于与REP 2147的相互作用的火山图。每个点代表与REP 2139或REP 2147相互作用的蛋白。较浅的点表示选择比>2(REP 2139：REP 2147)的那些蛋白，其中p<0.05。较深的点表示6个所识别的候选。
图2显示了选择性蛋白靶标与REP 2139相对于与REP 2179的相互作用的火山图。每个点代表与REP 2139或REP 2179相互作用的蛋白。较浅的点表示选择比>2(REP 2139：REP 2179)的那些蛋白，其中p<0.05。较深的点表示6个所识别的候选。
图3显示了在存在实施例1所述的NAP相互作用子的靶标的shRNA-介导的敲低的情况下，HepG2.2.15细胞中HBsAg分泌的抑制。空白，无shRNA；CSNK1D，酪蛋白激酶1同工型δ；CopE，外被体亚基ε；CSNK1A1，酪蛋白激酶1同工型α1；TBL2，转导β-样蛋白2；MACF1，微管-肌动蛋白交联因子1；CopA，外被体亚基α。
具体实施方式
根据本公开，目前提供了通过使用抑制以下蛋白的一种或多种的功能的小分子用于抑制HBV感染或HBV/HDV共感染的方法：酪蛋白激酶I同工型δ、DNAJB12或微管-肌动蛋白交联因子1。
HBV使全世界3亿个体患病并且每年导致估计870,000例由HBV感染所造成的并发症引起的死亡。尽管已批准使用几种抗病毒治疗，但是除了在一小部分经历治疗的患者中以外，这些无一能够引起能够提供长期感染控制的治疗有效的免疫应答。
HBV感染导致产生多种不同颗粒，包括：1)传染性HBV成熟病毒颗粒(或者戴恩颗粒)，其包括从HBV核心抗原蛋白(HBcAg)组装的病毒衣壳并且被HBV表面抗原(HBsAg)覆盖和2)非传染性丝，是由缺陷型病毒颗粒/衣壳相互作用所造成的和3)非传染性球状亚病毒颗粒(或SVP)，它是由脂质、胆固醇、胆固醇酯和HBV表面抗原(HBsAg)组成的高密度脂蛋白样颗粒。对于所产生的每个病毒颗粒，10,000-100,000个SVP被释放至血液。照此，SVP(和它们所携带的HBsAg蛋白)占血液中病毒蛋白的绝大多数。HBV感染的细胞还分泌被称为HBVe-抗原(HBeAg)的前核心蛋白的可溶性蛋白水解产物。
HDV是缺陷型病毒并且使用来源于共存的HBV感染的HBsAg以形成其病毒包膜(Taylor，2006，Virology，344:71-76)，并且照此，HDV感染仅可以在患有伴随HBV感染的受试者中发生。尽管HDV在无症状HBV携带者和慢性HBV相关肝病中共感染的发病率在HBV感染低发国家中较低，但在HBV感染高发国家中HBV感染的受试者中，它是显著的并发症并且可以提高肝病向肝硬化发展的速率。HBV感染中未满足的医学需求在HBV/HDV共感染受试者中更加急迫，因为尚无直接靶向HDV病毒的具体批准的试剂并且患者甚至对于使用已批准用于HBV治疗的试剂的组合疗法的反应比患有HBV单一感染的患者中更差。
当前批准用于HBV的治疗包括基于干扰素-α或者胸腺素α1的免疫疗法和通过核苷/核苷酸类似物抑制HBV聚合酶对病毒产生的抑制。HBV聚合酶抑制剂在减少感染性病毒颗粒的产生中有效，但是在减少HBsAg中效果较小或无效果，或者仅在有限数量的患者中通过长期治疗非常缓慢地减少HBsAg(Fung等人，2011，Am.J.Gasteroenterol.，106:1766-1773；Reijnders等人,2011,J.Hepatol.，54:449-454)。HBV聚合酶抑制剂的主要效果是阻断前基因组病毒mRNA向存在于感染性病毒颗粒中的部分双链DNA的转化。基于干扰素的免疫疗法可以实现感染性病毒的减少和HBsAg从血液的去除，但是仅在小部分治疗受试者中有效。
HBsAg在HBV感染和HBV/HDV共感染中起关键作用。除了其作为病毒颗粒形成的基本结构部件的作用以外，HBsAg还以亚病毒颗粒(SVP)形式大量释放到感染受试者的血液中，亚病毒颗粒缺少病毒衣壳和基因组并且似乎主要起将HBsAg递送到血液的作用。相对于戴恩颗粒，以10,000-100,000倍过量从感染细胞分泌SVP，这使得SVP能够有效隔离(sequester)HBsAg抗体(抗-HB)，使得血液中的HBV或HDV病毒可以逃逸适应性免疫的识别。几项研究还表明HBsAg直接阻断对HBV感染的适应性和先天性免疫应答的激活(Vaillant，ACS Infectious Diseases 2020，12月10日提前于印刷版在线发表)。先前已在US 2014/0065102 A1中描述了这种官能团在人HBV感染中的存在及其对免疫治疗剂的活性以及这些抗病毒效果在HBV/HDV共感染中的其它可应用性的影响，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。
慢性HBV感染的另一个关键特征是HBV遗传信息在感染细胞的核中的稳定储库的建立，稳定储库由共价闭环DNA(cccDNA)(它也被称为HBV极微染色体)和染色体整合的HBVDNA组成。cccDNA在核内以多拷贝存在，并且作为用于产生编码所有病毒蛋白质的mRNA的转录模板和用于产生新病毒颗粒的未成熟基因组(前基因组RNA)起作用。整合的HBV DNA无法产生前基因组RNA并因此无法产生病毒颗粒。然而，它可以作为HBsAg(和SVP)的独立来源存在，不受直接靶向病毒复制的抗病毒方法的影响。
术语寡核苷酸(ON)是指核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物。该术语包括由修饰的核碱基(包括5'甲基胞嘧啶和4'硫脲嘧啶)、糖和共价核苷间(主链)键所组成的ON以及具有起类似作用的非天然存在部分的ON。由于所期望的性质如例如降低的免疫反应性、增强的细胞吸收、对核酸靶标增强的亲和力(在反义ON、siRNA和shRNA的背景中)和/或对核酸酶介导的降解提高的稳定性，这些修饰或取代的ON相对于天然形式可能是优选的。ON也可以是双链的。ON还包括单链分子如反义寡核苷酸、Speigelmer和适体以及miRNA，以及双链分子如小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
ON可以包括多种修饰，例如，稳定修饰，并因此可以包括磷酸二酯键中和/或糖上和/或碱基上的至少一种修饰。例如，ON可以无限制地包括一种或多种修饰，或者可以是完全修饰的以含有具有所列修饰的所有键或糖或碱基。修饰的键可以包括硫代磷酸酯键和二硫代磷酸酯键。尽管修饰的键是有用的，但是ON可以包括磷酸二酯键。其它有用的修饰无限制地包括在糖的2'-位的修饰，包括2'-O-烷基修饰如2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)、2'-氨基修饰、2'-卤代修饰如2'-氟代；非环核苷酸类似物。其它2'修饰也是本领域中已知的并且可以使用这些修饰如锁核酸。具体地，ON在整体中具有修饰的键或者每个键都被修饰，例如，硫代磷酸酯；具有3'-和/或5'-帽；包括末端3'-5'键；ON是或包括由通过接头连接的两个或更多个ON序列所组成的多联体。碱基修饰可以包括胞嘧啶碱基的5'甲基化(5'甲胞嘧啶或者在核苷酸的背景中，5'甲基胞苷)和/或尿嘧啶碱基的4'巯基化(4'硫脲嘧啶或者在核苷酸的背景中，4'硫脲核苷)。不同的化学相容性修饰的键可以组合，其中合成条件是化学相容的，如使寡核苷酸具有硫代磷酸酯键、2'核糖修饰(如2'O-甲基化)和修饰的碱基(如5'甲基胞嘧啶)。可以用所有这些不同的修饰来进一步完全修饰ON(例如，使每个键硫代磷酸酯化、每个核糖被2'修饰并且每个碱基被修饰)。
如本文所涵盖的，术语“核酸聚合物”或NAP是任何单链ON，其不包含序列特异性官能团，以与核酸靶标杂交或采用导致结合至特异性蛋白的序列特异性二级结构。NAP的生化活性不依赖于ON的Toll样受体识别、与靶标核酸的杂交或者需要来源于特定核苷酸存在顺序的特异性二级/三级ON结构的适体相互作用。NAP可以包括在US 8,067,385、US 8,008,270、US 8,513,211和US 8,008,269中所述的碱基和或键和或糖的修饰。NAP需要磷硫酰化以具有抗病毒活性和发挥它们的抗病毒作用的长度(通常大于20个核苷酸)。
设计单链或双链的反义ON(例如，合成干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA))以通过反义ON和所关心的mRNA的靶向部分中的序列之间的特异性杂交靶向信使RNA(mRNA)或微小RNA(miRNA)的特定区域。当将反义ON引入细胞时，它们导致mRNA上或者与指导这种特异性mRNA的降解的miRNA或通过RNA酶H的miRNA形成双螺旋区。当将siRNA引入细胞(或者在细胞中表达shRNA)时，将反义链(或引导链)引入RISC(RNA诱导的沉默复合体)，RISC使用向导链靶向的与靶标mRNA上的互补区的杂交通过被称为Argonaute的RISC的催化组分来实施它的切割。反义和siRNA的鉴定、设计和优化在本领域中是非常明确的并且仅需要靶标mRNA的序列。
CRSPR-Cas9使用CRISPR相关核酸内切酶(Cas9蛋白)的活性和工程化以靶向所关心的基因的向导RNA(gRNA)。一致地，gRNA将Cas9活性导向所关心的基因以在缺陷型序列中剪接，因此永久性防止功能性mRNA的转录。CRISPR-Cas9的鉴定、设计和优化在本领域中是非常明确的并且仅需要靶标基因的序列。
寡核苷酸适体是采用由于通过这些寡核苷酸所形成的三维结构所造成的序列特异性和选择性蛋白相互作用的寡核苷酸。可以合理设计适体或者可以使用通过指数富集的配体系统进化(SELEX)和所关心的蛋白靶标，从简并文库选择适体。还可以从L-核糖核苷酸构建适体，L-核糖核苷酸对核酸酶降解高度耐受，其也称为Speigelmer。还可以如以上对于寡核苷酸所述修饰适体以优化蛋白相互作用的特异性和/或强度以及优化它们的药物适合性。
通过参考以下实施例，将更容易理解本公开。
实施例I
NAP的靶标相互作用子的鉴定
NAP的抗病毒活性的生物学基础是这些聚合物与两亲性α螺旋的暴露疏水表面的相互作用(Vaillant，2019，ACS Inf Dis，10:675-687)。当前的引导NAP是REP 2139(参见表1；SEQ ID NO：1)，具有序列(2'OMe腺苷酸，2'OMe-5-Me胞苷)20的完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸。已表明这种NAP在HBeAg阳性和阴性慢性感染以及在HBV/HDV共感染中是安全的、良好耐受的并且对多种HBV基因型的感染具有有效活性(Vaillant，2019，ACS Inf Dis，10:675-687)。沿聚合物长度的2'OMe修饰的存在不影响抗病毒活性(Al-Mahtab等人，2016，PLoSONE，11:e0156667；Roehl等人，2017，Mol Ther Nuc Acids，8:1-12)，但是提高了沿聚合物长轴的水合，这改善水溶性并且降低脱靶相互作用。NAP REP 2147(SEQ ID NO：2)是REP2139的非硫代磷酸酯化对应物(参见表1)，它是非活性的。NAP REP 2179(SEQ ID NO：3)是REP 2139的20聚体对应物并且也是非活性的(Blanchet等人，2019，Antiviral Res.，164:97-105)。这3种NAP提供了生物学验证的选择工具，以识别参与SVP组装和或分泌的宿主蛋白靶标。
表1：在靶标识别中使用的生物素化的NAP
Figure BDA0003790720620000111
HepG2.2.15细胞是HBV感染的体外模型，其概括了病毒颗粒和SVP的产生并且其中NAP的生物学反应与体内和人研究两者中所观察到的那些相当(Al-Mahtab等人，2016，PLoSONE，11:e0156667；Bazinet等人，2017，Lancet Gastro Hepatol，12:877-889；Quinet等人，2018，Hepatol，67:2127-2140；Blanchet等人，2019，Antiviral Res，164:97-105)。从这些细胞制备细胞裂解液并用生物素化的REP 2139、REP 2147和REP 2179探查，重复三次。对于每种NAP，通过质谱鉴别结合的蛋白。然后，将选择过程应用于这3种蛋白亚型以识别相对于REP 2147选择性结合REP 2139的蛋白和相对于REP 2179选择性结合REP 2139的蛋白。图1和2中显示了这些分析的火山图，这些图将相对富集比(x轴)相对于这种富集的统计显著性绘图。这种选择过程鉴别相对于REP 2147选择性结合REP 2139的299个蛋白候选，和相对于REP 2179选择性结合REP 2139的82个候选。
从这些鉴别的蛋白，鉴别了最终的候选，它们对于相对于REP 2147与REP 2139的结合以及相对于REP 2179与REP 2139的结合显示出最大的选择性，并且它们不具有先前表征的DNA/RNA结合活性。将这些蛋白鉴别为：
1.酪蛋白激酶I同工型δ(CSNK1 D)，其参与调节基于微管的囊泡运输
2.DNAJB12，具有先前未表征的功能的ER驻留侣伴蛋白
3.外被体亚基ε(COPE)，其参与囊泡形成并使从ER向高尔基体的转运逆行
4.酪蛋白激酶I同工型α(CSNK1A)，参与调节基于微管的囊泡运输
5.转导蛋白β样蛋白2(TBL-2)_，涉及ER应激反应中信号转导的ER驻留膜内在蛋白
6.微管-肌动蛋白交联因子1(MCAF-1)，在细胞周边参与细胞骨架相互作用的蛋白
所有上述蛋白与NAP的相互作用证实了相同结构结合关系，如对于使用NAP的抗病毒活性所观察到的。这种筛选方法首次鉴别了新型NAP相互作用子，其符合对于体外和体内抗HBV的NAP所建立的结构功能关系。所有这些靶标参与胞内蛋白形态发生或运输和分泌，并且是抑制HBV SVP的形态发生和分泌的NAP靶向的蛋白的候选。照此，所有这些新型蛋白代表抑制SVP组装和分泌的正确表征的潜在治疗靶标。涉及所述蛋白功能抑制(使用基于小分子的方法)或者所述蛋白产生降低(使用反义寡核苷酸或合成干扰RNA)的用于治疗HBV感染的方法和组合物将对于HDV感染同样有效。
实施例II
NAP的靶标相互作用子的验证
为了检验以上在SVP组装和或分泌中所鉴别的每种NAP相互作用子的潜在作用，使用shRNA法敲低了它们在HepG2.2.15细胞中的表达。将其中NAP相互作用子不是尺寸选择性的离群蛋白(COPA)选作阴性对照。
将慢病毒构建体用作短发夹RNA(shRNA)表达的载体。psPAX2、pMD2.G和pRSV-REV质粒购自Addgene。使用
Figure BDA0003790720620000131
在线工具(https://www.sigmaaldrich.com)鉴别用于特异性敲低的靶标序列(表2)并将其克隆至慢病毒质粒MISSION pLK0.1-puro。通过用pLK0.1-puro衍生物与包装质粒psPAX2、pMD2.G和pRSV-REV一起转染HEK293T细胞，产生慢病毒载体。在转染后2天收集来自这些转染细胞的上清液，澄清并过滤(0.45μm)。
表2：用于设计shRNA的靶标序列
Figure BDA0003790720620000141
将HepG2.2.15细胞在具有5％CO2的加湿培育箱中，在37℃，在补充有10％胎牛血清、1％谷氨酰胺和0.1％庆大霉素的威廉姆氏培养基E(WME)中维持。转染前24小时，将细胞胰蛋白酶化并以1×105个细胞/孔的密度接种到24-孔板中。在存在8μg/ml聚凝胺(Sigma)的情况下，将HepG2.2.15靶细胞与慢病毒构建体一起接种16h，并另外培养3天。作为对照，用不包含shRNA序列的慢病毒载体(pLKO.1SHC001或SHC002)转导空白细胞。然后收获细胞，裂解并通过RT-qPCR分析，通过BCA法和HBsAg ELISA进行蛋白质组学定量。使用GeneticSystemsTM HBsAg EIA 3.0(Biorad)，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量细胞裂解液和/或上清液中的HBsAg水平。使用来自HepG2.2.15上清液的稀释的标准曲线进行定量。根据通过BCA蛋白测定确定的总细胞蛋白，对所有结果进行归一化。
这些实验的结果鉴别了抑制HBsAg从HepG2.2.15细胞的释放的3种NAP相互作用子(图3)。这些相互作用子是酪蛋白激酶1δ(CSNK1D)、DNAJB12和微管-肌动蛋白交联因子1(MCAF1)。照此，本领域任何技术人员可以容易地获得通过使用小分子直接干扰这些蛋白的功能或者通过使用反义或siRNA降解这些蛋白的mRNA或者通过使用CRISPR-Cas9破坏这些蛋白的基因的方法。通过反义、RNAi或CRISPR-Cas9用于治疗HBV和HBV/HDV感染的组合物和方法可以包括如以上在表2中所描述的CSNK1、DNAJB12或MCAF-1的靶标序列或者使用本领域熟知且确立的方法，使用这些靶标的任何其它合适的mRNA或基因序列。
尽管已结合其具体实施方式描述了本发明公开，但是将理解它能够进一步修饰并且本发明申请旨在涵盖包括在本领域内的已知或惯例实践内的与本发明公开的这些偏离的任何改变、用途或改进，并且可以适用于以上所述的基本特征，并处于如下的所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 里普利科股份有限公司（REPLICOR INC.）
安德鲁·瓦利恩特（VAILLANT, Andrew）
理查德·布隆（BOULON, Richard）
马蒂厄·布兰切特（BLANCHET, Matthieu）
帕特里克·拉邦特（LABONTE, Patrick）
<120> 用于抑制乙型肝炎和丁型肝炎病毒感染的方法和组合物
<130> 05016051-42PCT
<150> US 62/979442
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<150> US 63/078939
<151> 2020-09-16
<160> 18
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> REP 2139, 完全硫代磷酸酯化, 完全2' O甲基核糖修饰, 每个胞嘧啶5'甲基化
<400> 1
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40
<210> 2
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> REP 2147, 完全2' O甲基核糖修饰, 每个胞嘧啶5'甲基化
<400> 2
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> REP 2179, 完全硫代磷酸酯化, 完全2' O甲基核糖修饰, 每个胞嘧啶5'甲基化
<400> 3
acacacacac acacacacac 20
<210> 4
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> REP 2165, 完全硫代磷酸酯化, 每个胞嘧啶5'甲基化
<220>
<221> misc_feature
<222> 1-10, 12-20, 22-30, 32-40
<223> 2' O甲基核糖修饰
<400> 4
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 40
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK1D正义靶向序列
<400> 5
aagagacaga aatacgaa 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNAJB12正义靶向序列
<400> 6
caaggtgatg gactgtat 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CopE正义靶向序列
<400> 7
agctgttcga cgtaaaga 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK1A1正义靶向序列
<400> 8
agaatttgcg atgtactt 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBL2正义靶向序列
<400> 9
tgtcatcgac attggcat 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MACF1正义靶向序列
<400> 10
ccacaactaa aggaatta 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CopA正义靶向序列
<400> 11
gtgagtacat tgtgggtt 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK1D反义靶向序列
<400> 12
ttcgtatttc tgtctctt 18
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNAJB12反义靶向序列
<400> 13
atacagtcca tcacctt 17
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CopE反义靶向序列
<400> 14
tctttacgtc gaacagct 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CSNK1A1反义靶向序列
<400> 15
aagtacatcg caaattct 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBL2反义靶向序列
<400> 16
aatgccaatg tcgatgac 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MACF1反义靶向序列
<400> 17
ttaattcctt tagttgtg 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CopA反义靶向序列
<400> 18
aaacccacaa tgtactca 18

Claims (27)

1.一种用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎感染的组合物，包含抑制酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12和微管-肌动蛋白交联因子1中的至少一种的活性的药用小分子以及载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述小分子是寡核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中寡核苷酸是与酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12或微管-肌动蛋白交联因子1的mRNA的任意部分互补的反义寡核苷酸、合成干扰RNA或者CRISPR相关核酸内切酶和向导RNA。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述组合物抑制HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述小分子是具有SEQ ID NO：12、13或17中所示序列的反义寡核苷酸。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述小分子是具有SEQ ID NO：5、6、10、12、13或17中所示序列的合成干扰RNA。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述小分子是具有包含SEQ ID NO：5、6、10、12、13或17中所示序列的向导RNA的CRISPR-Cas9。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含修饰的核碱基。
9.根据权利要求2所述的组合物，其中所述寡核苷酸是单链或双链的。
10.根据权利要求2所述的组合物，其中所述寡核苷酸是Speigelmer或适体。
11.根据权利要求2-10中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含磷酸二酯键中、糖上和碱基上的至少一种修饰。
12.根据权利要求2-11中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、2'-O-甲基修饰、2'-氨基修饰、2'-卤代修饰、非环核苷酸类似物、3'-帽和/或5'-帽、胞嘧啶碱基的5'甲基化和尿嘧啶碱基的4'巯基化中的至少一种。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的组合物，所述组合物还包含由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4组成的至少一种核酸聚合物。
14.一种用于治疗乙型肝炎或丁型肝炎感染的方法，包括给予需要治疗的受试者有效量的抑制酪蛋白激酶1同工型δ、DNAJB12和微管-肌动蛋白交联因子1的活性的药用小分子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述小分子是寡核苷酸。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中寡核苷酸是与酪蛋白激酶1同工型δ、DnaJB12、酪蛋白激酶1同工型α、外被体亚基ε、转导蛋白β-样蛋白2或微管-肌动蛋白交联因子1的mRNA的任意部分互补的反义寡核苷酸、合成干扰RNA或者CRISPR相关核酸内切酶和向导RNA。
17.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述组合物抑制HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌。
18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述小分子是具有SEQ ID NO：12、13或17中所示序列的反义寡核苷酸。
19.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述小分子是具有SEQ ID NO：5、6、10、12、13或17中所示序列的合成干扰RNA。
20.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述小分子是具有包含SEQ ID NO：5、6、10、12、13或17中所示序列的向导RNA的CRISPR-Cas9。
21.根据权利要求14-20中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含修饰的核碱基。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸是单链或双链的。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述寡核苷酸是Speigelmer、适体、miRNA、小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)。
24.根据权利要求14-23中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含磷酸二酯键中、糖上和碱基上的至少一种修饰。
25.根据权利要求14-24中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、2'-O-甲基修饰、2'-氨基修饰、2'-卤代修饰、非环核苷酸类似物、3'-帽和/或5'-帽、胞嘧啶碱基的5'甲基化和尿嘧啶碱基的4'巯基化中的至少一种。
26.根据权利要求14-25中任一项所述的方法，还包括给予由SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：4组成的至少一种核酸聚合物。
27.权利要求1-13中任一项所述的组合物用于抑制患者中HBV亚病毒颗粒(SVP)的组装和/或分泌的用途。
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