CN116903714A - 辣椒疫霉效应因子RxLR192及其片段、互作蛋白和其应用 - Google Patents

辣椒疫霉效应因子RxLR192及其片段、互作蛋白和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种辣椒疫霉效应因子RxLR192及其片段、互作蛋白和其应用。辣椒疫霉效应因子RxLR192片段能够抑制辣椒疫霉菌侵染，其互作蛋白CaFBA‑X1负向调控RxLR192促进辣椒疫霉侵染，并正向调控植物的免疫，在植物中过表达CaFBA‑X1可以抑制辣椒疫霉对植物的侵染。

Description

辣椒疫霉效应因子RxLR192及其片段、互作蛋白和其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种辣椒疫霉效应因子RxLR192及其片段、互作蛋白和其应用。
背景技术
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌引起的当前流行的一种比较难防治的世界性的土传病害，辣椒疫霉菌寄主广泛，可以侵染辣椒、番茄、黄瓜等多种作物。辣椒疫霉菌主要以卵孢子或厚垣孢子的形式在土壤或植物病残体中越冬，在适宜条件下可以引起辣椒等作物茎腐、根腐和枯萎等症状。目前已知可在农作物上寄生的疫霉已达80多种，每年都造成巨大的经济损失，而对于卵菌的防治方法还是以农业防治和化学防治为主，由于卵菌独特的生理机理，使得我们对其防治越来越难，因此了解卵菌效应因子毒力的基本机制及在基因组中快速进化过程对有效防治卵菌所带来的的病害至关重要。疫霉菌分泌的RxLR效应因子作为促进卵菌侵染的一类重要的胞内效应因子，它能够逃避或干扰宿主免疫相关途径，干扰植物自身免疫过程，从而促进病原微生物在植物体内的扩增。研究RxLR类效应因子的致病机制的研究有助于深入了解和利用植物免疫系统，参与寄主免疫，可以帮助人们开发高效杀菌剂和培育抗病品种，对于提高粮食的产量和质量均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种辣椒疫霉效应因子RxLR192及其片段、互作蛋白和应用，用以帮助RxLR效应因子的研究，便于制定卵菌病的有效长期控制措施。
为实现本发明目的，第一方面，本发明提供辣椒疫霉效应因子RxLR192片段，所述片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
第二方面，本发明提供DNA分子，所述DNA分子编码上述辣椒疫霉效应因子RxLR192片段。
第三方面，本发明提供一种生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分；所述生物材料含有上述DNA分子。
第四方面，本发明提供上述RxLR192片段、上述DNA分子或生物材料在抑制辣椒疫霉对植物的侵染中的应用；通过在植物中表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR192片段抑制辣椒疫霉对植物的侵染；所述植物为辣椒或本氏烟。
第五方面，本发明提供辣椒疫霉效应因子RxLR192的互作蛋白在抑制辣椒疫霉对植物的侵染中的应用；所述互作蛋白为辣椒果糖二磷酸醛缩酶，细胞质同工酶1，转录变异X1，简称CaFBA-X1(CaFBA-X1：Capsicum annuum fructose-bisphosphate aldolase,cytoplasmic isozyme 1,transcript variant X1)，CaFBA-X1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述植物为本氏烟或辣椒。
本发明中，通过促进植物细胞质中CaFBA-X1的表达来抑制辣椒疫霉对植物的侵染。
本发明中，应用于植物育种中。
第六方面，本发明提供抑制辣椒疫霉对植物的侵染的组合物，所述组合物包括上述辣椒疫霉效应因子RxLR192片段和/或CaFBA-X1，所述植物为本氏烟或辣椒。
本发明方法具有如下优点：本发明首次揭示了辣椒疫霉效应因子RxLR192的生物学功能，为辣椒疫霉的防治提供了新的药物靶标位点。研究发现，辣椒疫霉效应因子RxLR192片段能够抑制辣椒疫霉对植物的侵染，其互作蛋白CaFBA-X1负向调控RxLR192促进辣椒疫霉侵染，并正向调控植物的免疫，在植物中过表达CaFBA-X1可以抑制辣椒疫霉对植物的侵染。
附图说明
图1辣椒疫霉菌效应因子RxLR192的碱基和氨基酸序列，图中*为终止密码子；
图2RxLR192信号肽预测；
图3RxLR192跨膜区预测；
图4效应因子RxLR192表达模式分析；
图5效应因子RxLR192PCR扩增结果；
图6RxLR192的致病性检测，A：本氏烟接种示意图；B：Western Blot检测图，抗体为anti:GFP，下图为内参检测丽春红染色图；
图7RxLR192对病原物侵染的影响，A：辣椒疫霉菌侵染实验结果；B：直径统计柱状图；C：生物量分析；D：WesternBlot检测图，抗体为anti-GFP，下图为内参检测丽春红染色图；
图8RxLR192的亚细胞定位、GFP为对照；
图9RxLR192截短体模式图；
图10M1、M2、M3、M4对病原物侵染的影响，A：辣椒疫霉菌侵染实验结果；B：直径统计柱状图；C：生物量分析；D：Western Blot检测图，抗体为anti-GFP，下图为内参检测丽春红染色图；
图11pGBKT7-192的毒性检测；
图12pGBT9-192的毒性检测；
图13pGBT9-192的自激活检测；
图14酵母筛库阳性克隆PCR验证；
图15RxLR192与CaFBA-X1的酵母双杂交互作验证；B：RxLR192与CaFBA-X1的免疫共沉淀互作验证；C：RxLR192与CaFBA-X1的荧光素酶互补互作验证；
图16A：RxLR192与CaATP的酵母双杂交互作验证；B：RxLR192与CaATP的免疫共沉淀互作验证；C：RxLR192与CaATP的荧光素酶互补互作验证；
图17RxLR192与CaU-box的酵母双杂交互作验证；
图18RxLR192与CaH2Axb的酵母双杂交互作验证；
图19CaFBA-X1的亚细胞定位、GFP为对照；
图20CaFBA-X1致病性检测；
图21CaFBA-X1对病原物侵染的影响，A：辣椒疫霉菌侵染实验结果；B：直径统计柱状图；C：生物量分析；D：Western Blot检测图，抗体为anti-GFP，下图为内参检测丽春红染色图；
图22CaATP对病原物侵染的影响析，A：辣椒疫霉菌侵染实验结果；B：直径统计柱状图；C：WesternBlot检测图，抗体为anti-GFP，下图为内参检测丽春红染色图；
图23显示了CaFBA-X1核苷酸序列和氨基酸序列。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用来限制本发明的保护范围。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换，所有这些修改和替换都落入了本发明权利要求书请求保护的范围内。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1
1.1试验材料
1.1.1供试菌株及植株材料
本试验所用辣椒疫霉菌(P.capsici)菌株为实验室保存的标准菌株LT1534，恒温25℃培养；酵母菌株Y2H来自于宝生物工程有限公司。模式植物本氏烟(Nicotianabenthamiana)来自本实验室储存种植，植株在16h光照，8h黑暗，温度为24℃，空气湿度为70％的温室中培养，一个月后可以使用。辣椒(Capsicum annuum)来自实验室储存的自交系06221(陈姗姗,艾聪聪,盛慧等，山东农业大学学报(自然科学版),2019,50(01):44-48)，种植前将辣椒种子放在浸湿的滤纸上，在28℃的培养箱内恒温培养一周左右，待辣椒种子萌发并长出两片子叶后再进行移植，后续与本氏烟的培养方法一致。
1.1.2供试载体及感受态
供试载体及感受态：pBIN-GFP2载体由南京农业大学植物保护学院窦道龙教授提供，pGADT7和pGBT9载体来自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌感受态菌株DH5α、农杆菌感受态菌株GV3101来自上海昂羽生物技术有限公司，辣椒cDNA文库来自上海欧易(OE)有限公司。
常用酶、试剂及耗材见表1。
表1常用酶、试剂及耗材
1.1.3常用试剂及培养基配制：
LB培养基：10g氯化钠，5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，加入1L去离子水溶解，分装到250mL锥形瓶中，高温高压灭菌121℃，30min；固体培养基，每瓶加3g琼脂粉。燕麦培养基：25g燕麦中加入1L去离子水，倒入锅中煮沸，期间用玻璃棒不断搅拌，30min后使用三层纱布进行过滤去渣，最后用去离子水进行定容，分装到250mL锥形瓶中，每瓶加3g琼脂粉，高温高压灭菌121℃，30min。酵母缺陷型培养基：购自宝日医生物技术(北京)有限公司，每包(250g/包)培养基粉末加入适量去离子水溶解，后定容至500mL，调pH至5.8，分装到250mL锥形瓶中，高温高压灭菌121℃，15min；固体培养基，每瓶加4g琼脂粉。0.5×YPDA培养基：每包YPDA培养基粉末加入适量去离子水溶解，后定容至1000mL，调pH至5.8，分装到250mL锥形瓶中，高温高压灭菌121℃，15min。2×YPDA培养基：每包YPDA培养基粉末加入适量去离子水溶解，后定容到250mL，将pH调至5.8，高温高压灭菌121℃，15min。YPD培养基：2g胰蛋白胨，1g酵母提取物加入适量去离子水溶解，后定容至100mL，将pH调至5.8，高温高压灭菌121℃，15min。Amp(50mg/mL)溶液：1gAmp(氨苄青霉素)粉末加20mL无菌水溶解，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，-20℃低温保存。Kana(50mg/mL)溶液：1gKana(卡那霉素)粉末加20mL无菌水溶解，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，-20℃低温保存。Rif(50mg/mL)溶液:1gRif(利福平)粉末加40mL DMSO溶解，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，-20℃低温保存。20％葡萄糖溶液:20g葡萄糖用适量去离子水溶解并定容至100mL，高温高压灭菌121℃，15min。Loading Buffer:20g蔗糖、0.125g溴酚蓝用50mL去离子水溶解，分装后于4℃低温保存。5×TBE缓冲液:20mLpH＝8.0的0.5mol/LEDTA，54g Tris Base，27.5g硼酸，加入去离子水溶解并定容至1L，室温保存。10×TE:10mmol/L EDTA，100mmol/LTris-HCl，pH调至7.5，高温高压条件下灭菌121℃，30min。10×LiAc:配置1mol/LLiAc溶液，按配置体积称取，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，常温避光保存。1.1×TE/LiAc:1.1mL 10×LiAc，1.1mL10×TE buffer，8.8mL无菌水，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，4℃保存。1.1×PEG/LiAc:1mL10×LiAc，1mL 10×TE buffer，8mL 50％PEG3350，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，4℃保存。0.9％NaCl溶液:0.9gNaCl粉末加入100mL去离子水溶解，高温高压灭菌121℃，30min。20mg/mLX-a-gal母液:250mgX-a-gal溶于12.5mLDMF，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，-20℃避光保存。500μg/mLAbA母液:2mgAbA加4mL无水乙醇溶解，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，-20℃避光保存。10mM MgCl2:2.033g MgCl2溶于1L去离子水中，121℃，30min高温高压灭菌，4℃保存。0.5M MES溶液:称取24.4g MES粉末，加入25mL去离子水溶解，用KOH调节pH至5.6，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，4℃保存。水合氯醛溶液:1kg的水合氯醛固体中加入750mL的去离子水，充分溶解后室温备用。2×Loading Buffer:0.02g G-250，3.1g DTT，8gSDS，24mL甘油，20mL4×Tris-HCl Buffer(pH6.8)，用无菌水溶解定容至100mL，放于室温保存备用。台盼蓝母液:0.2g台盼蓝粉末，100mL乳酸，100mL苯酚，100mL丙三醇，加入100mL去离子水，混匀备用。100×D-荧光素钾盐原液(15mg/mL):规格为100mg/只的D-荧光素钾盐中加入6.667mL的无菌水，制成100×D-荧光素钾盐原液(15mg/mL)，0.22μm细菌过滤器过滤除菌，-20℃避光保存。1×D-荧光素钾盐工作液(终浓度150μg/mL):200μL 100×D-荧光素钾盐原液，加入19.8mL无菌水，避光保存。CTAB溶液:每100mL的去离子水中加入2mol/L的Tris-HCl 5mL、5mol/L的NaCl 28mL、CTAB粉末2g，高温高压灭菌121℃，30min，4℃保存备用。乙酰丁香酮(AS):1gAS粉末用50mLDMSO搅拌溶解完全后用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装至1.5mL离心管中，-20℃避光保存。10％APS溶液:1gAPS粉末溶于10mL无菌水中，4℃避光保存。SDS-PAGE电极缓冲液:1g SDS，3.1gTris-base，14.4g甘氨酸，用去离子水溶解并定容至1L。Transferbuffer:3.03g Tris-base，14.4g Glycine，用去离子水溶解定容至1L，再加入250mL甲醇。TBST:2.42g Tris-base，8gNaCl，加入去离子水溶解，用盐酸调pH至7.4，定容至1L后再加1mLTween-20，摇晃均匀。封闭液:5g脱脂奶粉溶于100mLTBST缓冲液，磁力搅拌器上搅拌2h后分装，-20℃保存。x-α-gal配制：250mg x-α-gal粉末加入12.5ml DMF，0.22μm细菌过滤器过滤除菌分装。TDO/X/A培养基(TDO是SD/-His/-Trp/-Leu的简称，X是x-α-gal，A是AbA)，QDO/X/A(QDO是SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu的简称)购自宝日医生物技术(北京)有限公司，按说明书使用。
2.2实验方法
2.2.1效应因子RxLR192生物信息学分析
从辣椒疫霉菌全基因组数据库网站JGI(http://genome.jgi-psf.org/PhycaF7/PhycaF11.download.ht)或FungiDB(https://fungidb.org/fungidb/)中下载RxLR192基因序列；在信号肽网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)上预测RxLR192信号肽的位置及长度；使用TMHMM网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质进行跨膜区预测。
2.2.2引物设计
(1)荧光定量qRT-PCR引物使用IDT网站(https://sg.idtdna.com/pages/tools/primerquest？returnurl＝％2FPrimerquest％2FHome％2FIndex)进行设计；
(2)普通PCR引物使用DNAMAN软件进行设计。
2.2.3RNA提取
采用山东思科捷生物技术有限公司SPARKeasy新型植物RNA快速提取试剂盒进行，按照说明书使用。
(1)研磨前先将研钵用酒精灼烧灭菌，再用液氮预冷；(2)将收集好的植物或菌丝组织放入预冷的研钵中，加入适量液氮研磨成粉末，用分析天平称取75mg样品粉末加入1.5mL去RNA酶的离心管中，加入500μL裂解液RLT；(3)将混合物在旋涡震荡仪上震荡1min，使样品裂解，14,000×g，离心15min；(4)将离心完成的上清液转移到新的DNA清除柱中，14,000×g，离心2min，收集滤液；(5)向滤液中加入250μL的无水乙醇，混匀；(6)将混合液加入到吸附柱中，14,000×g，离心3min，弃废液；(7)加700μL去蛋白液到吸附柱中，室温放置1min，14,000×g，离心1min，弃废液；(8)加500μL含无水乙醇的漂洗液到吸附柱中，14,000×g，离心1min，弃废液；(9)重复步骤(8)；(10)吸附柱重新放回收集管中，14,000×g，离心2min，去除残存漂洗液；(11)将吸附柱放入一个新的1.5mLRNase-Free的离心管中，向中间部位加入40μL预热的RNase Free H2O，室温放置1min，14,000×g，离心1min，获取RNA；(12)吸取10μL样品进行核酸电泳，对符合要求的样品进行反转录，为避免样品降解，剩余的放在-80℃保存。
2.2.4RNA反转录为cDNA
采用HiScript II RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司)制备用于qRT-PCR的cDNA：(1)取一个200μLRNase-Free PCR管，根据测量的RNA模板浓度，加入适量样品、4μL4×gDNAWiperMix、RNase-Free ddH2O补足体系至16μL，用移液枪轻轻吹打混匀，42℃金属浴2min；(2)向(1)的反应液中加入4μL 5×HiScript II qRTSuperMix II，用移液枪轻轻吸打混匀。以上所有反应均在冰上进行；(3)将上述20μL体系放入PCR仪进行反转录，反应条件为50℃15min，85℃5s；(4)测量cDNA样品浓度，根据实验需求稀释后可直接用于qRT-PCR反应，或放在-80℃保存。
采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)(南京诺唯赞生物科技有限公司)制备用于普通PCR的cDNA：(1)取一个200μLRNase-Free PCR管，根据测量的RNA模板浓度，加入适量样品，1μLOligt(DT)，RNase-Free ddH2O补足体系到12μL，65℃水浴5min，迅速置于冰上静置2min；(2)向(1)的反应液中加入4μL4×gDNAWiperMix，混匀，42℃金属浴2min；(3)向(2)中加入2μL 10×RTMix，2μLHiScript II Enzyme Mix，用移液枪轻轻吸打混匀；(4)将以上20μL体系放入PCR仪中进行第一链cDNA合成反应，反应条件为25℃5min，50℃45min，85℃2min；(5)测量cDNA样品浓度，根据实验需求稀释后放在-80℃保存。
2.2.5DNA提取：
(1)将配置好的CTAB溶液放到65℃水浴锅中预热至完全溶解；(2)将研磨好的植物样品加到离心管中，加入500μL CTAB溶液；(3)将离心管放置于65℃水浴锅中水浴1h-2h；(4)4℃，10,000rpm，离心15min，将离心完成后的上清转移到新的离心管中，并加入550μL的氯仿与异戊醇(24:1)的混合液，放置于摇架混匀20min；(5)将混匀的样品4℃，10,000rpm，离心10min，取最上层溶液转移至新的离心管中，加入400μL的异丙醇，混匀后静置20min；(6)4℃，10,000rpm，离心10min，弃掉上清，再加350μL无水乙醇，轻轻颠倒混匀，清洗管中沉淀物，重复三次；(7)将无水乙醇吸取干净，将离心管置于65℃烘箱中烘干10min,，同时将无菌水进行预热；(8)向离心管中加入50μL预热的洗脱液，静置待沉淀完全溶解，测量浓度，根据实验需求稀释后放在-20℃保存。
2.2.6基因克隆及纯化
(1)以辣椒疫霉菌菌株的cDNA为模版，设计特异性引物，配置50μLPCR反应体系：2×PhantaMax MasterMix 25μL(购自南京诺唯赞生物科技有限公司，按照说明书使用)、cDNA2μL、primer-F(10μM)2μL、primer-R(10μM)2μL、无菌水19μL。
(2)设置PCR扩增程序：预变性，95℃，5min；变性，95℃，30sec，35个循环；退火，55℃(根据引物Tm值确定)，30sec，35个循环；延伸，72℃，1Kbp＝1min，35个循环；后延伸，72℃，10min。
(3)PCR反应结束后，对产物进行凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行观察；(4)将目的基因进行切胶(采用OmegaBio-Tek公司的Gel ExtrationKit胶回收试剂盒进行，按照说明书使用)，放入1.5mL离心管中，加入400μLBinding Buffer，把混合物至于65℃烘箱至凝胶完全融化；(5)将混合液转移至HiBindDNA柱子中，静置，12,000rpm，离心1min，弃掉废液；(6)加入750μL漂洗液到吸附柱中，静置2min，12,000rpm，离心1min，弃掉废液；(7)重复上一步骤。(8)空管，12,000rpm离心1min，去除残留乙醇；(9)吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，放到65℃烘箱烘干10min，以免残留乙醇抑制下游反应；(10)向吸附柱中央加入20μL预热的洗脱液，静置，12,000rpm，离心1min，得到纯化的DNA片段溶液；(11)测量回收的DNA片段的浓度后，直接用于载体构建或置于-20℃保存备用。
2.2.7重组质粒构建
双酶切连接：将纯化的PCR产物按照下述纯化片段酶切体系进行酶切，载体质粒按照下述载体质粒酶切反应体系进行酶切，37℃水浴锅孵育1-2h，进行酶切回收(同胶回收步骤)，回收后按下述连接反应体系进行连接，放入16℃金属浴中孵育4h以上。
无缝克隆连接：载体质粒按照下述载体质粒酶切反应体系进行酶切、回收后，按照下述无缝克隆连接反应体系进行连接，放入50℃水浴锅中孵育15min。
纯化片段酶切反应体系：纯化片段2-10μL，酶I2μL，酶II2μL，10×Buffer 4μL，无菌水至40μL。其中，酶I和酶II为赛默飞世尔科技(中国)有限公司FastDigest系列快速内切酶，按照说明书使用。
载体质粒酶切反应体系：载体质粒2-10μL，酶I2μL，酶II2μL，10×Buffer 4μL，无菌水至40μL。其中，酶I和酶II为赛默飞世尔科技(中国)有限公司FastDigest系列快速内切酶，按照说明书使用。
连接反应体系：目的基因双酶切产物7μL，载体双酶切产物3μL，Solution I 10μL。其中，Solution I采用莫纳生物科技有限公司的SingleAssembly CloningMix，按照说明书使用。
无缝克隆连接反应体系：目的基因2μL，载体双酶切产物3μL，CloningMix 5μL。其中，CloningMix采用莫纳生物科技有限公司的SingleAssembly CloningMix，按照说明书使用。
2.2.8大肠杆菌转化：
(1)从-80℃取出大肠杆菌DH5α(购自上海昂羽生物技术有限公司，按照说明书使用)感受态细胞置于冰上融化；(2)将连接产物加到感受态细胞中，冰浴静置30min；(3)42℃热激60s，冰上放置2min；(4)加入500μL不含抗性的液体LB培养基，37℃，180rpm振荡培养40-50min；(5)将菌液6,000rpm室温离心1min；(6)留约100μL上清液重悬，在含有相应抗性的LB固体培养基平板上涂布，37℃培养箱中倒置培养10-12h；(7)用灭菌的白枪头挑取单克隆菌落于到含有相应抗性的LB液体培养基中培养至菌液浑浊；(8)吸取重组质粒菌液进行PCR扩增及凝胶电泳，将阳性结果菌液送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序；(9)测序正确的菌液甘油或划线保存并提取质粒。
2.2.9重组质粒提取
采用北京康为世纪生物科技有限公司的Pure PlasmidMini Kit进行，根据说明书使用。
(1)将含重组质粒的大肠杆菌(上文2.2.8得到)扩大培养；(2)用1.5mL离心管收菌，10,000rpm离心1min，弃上清，向菌体中加入250μL溶液P1(使用前先加入RNaseA)，轻轻重悬沉淀；(2)加入250μL溶液P2到离心管中，混匀后静置，使菌体能够充分裂解(此时开盖已有拉丝现象)；(3)加350μL溶液N3到上步反应液中，混匀后静置，此时有白色絮状沉淀产生，12,000rpm离心10min；(4)将(3)中的上清液转移到吸附柱中，静置，12,000rpm，离心1min，倒掉废液；(5)向吸附柱中加入400μL的漂洗液(使用前先加入无水乙醇)，室温下放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉废液；(6)空吸附柱，12,000rpm离心1min；(7)将吸附柱放置于新的1.5mL离心管中，放到65℃烘箱烘干10min，以免残留乙醇抑制下游反应；(8)向吸附柱中央加入30μL预热的无菌水，静置，12,000rpm离心2min，得到重组质粒。
2.2.10重组质粒转农杆菌
(1)将感受态GV3101(上海昂羽生物技术有限公司)置于冰上融化，每30μL农杆菌感受态中加入2μL重组质粒，冰浴5min；(2)冰浴完成后，立刻置于液氮中冷却5min，37℃水浴5min，再冰浴5min；(3)结束后加500μL不含抗性的液体LB，28℃，200rpm培养4h；(4)将菌液6,000rpm室温离心1min；(5)留100μL上清液重悬，涂布到含有相应抗性的LB固体培养基平板上，28℃培养箱培养2-3d；(6)向1.5mL灭菌的离心管中加入1mL含抗生素Rif和Kana的LB液体培养基，用灭菌的白枪头挑取单菌落约10个，28℃，200rpm振荡培养10-12h，待菌液浑浊；(7)菌落PCR验证，条带大小准确无误即可保存。
2.2.11农杆菌介导的瞬时表达技术
(1)向30mL液体LB培养基(添加抗生素Rif100μg/mL和Kana 50μg/mL)中加入1mL农杆菌菌液，28℃，200rpm，振荡培养20h至菌液浑浊；(2)将菌液转移至50mLBD管中，3,800rpm，离心5min，收集菌体，弃上清；(3)用10mL 10mM MgCl2冲洗菌体，重复3次；(4)配置缓冲液：100mLMgCl2、2mLMES(PH为5.6)、200μLAs；(5)用缓冲液重悬菌体，调OD600为0.5，28℃培养箱黑暗培养4h；(6)挑选适龄本氏烟叶片，用1mL的注射器将农杆菌菌液从叶片背面注射入叶片中，根据实验需求对叶片进行观察。
2.2.12Western Blot
(1)将农杆菌接种48h的本氏烟叶片放于研钵中用液氮研磨成粉末；(2)取700μL样品装到预冷的1.5mL离心管中，加入700μL 2×Loading Buffer，充分混匀后置于冰上；(3)将样品在沸水中煮5min，旋涡震荡30s，再煮5min；(4)离心后收集蛋白样品；(5)蛋白样品采用SDS-PAGE蛋白电泳检测，电流100mA，电压100V，3h左右结束电泳；(6)电泳结束后，将SDS-PAGE胶转移至PVDF膜上，220V，400mA，0.5h；(7)结束后，用5％的脱脂奶粉对PVDF膜封闭，封闭2h或者4℃过夜；(8)封闭结束后一抗孵育一个小时，结束后用缓冲液洗膜；(9)二抗孵育50min，用TBST洗膜洗3次，每次5min；(10)ECL显影照相。
2.2.13台盼蓝染色
(1)收取农杆菌接种7d的本氏烟叶片，统计症状；(2)将台盼蓝母液与95％酒精按照1:2比例充分混匀，备用；(3)烧杯中倒入100mL左右台盼蓝染液，放在沸水中预热1min，将4-5片本氏烟叶片放进烧杯中煮60s；(4)煮好的植物叶片在24h后更换为水合氯醛进行脱色，水合氯醛大约每12h更换一次，直至植物叶片变的透明，症状清晰可见为止；(5)将脱色完成的植物叶片浸泡在95％的酒精中洗去浮色，拍照记录。
2.2.14表达模式分析
(1)辣椒疫霉菌平板中移除若干菌块，用无菌水冲洗10次左右，每次间隔30min，体视镜下观察是否产生孢子囊；(2)产生孢子囊后于14℃过夜释放游动孢子；(3)用75％的酒精喷洒辣椒叶片进行消毒，用针头在辣椒叶片上轻轻划线，用移液器吸取10μL游动孢子悬浮液于辣椒叶片上，接种完成后，将其放到25℃培养箱中黑暗保湿培养；(4)分别在1.5h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h时收样；(5)收取培养时间相同、生长活力一致的辣椒疫霉菌丝体作为对照，进行RNA提取，将RNA反转录为cDNA，进行qRT-PCR检测。
2.2.15辣椒疫霉菌侵染实验
(1)将OD600为0.5的农杆菌菌液接种到本氏烟叶片上，叶片左右两部分分别接种实验组和对照组，接种面积一致；(2)接种24h后摘下叶片，在接种处接种直径6mm的辣椒疫霉菌菌块，28℃黑暗培养48h；(3)48h后，将本氏烟叶片放在紫外灯下照射，观察辣椒疫霉菌的侵染情况，进行拍照，记录侵染面积。
2.2.16免疫共沉淀(Co-IP)
(1)将农杆菌接种36-48h的本氏烟叶片约3-4片，放入研钵中用液氮研磨成粉末，约研磨30min，取500μL粉末加入500μL2×Loadingbuffer作为实验对照部分，剩余粉末放入50mL BD管中，加入7mLRIPA裂解液(碧云天RIPA(弱)裂解液，购自上海碧云天生物技术有限公司，按照说明书使用)，立即混匀后于4℃摇架上裂解约4h；(2)将裂解物离心，4℃，12,000rpm离心15min，将上清转移至50mLBD管中，吸取70μL蛋白样加入70μL2×Loadingbuffer作为Input部分样品，沸水浴5min，涡旋振荡30s，再沸水浴5min；(3)免疫共沉淀：a吸取20μLbeads加入500μLWashbuffer(10mM Tris-HCl，pH＝7.51.5764g；150mMNaCl 8.766g；0.2mMEDTA0.186 g定容至1L)清洗，4℃，1,000×g离心1min，弃上清，重复此步骤两次；b向蛋白提取液上清中加入beads(武汉爱博泰克anti-GFP agrose beads)，4℃摇架孵育4h以上；c 4℃，1,000×g离心1min，弃上清，重复此步骤直至将收取完全部beads；d加入1mLWashbuffer清洗beads，4℃，1,000×g离心1min，弃上清，重复6-9次；e向beads中加入100μL2×Loadingbuffer作为IP部分样品，沸水浴5min，涡旋振荡30s，再沸水浴5min，1,2000rpm，离心2min；(4)对所有样品进行SDS-PAGE电泳检测。
2.2.17酵母感受态的制备
(1)将Y2HGold酵母菌株在YPDA固体培养基上划线活化，在30℃培养箱倒置培养2-3d，挑生长状况良好的单菌落于YPDA(含有50μg/mLKana)液体培养基中，30℃恒温摇床，250rpm，振荡培养至浑浊；(2)在50mLYPDA(含有50μg/mLKana)液体培养基中加入5μL过夜培养的酵母菌液，30℃，180rpm摇到OD600＝0.15-0.3；(3)30℃，3,800rpm离心5min，在操作台内弃上清，再用100mLYPDA(含有50μg/mLKana)液体培养基重悬菌体，30℃，250rpm继续振荡培养至OD600为0.5-0.7；(4)30℃，3,800rpm离心5min，在操作台内弃上清，用30mL无菌水重悬菌体，3800rpm离心5min；(5)在操作台内弃上清，用1.5mL的1.1×TE/LiAc重悬菌体，30℃，14,000rpm高速离心15s，吸去上清液；(6)向每个离心管中分别加入600μL的1.1×TE/LiAc，重悬后即为感受态细胞。
2.2.18酵母转化(质粒单转或共转)
采用TakaraBio公司的酵母转化试剂盒进行，根据说明书使用；实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
(1)2μL重组质粒，5μLcarrierDNA(10mg/mL)，50-70μL感受态细胞，500μLPEG/LiAc，轻轻吸打混匀；(2)30℃恒温水浴锅中孵育30min，期间轻轻的上下翻转5-7次；(3)加入20μLDMSO(增加细胞膜的通透性)，吸打混匀；(4)在42℃恒温水浴锅中孵育15min，期间轻轻的上下翻转5-7次；(5)30℃，14,000rpm离心15s，弃上清。(6)用1mLYPD Plus(9mLYPD加1mL20％葡萄糖(天津凯通试剂，20％葡萄糖：用天平称取葡萄糖20g，加入到一个干净的250ml三角瓶中，缓慢加入去离子水，不断搅拌，最终定容至100ml，用封口膜及报纸封口，121℃高压灭菌15min，4℃保存)重悬菌体(不能用普通的YPD代替)，30℃恒温摇床，250rpm，振荡培养50min；(7)30℃，14,000rpm高速离心15s，弃上清；(8)加入300μL 0.9％NaCl溶液重悬菌体，吸取适量重悬液涂布在到SD/-Leu/-Trp缺陷型固体培养基平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养3-4d。
2.2.19酵母双杂交自激活检测(质粒共转)和毒性检测
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
自激活检测(质粒共转法)：将重组BD诱饵质粒与AD载体质粒共转到酵母感受态中，涂布到含有不同浓度AbA的SD/-Trp/X-α-gal的固体培养基平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养5-7d后观察结果，选择合适的AbA浓度进行后续酵母筛库实验。
毒性检测：将重组BD诱饵质粒与BD载体质粒分别转到酵母感受态中，涂布到SD/-Trp缺陷型固体培养基平板上，3-5d后观察菌落生长情况，然后分别挑取直径大小相同的单菌落到含相应抗性的SD/-Trp液体培养基中，30℃，250rpm培养20h后测其OD600值，若两者OD600接近，则无毒性。
2.2.20Mating法酵母双杂交文库筛选
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
(1)选取SD/-Trp固体培养基平板上10-15个直径约3mm含有Bait质粒的Y2HGold新鲜克隆菌落，用白枪头蘸取一点到10μL无菌水中；(2)破壁：沸水浴1min，液氮1min，重复5-7次；(3)将破壁产物进行PCR凝胶电泳；(4)选取最亮条带对应的单菌落到50mL SD/–Trp液体培养基中培养到OD600＝0.8左右；(5)30℃，1,000×g，离心5min，弃上清；(6)用4-5mL SD/-Trp液体培养基重悬细胞，使细胞密度大于1×108cells/mL，得到BD菌液；(7)室温水浴锅中融化AD菌液，取10μL稀释100×、1,000×、10,000×涂布SD/-Leu培养基，AD文库需>2×107cells/mL，即10,000×SD/-Leu板上应该大于200个克隆；(8)菌液向2L灭菌锥形瓶中依次加入1mLAD菌液和4-5mLBD；(9)加入45mL(含有50μg/mLKana)2×YPDA液体培养基，用1mL2×YPDA冲洗AD菌株管两次；(10)30℃恒温摇床，40-50rpm，振荡培养20-24h；(11)在40×下观察杂交液是否出现米奇头或三叶草形状的结合子。有则继续进行步骤(10)操作，若没有继续培养4h；(12)30℃，1,000×g离心10min；(13)用50mL的0.5×YPDA液体培养基冲洗锥形瓶，并用其重悬菌体，(14)30℃，1,000×g离心10min；(15)弃上清，用10mL的0.5×YPDA重悬细胞，并用移液枪分装，测量总体积；(16)取100μL依次稀释10×、100×、1,000×、10,000×涂布至SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp(DDO)固体培养基平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养3-5d，统计每个平板上的菌落数，并计算Mating效率；(17)将剩余混合液涂布到直径150mm的初筛TDO/X/A培养基，每板涂布200μL，共涂布55-60个平板，30℃恒温培养箱中倒置培养3-5d；(18)将TDO/X/A板上的蓝色克隆在QDO/X/A平板上划线，进一步筛选；(19)对QDO/X/A上的阳性克隆摇菌提取质粒，进行下一步的测序分析。
2.2.21酵母质粒提取
采用北京康为世纪生物科技有限公司YeastPlasmidMini Kit进行，根据说明书使用。
(1)挑取酵母阳性单菌落于25mL SD/-Leu/-Trp液体培养基中，30℃摇床，250rpm培养16-20h，至菌液浑浊；(2)12,000rpm，离心1min，弃上清，收集菌体；(3)向离心管中加入250μL含RNaseA的Buffer P1，重悬菌体；(4)加入40mg的玻璃珠，涡旋振荡15min(使酵母细胞壁破碎)；(5)加入250μL的Buffer P2，缓慢上下颠倒多次，静置3min(此时打开离心管盖会出现白色拉丝)；(6)加入350μL的BufferN3，缓慢上下颠倒多次，12,000rpm离心25min；(7)柱平衡：向柱子中加入200μL的BufferPS，静置2min，12,000rpm离心1min，弃废液，柱子重新放回收集管；(8)将上步的上清液转入到平衡好的吸附柱中，注意不能加入沉淀，静置，12,000rpm离心1min，弃废液；(9)向吸附柱中加入700μL的漂洗液(使用前加入无水乙醇)，静置，12,000rpm离心1min，弃废液；(10)将吸附柱放回收集管，12,000rpm空离2min；(11)将吸附柱放置于新的1.5mL离心管中，65℃金属浴10min，去除残留乙醇，以免抑制下游反应；(12)向吸附柱中央加入30μL预热的无菌水，静置，12,000rpm离心1min，收集质粒测浓度后于-20℃保存备用。
2.2.22酵母共转化一对一验证
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
(1)将构建好的BD与AD重组质粒按照2.2.18的方法共转到酵母菌株中，涂布在SD/-Leu/-Trp缺陷型固体培养基平板上；
(2)30℃黑暗培养3-5d后，待培养基上长出单克隆菌落，挑取酵母单个菌落用SD/-Trp/-Leu液体培养基稀释后，分别在SD/-Trp/-Leu，SD/-Trp/-Leu/-His，SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu/X-a-gal固体培养基平板上点斑，30℃恒温培养箱中倒置培养3-5d，观察记录结果并拍照。
2.2.23荧光素酶互补实验
(1)将重组质粒转化农杆菌GV3101，菌落PCR获得阳性菌；(2)选择对应条带最亮的菌落，用含抗性的LB液体培养基在28℃恒温摇床，200rpm培养至菌液浑浊后收菌，调OD600为1.0；(3)分别在本氏烟叶片上共接种验证互作的两个蛋白和对照；(4)农杆菌接种48h后将1×D-荧光素钾盐工作液滴到烟草叶片的背面，将烟草叶片置于黑暗下室温反应5min；(5)利用植物活体光学成像系统观察荧光素酶发光情况。
3结果与分析
3.1效应因子RxLR192生物信息学分析
从辣椒疫霉菌基因组数据库JGI(http://genome.jgi-psf.org/Phycall/Phycall.home.htmL)克隆到效应因子RxLR192(登录号为：JGI：jgi|Phyca11|19192|fgenesh1_pg.PHYCAscaffold46#3(642))的全长，全长为642bp，编码213个氨基酸，预测蛋白大小为24.53kDa(图1)；在信号肽预测网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)上输入氨基酸序列进行预测时，预测到RxLR192的信号肽为第1-17为位氨基酸(图2)；将RxLR192去除信号肽后在跨膜区预测网站TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)上没有预测到RxLR192的跨膜结构(图3)。
3.2效应因子RxLR192的转录水平分析
为了探究RxLR192在辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片的过程是否发挥作用，以辣椒疫霉菌游动孢子侵染辣椒叶片1.5h、3h、6h、12h、24h、48h、60h、72h的cDNA为样本，以辣椒疫霉菌菌株LT1534菌丝体时期的cDNA为对照，以辣椒疫霉菌持家基因actin作为内源参照，利用qRT-PCR检测技术RxLR192在各个阶段的转录水平。结果如图4所示，效应因子RxLR192在侵染早期3h表达上调最为明显，之后表达量逐渐下降，表明该效应因子在辣椒疫霉菌侵染辣椒前期主要发挥作用。
3.3效应因子RxLR192基因克隆
以辣椒疫霉菌标准菌株LT1534的cDNA为模板，通过软件DNAMAN设计特异性引物对效应因子RxLR192进行扩增，获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将效应因子RxLR192特异性扩增条带(图5)采用胶回收的方式进行纯化，纯化后的效应因子RxLR192与酶切回收后的载体质粒进行连接、转化构建成重组质粒，将重组质粒送北京擎科生物科技股份有限公司测序，比较测序结果，确保载体构建成功，以便用于后续的试验。
3.4效应因子RxLR192的致病性检测及对病原物侵染的影响
3.4.1效应因子RxLR192的致病性检测
为了探究效应因子RxLR192是否会引起细胞坏死，利用农杆菌瞬时表达技术，以死亡激发子INF1(NCBI登录号：XM_002900382.1)为阳性对照，GFP、buffer(10mM MgCl2缓冲液：每100mL MgCl2溶液(天津市凯通化学试剂有限公司)，加入2mLpH＝5.7MES(北京索莱宝科技有限公司)、20μL乙酰丁香酮(北京索莱宝科技有限公司)为阴性对照，在本氏烟上瞬时表达RxLR192,对其自身功能进行验证，结果如图6所示：
图6A结果显示，接种INF1的部位能够引起细胞坏死，而接种效应因子RxLR192、GFP和buffer(10mM MgCl2缓冲液)的部位并不会引发细胞坏死。图6B的Western Bolt检测证明RxLR192、INF1、GFP都可以在本氏烟均可成功表达。
3.4.2效应因子RxLR192对病原物侵染的影响
为了探究效应因子RxLR192对辣椒疫霉菌侵染植物叶片的影响，利用农杆菌瞬时表达技术，在本氏烟叶片的左侧瞬时表达RxLR192，在本氏烟叶片的右侧瞬时表达GFP作为对照，24h后在叶片两侧分别接种辣椒疫霉菌标准菌株LT1534的菌块，28℃黑暗保湿培养，48h后在紫外灯下观察结果，为保证实验结果的准确性，实验叶片数量不少于30片。
结果如图7(A)显示，与GFP对照相比，瞬时表达RxLR192处辣椒疫霉菌侵染病斑较大，对侵染病斑进行直径统计并提取辣椒疫霉菌DNA进行生物量分析得到相同结果(图7，B、C)。通过WesternBolt检测，证明了RxLR192、GFP都可以在本氏烟上正常表达(图7，D)。
3.4.3效应因子RxLR192亚细胞定位
本实验中所用的载体pBIN-GFP2为植物表达载体，在超高分辨率激光共聚焦显微镜下为绿色荧光，用来检测细胞中蛋白表达的所在位置。在本氏烟叶片上接种分别接种效应因子RxLR192与空载体GFP，48h后使用超高分辨率激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位，发现效应因子RxLR192定位在细胞质和细胞核中，如图8所示。
3.5效应因子RxLR192对病原物侵染的关键功能位点分析
效应因子RxLR192能促进病原物的侵染，为了进一步确定促进病原物侵染的关键功能区域，根据预测的效应因子RxLR192的二级结构进行了4个截短(图9)，得到截短体M1(18-112)、M2(18-167)、M3(18-184)和M4(18-197)。
为了探究截短体对辣椒疫霉菌侵染的影响，利用农杆菌瞬时表达技术，分别在本氏烟叶片的左侧瞬时表达截短体M1(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、M2(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、M3(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)和M4(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，在本氏烟叶片的右侧瞬时表达GFP作为对照，24h后在叶片两侧分别接种辣椒疫霉菌标准菌株LT1534的菌块，28℃黑暗保湿培养，48h后在紫外灯下观察结果，为保证实验结果的准确性，实验叶片数量不少于30片。
结果如图10(A)显示，与GFP对照相比，瞬时表达M1、M2、M3处辣椒疫霉菌侵染病斑较小，而M4处辣椒疫霉菌侵染病斑较大，对侵染病斑进行直径统计并提取辣椒疫霉菌DNA进行生物量分析得到相同结果(图10，B，C)，所以效应因子RxLR192促进病原菌侵染的关键位点在185-197位氨基酸。通过Western Bolt检测，证明了M1、M2、M3、M4、GFP都可以在本氏烟上正常表达(图10，D)，M1、M2、M3都可以抑制辣椒疫霉菌侵染，而M4则促进辣椒疫霉菌侵染。
3.6RxLR192的毒性和自激活检测
3.6.1pGBKT7-192毒性检测
将pGBKT7-192重组质粒和pGBKT7空载体分别单独转入Y2HGold酵母菌株中，涂布在SD/-Trp缺陷型固体培养基平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养3-5天，结果如图11所示，单转pGBKT7-192的酵母生长状态明显弱于单转pGBKT7的酵母生长状态。
分别从pGBKT7-192和pGBKT7的平板上挑取大小相似、生长状况相同的单克隆菌落到30mL SD/-Trp液体培养基中，30℃摇床，220rpm振荡培养20h，以SD/-Trp液体培养基为空白对照，测定pGBKT7-192与pGBKT7的OD600值，结果显示pGBKT7-192的OD600值(0.219)明显小于pGBKT7的OD600值(0.939)。以上两种方法同时证明pGBKT7-192重组质粒对于酵母菌株具有毒性，无法进行后续的试验，故采用pGBT9-192重组质粒重新进行验证。
3.6.2pGBT9-192毒性检测
将pGBT9-192重组质粒和pGBT9空载体分别单独转入Y2HGold酵母菌株中，涂布在SD/-Trp缺陷型固体培养基平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养3-5天，结果如图12所示，单转pGBT9-192的酵母和单转pGBT9的酵母生长状态无明显差异。
分别从pGBT9-192和pGBT9的平板上挑取大小相似、生长状况相同的单克隆菌落到30mL SD/-Trp液体培养基中，30℃摇床，220rpm振荡培养20h，以SD/-Trp液体培养基为空白对照，测定pGBT9-192与pGBT9的OD600值，结果显示无明显差异(pGBT9-192的OD600值为1.482，pGBT9的OD600值为1.511)。以上两种方式皆能证明pGBT9-192重组质粒对酵母的生长没有毒性，可以进行后续的筛库实验。
3.6.3pGBT9-192的自激活检测
将pGBT9-192重组质粒和pGBT9空载体转进Y2HGold酵母菌株中，涂布SD/-Trp、SD/-Trp+x-α-gal、含不同质量的500mg/mLAbA的SD/-Trp+x-α-gal的固体培养基平板上，在30℃培养箱中培养3-5天。结果如图13所示：pGBT9-192能够在SD/-Trp+x-α-gal的培养基上生长且变蓝，只有在含24μgAbA浓度的SD/-Trp+x-α-gal的培养基上生长且不变蓝，但由于过高浓度的AbA会抑制酵母的生长，故采用以20μg的AbA浓度进行酵母筛库。
3.7酵母文库质量测定结果
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
用辣椒疫霉菌菌丝侵染辣椒叶片，分别在0h、6h、12h、24h、48h、72h收取样品，放置于28℃培养箱保湿培养，送公司构建辣椒cDNA酵母AD文库，将构建好的辣椒cDNA文库质粒转入Y187酵母菌中，吸取10μL酵母AD文库菌液稀释10倍、100倍、1,000倍、10,000倍，在每个SD/-Leu固体培养基平板上涂布100μL(每个浓度重复3次)，30℃黑暗培养3-5d，统计平板上的菌落数，计算平均个数。在3个10,000的SD/-Leu酵母平板上平均统计到260个单菌落，经计算，该酵母文库的克隆数为2.6×107，符合筛库要求(表2)。
表2酵母AD文库质量鉴定
AD文库稀释倍数 SD/-Leu平板平均菌落数(个)
10 >1,000
100 >1,000
1,000 >1,000
10,000 260
3.8效应因子RxLR192的酵母双杂交筛库结果
3.8.1二倍体结合子质量检测
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
将pGBT9-192重组质粒转入Y2HGold酵母菌株中，涂布SD/-Trp培养基，30℃培养箱黑暗培养3-5d。选择SD/-Trp平板上的生长状态良好的单克隆于SD/-Trp液体培养基中振荡培养至OD600＝0.8，与1mLAD文库菌液融合培养，形成结合子后离心加10mL0.5×YPDA，重悬菌体，吸取10μL菌液稀释10倍、100倍、1,000倍、10,000倍涂布SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu平板(每种稀释浓度重复三次)，30℃黑暗培养3-5d，统计每种浓度平板上的平均菌落数(表3)，并计算prey活力、bait活力、二倍体活力，经计算其分别为2.5×107、4.8×109、6×106，计算Mating效率。
Mating效率计算方法：Mating效率＝二倍体生存活力/限制方生存活力×100％(prey和bait活力少的作为限制方)，经计算Mating效率为24％，Mating效率较高，此次筛库结果可靠，可以用于后续试验验证。
表3酵母二倍体结合子检测
菌落数量 1/100 1/1,000 1/10,000
SD/-Trp 8,280 6,000 4,000
SD/-Leu 1,900 64 3
SD/-Trp/-Leu 1,130 68 5
平均菌落数 3,770 2,044 1,336
3.8.2阳性克隆的PCR检测
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
挑取SD/-His/-Trp/-Leu+AbA+X-α-gal平板上生长的酵母蓝色单克隆转移到筛选强度更高的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu+X-α-gal的培养基上进一步筛选，最后挑取在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu+X-α-gal生长的酵母蓝色单克隆于无菌水中做菌落PCR，有条带的送北京擎科生物科技股份有限公司测序，菌落PCR结果如图14所示。
3.8.3酵母阳性克隆序列序列比对结果
将测序结果在NCBI比对序列后，排除空载体和重复的蛋白，选择同源性最高的结果，最终获得27个疑似互作蛋白。
表4酵母筛选到的疑似互作蛋白
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3.9RxLR192与CaFBA-X1互作
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
图23显示了CaFBA-X1的核苷酸序列(NCBI登录号：LOC107878843)和氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。
验证效应因子RxLR192与CaFBA-X1的互作关系，需获得靶标蛋白的全长序列，而通过SMART同源重组交换技术构建的辣椒AD文库中的猎物蛋白非靶标蛋白的全长基因序列，因此以辣椒cDNA为模板，克隆CaFBA-X1全长序列(其核苷酸序列的NCBI登录号：LOC107878843)，按照2.2.7的实验方法将CaFBA-X1全长构建到pGADT7载体上，与pGBT9-192共转进Y2HGold酵母菌株涂布在SD/-Trp/-Leu缺陷型培养基上，30℃黑暗培养3-5d。挑取SD/-Trp/-Leu缺陷型培养基上生长出单克隆均匀点样在各个缺陷型培养基上，30℃黑暗培养3-5d观察结果并拍照。结果如图15(A)所示，RxLR192-BD与CaFBA-X1-AD共转化后长出的单克隆菌落在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu+X-α-gal平板上生长且变蓝，表明效应因子RxLR192与CaFBA-X1有极大可能存在互作关系。
为了保证实验的准确性，用免疫共沉淀技术验证RxLR192与CaFBA-X1的互作关系。将重组质粒RxLR192-GFP和CaFBA-X1-Flag利用农杆菌瞬时表达技术，以本氏烟为模式作物，进行Western Blot试验，筛选出表达的菌株，以RxLR192-GFP与CaFBA-X1-Flag为实验组1:1混合接种，以RxLR192-GFP与Flag空载体1:1混合接种、CaFBA-X1-Flag与GFP空载体1:1混合接种为对照组进行试验。提取在本式烟中表达48h的蛋白样品，用带GFP抗体的Beads孵育，用Westert Blot进行检测，结果如图15(B)，在Input部分的RxLR192-GFP+CaFBA-X1-Flag相关蛋白都正常表达且被相应抗体结合显色：RxLR192-GFP被GFP抗体结合并显色，大小为48kDa；CaFBA-X1-Flag被FLAG抗体结合并显色，大小为41kDa。IP部分用GFP抗体检测中，RxLR192-GFP能被检测到，蛋白大小与Input部分一致，说明GFPbeads能够正常结合带GFP标签的蛋白，而在FLAG抗体检测中，只有在RxLR192-GFP+CaFBA-X1-Flag的实验组中才能检测到CaFBA-X1-Flag重组蛋白，大小为41kDa，其他组合都无法检测到。说明了效应因子RxLR192与CaFBA-X1互作。
将重组质粒RxLR192-NLuc和CaFBA-X1-CLuc转入GV3101，利用农杆菌瞬时表达技术，以本氏烟为模式作物，以RxLR192-NLuc+CaFBA-X1-CLuc为实验组1:1混合接种，以RxLR192-NLuc+CLuc、NLuc+CaFBA-X1-CLuc、NLuc+CLuc作为阴性对照1:1混合接种，参照2.2.23的方法利用植物活体光学成像系统捕捉荧光，结果如图15(C)，发现与对照相比，RxLR192-NLuc+CaFBA-X1-CLuc实验组可以发出荧光，由此基本可以确定效应因子RxLR192与CaFBA-X1互作，这为进一步研究和阐明该效应因子的作用机制提供了理论基础和实验思路。
3.10RxLR192与辣椒CaATP合成酶δ链(CaATP)互作
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
验证效应因子RxLR192与辣椒CaATP合成酶δ链(CaATP)的互作关系，需获得靶标蛋白的全长序列，本研究以辣椒cDNA为模板，克隆CaATP全长序列，按照2.2.7的实验方法将CaATP全长构建到pGADT7载体上，与pGBT9-192共转进Y2HGold酵母菌株涂布SD/-Trp/-Leu培养基，30℃黑暗培养3-5d。挑取SD/-Trp/-Leu培养基上生长出单克隆均匀点样在各个缺陷型培养基上，30℃黑暗培养3-5d观察结果并拍照。结果如图16(A)所示，RxLR192-BD与CaATP-AD共转化后长出的单克隆菌落在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu+X-α-gal平板上生长且变蓝，表明效应因子RxLR192与辣椒CaATP合成酶δ链(CaATP)有极大可能存在互作关系。
为了保证实验的准确性，同时利用免疫共沉淀技术验证RxLR192与CaATP的互作关系。将重组质粒RxLR192-GFP和CaATP-Flag利用农杆菌瞬时表达技术，以本氏烟为模式作物，进行Western Blot试验，筛选出表达的菌株，以RxLR192-GFP与CaATP-Flag为实验组1:1混合接种，以RxLR192-GFP与Flag空载体1:1混合接种、CaATP-Flag与GFP空载体1:1混合接种为对照组进行试验。提取在本式烟中表达48h的蛋白样品，用带GFP抗体的Beads进行孵育，用Westert Blot进行检测，结果如图16(B)，左部分为RxLR192-GFP+CaATP-Flag实验的Input部分，相关蛋白都正常表达且被相应抗体结合显色：RxLR192-GFP被GFP抗体结合并显色，大小为48kDa；CaATP-Flag被FLAG抗体结合并显色，大小为30kDa。右部分为RxLR192-GFP+CaATP-Flag实验的IP部分，在GFP抗体检测中，RxLR192-GFP能被检测到，蛋白大小与Input部分一致，说明GFP beads能够正常结合带GFP标签的蛋白，而在FLAG抗体检测中，只有在RxLR192-GFP+CaATP-Flag的实验组中才能检测到CaATP-Flag重组蛋白，大小为30kDa，其他组合都无法检测到。说明了效应因子RxLR192与辣椒CaATP合成酶δ链(CaATP)互作。
将重组质粒RxLR192-NLuc和CaATP-CLuc转入GV3101，利用农杆菌瞬时表达技术，以本氏烟为模式作物，以RxLR192-NLuc+CaATP-CLuc为实验组1:1混合接种，以RxLR192-NLuc+CLuc、NLuc+CaATP-CLuc、NLuc+CLuc作为阴性对照1:1混合接种，参照2.2.23的方法利用植物活体光学成像系统捕捉荧光，结果如图16(C)，发现与对照相比，RxLR192-NLuc+CaATP-CLuc实验组可以发出荧光，由此基本可以确定效应因子RxLR192与辣椒CaATP合成酶δ链(CaATP)互作。这为进一步研究和阐明该效应因子的作用机制提供了理论基础和实验思路。
3.11Y2H验证RxLR192与辣椒含U-box结构域蛋白26(CaU-box)互作
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
验证效应因子RxLR192与辣椒含U-box结构域蛋白26(CaU-box)的互作关系，需获得靶标蛋白的全长序列。本研究以辣椒cDNA为模板，克隆CaU-box全长序列，按照2.2.7的实验方法将CaU-box全长构建到pGADT7载体上，与pGBT9-192共转进Y2HGold酵母菌株涂布SD/-Trp/-Leu培养基，30℃黑暗培养3-5d。挑取SD/-Trp/-Leu培养基上生长出单克隆均匀点样在各个缺陷型培养基上，30℃黑暗培养3-5d观察结果并拍照。结果如图17所示，RxLR192-BD与CaU-box-AD共转化后长出的单克隆菌落在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu+X-α-gal平板上生长且变蓝，阳性对照组生长且变蓝，阴性对照组不生长，表明效应因子RxLR192与辣椒含U-box结构域蛋白26(CaU-box)有极大可能存在互作关系。
3.12Y2H验证RxLR192与辣椒可能组蛋白H2Axb(CaH2Axb)互作
实验中用到的酵母缺陷型培养基购自宝日医生物技术(北京)有限公司，根据说明书使用。
验证效应因子RxLR192与辣椒可能组蛋白H2Axb(CaH2Axb)的互作关系，需获得靶标蛋白的全长序列。本研究以辣椒cDNA为模板，克隆CaH2Axb全长序列，按照2.2.7的实验方法将CaH2Axb全长构建到pGADT7载体上，与pGBT9-192共转进Y2HGold酵母菌株涂布SD/-Trp/-Leu培养基，30℃黑暗培养3-5d。挑取SD/-Trp/-Leu培养基上生长出单克隆均匀点样在各个缺陷型培养基上，30℃黑暗培养3-5d观察结果并拍照。结果如图18所示，RxLR192-BD与CaH2Axb-AD共转化后长出的单克隆菌落在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu+X-α-gal平板上生长且变蓝，阳性对照组生长且变蓝，阴性对照组不生长，表明效应因子RxLR192与辣椒可能组蛋白H2Axb(CaH2Axb)有极大可能存在互作关系。
3.13CaFBA-X1的致病性检测及对病原物侵染的影响
3.13.1CaFBA-X1亚细胞定位
本实验中所用的载体pBIN-GFP2为植物表达载体，在超高分辨率激光共聚焦显微镜下为绿色荧光，用来检测细胞中蛋白表达的所在位置。将CaFBA-X1构建到pBIN-GFP2载体上，将其与空载体GFP分别接种在本氏烟叶片上，48h后使用超高分辨率激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位，发现CaFBA-X1定位在细胞质中，如图19所示。
3.13.2CaFBA-X1的致病性检测
为了探究CaFBA-X1是否会引起细胞坏死，利用农杆菌瞬时表达技术，以INF1为阳性对照，GFP、buffer(10mM MgCl2缓冲液)为阴性对照，在本氏烟上瞬时表达CaFBA-X1，对其自身功能进行验证，结果如图20所示。
图20A结果显示，接种INF1的部位能够引起细胞坏死，而接种CaFBA-X1、GFP和buffer(10mM MgCl2缓冲液)的部位并不会引发细胞坏死。图20B的Western Bolt检测证明CaFBA-X1、INF1、GFP都可以在本氏烟均可成功表达。
3.13.3CaFBA-X1对病原物侵染的影响
为了探究CaFBA-X1对辣椒疫霉菌侵染的影响，利用农杆菌瞬时表达技术，在本氏烟叶片的左侧瞬时表达CaFBA-X1，在本氏烟叶片的右侧瞬时表达GFP作为对照，24h叶片左侧和右侧分别接种带有辣椒疫霉菌LT1534菌丝的菌块，28℃黑暗保湿培养，48h后在紫外灯下观察结果，为保证实验结果的准确性，实验叶片数量不少于30片。
结果如图21(A)显示，与GFP对照相比，瞬时表达CaFBA-X1处辣椒疫霉菌侵染病斑较小，对侵染病斑进行直径统计并提取辣椒疫霉菌DNA进行生物量分析得到相同结果(图21，B，C)。通过Western Bolt检测，证明了CaFBA-X1、GFP都可以在本氏烟上正常表达(图21，D)，CaFBA-X1能够抑制辣椒疫霉菌的侵染，CaFBA-X1负向调控RxLR192促进辣椒疫霉侵染，并正向调控植物的免疫，在植物中作为正调控因子发挥作用。
3.14辣椒CaATP合成酶δ链(CaATP)对病原物侵染的影响
为了探究CaATP对辣椒疫霉菌侵染的影响，利用农杆菌瞬时表达技术，在本氏烟叶片的左侧瞬时表达CaATP，在本氏烟叶片的右侧瞬时表达GFP作为对照，24h叶片左侧和右侧分别接种带有辣椒疫霉菌LT1534菌丝的菌块，28℃黑暗保湿培养，48h后在紫外灯下观察结果，为保证实验结果的准确性，实验叶片数量不少于30片。
结果如图22(A)显示，瞬时表达CaATP处辣椒疫霉菌侵染病斑面积与GFP对照相比没有明显差异，因此推断CaATP对辣椒疫霉菌的侵染没有明显影响，通过WesternBolt检测，证明了CaATP、GFP都可以在本氏烟上正常表达(图22，C)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.辣椒疫霉效应因子RxLR192片段，其特征在于，所述片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码如权利要求1所述的辣椒疫霉效应因子RxLR192片段。
3.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分；
所述生物材料含有如权利要求2所述的DNA分子。
4.如权利要求1所述的辣椒疫霉效应因子RxLR192片段、权利要求2所述的DNA分子或权利要求3所述的生物材料在抑制辣椒疫霉对植物的侵染中的应用；
通过在植物中表达所述辣椒疫霉效应因子RxLR192片段抑制辣椒疫霉对植物的侵染；
所述植物为辣椒或本氏烟。
5.辣椒疫霉效应因子RxLR192的互作蛋白在抑制辣椒疫霉对植物的侵染中的应用，所述互作蛋白为CaFBA-X1，CaFBA-X1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
所述植物为本氏烟或辣椒。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过促进植物细胞质中CaFBA-X1的表达来抑制辣椒疫霉对植物的侵染。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用于植物育种中。
8.抑制辣椒疫霉对植物的侵染的组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1所述的辣椒疫霉效应因子RxLR192片段和/或CaFBA-X1，所述植物为本氏烟或辣椒。
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