CN110804615B

CN110804615B - 辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因及其应用

Info

Publication number: CN110804615B
Application number: CN201911068052.1A
Authority: CN
Inventors: 李壮; 李海洋; 朱春原; 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110804615A

Abstract

本发明提供辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因及其应用。本发明首次揭示了辣椒疫霉效应因子RxLR553394(SEQ ID NO:2)的生物学功能，RxLR553394可以抑制Bax引发的坏死；进一步在辣椒疫霉中沉默RxLR553394，发现其可以削弱辣椒疫霉的致病性。本发明为辣椒疫霉致病机理与寄主互作的研究提供理论基础。

Description

辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因及其应用。

背景技术

辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是存在范围比较广且破坏力十分强大的依靠土壤传播的植物病原物之一，能够感染多种寄主作物，导致全球地区在内的重大经济损失。随着对卵菌研究的不断加深，研究发现，RxLR效应因子能够能被寄主植物的抗病R蛋白识别引发过敏性坏死反应(Hypersensitive response,HR)，也能抑制寄主产生的防御反应。因此RxLR效应因子在卵菌病原体与寄主的互作时发挥着关键作用。目前在卵菌的全基因组中已经发现数百种高度多样化的RxLR效应因子的基因，充分认识这些效应因子的功能与结构，对研究治理辣椒疫病的新策略具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2或3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:2或3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因(SEQ ID NO:1)来自辣椒疫霉菌标准菌株LT1534，序列全长为441bp，开放阅读框ORF为438bp，编码147个氨基酸(SEQ ID NO:2)，预测编码蛋白的分子量16.88kD。其中，第55-58位氨基酸为RxLR，1-22位氨基酸为信号肽，RxLR-dEER基序在信号肽之后。去除信号肽的辣椒疫霉效应因子 RxLR553394的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。

第二方面，本发明提供含有所述基因的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供所述基因或含有所述基因的生物材料在抑制Bax(膜通透性调控蛋白)介导的植物细胞死亡中的应用。

本发明中，Bax是指Bcl-2相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

第四方面，本发明提供所述基因或含有所述基因的生物材料在植物育种中的应用。应理解的是，育种目的为提高植物抗病性。

前述应用包括：将所述基因通过质粒导入植物中或通过基因工程手段整合到植物染色体上。

本发明中，所述植物包括辣椒、烟草(本氏烟)。

本发明首次揭示了辣椒疫霉效应因子RxLR553394的生物学功能，利用农杆菌介导的瞬时表达系统，对其功能做了初步探究，发现RxLR553394不能引起寄主植物叶片的坏死，也不能抑制INF1引发的坏死，但是可以抑制Bax引发的坏死；进一步地，在辣椒疫霉中沉默了RxLR553394，发现其不能影响辣椒疫霉的正常生长，但可以削弱辣椒疫霉的致病性，从而确定效应因子RxLR553394是在侵染寄主植物的过程中发挥作用，为辣椒疫霉致病机理与寄主互作的探究提供理论基础。

附图说明

图1为载体pBIN-GFP2的质粒图谱。

图2为载体pTOR-GFP的质粒图谱。

图3为本发明实施例1中效应因子RxLR553394基因的PCR扩增结果；其中，M： DNAMarker；泳道1-4：RxLR553394。

图4为本发明实施例3中553394-GFP PCR验证结果；其中，M：DNA Marker；泳道1-4：RxLR553394-GFP。

图5为本发明实施例3中效应因子RxLR553394在本氏烟上的致病性分析；其中， A：叶片正面；B：叶片反面；C：台盼蓝染色。

图6为本发明实施例3中效应因子RxLR553394抑制INF1引发的PTI的功能分析；其中，A：叶片正面；B：叶片反面；C：台盼蓝染色。

图7为本发明实施例3中效应因子RxLR553394抑制Bax引发的PCD的功能分析；其中，A：叶片正面；B：叶片反面；C：紫外照射；D：台盼蓝染色。

图8为本发明实施例3中效应因子RxLR553394的亚细胞定位结果。

图9为本发明实施例3中免疫印迹分析结果。

图10为本发明实施例4中靶向沉默RxLR553394的250bp碱基序列。

图11为本发明实施例4中PCR验证结果；其中，M：DNA Marker；泳道1-4：RxLR553394 250bp碱基序列。

图12为本发明实施例4中PCR验证结果；其中，M：DNA Marker；泳道1-4：RxLR553394–pTOR。

图13为本发明实施例4中沉默转化子生长速率分析。

图14为本发明实施例4中辣椒疫霉菌丝及孢子囊的形态。

图15为本发明实施例4中沉默转化子侵染辣椒结果；其中，A：叶片正面；B：叶片反面；C：紫外照射；D：台盼蓝染色。

图16为本发明实施例4中沉默转化子侵染本氏烟结果；其中，A：叶片正面；B：叶片反面；C：紫外照射；D：台盼蓝染色。

图17为本发明实施例4中沉默转化子致病性恢复结果；其中，A：叶片正面；B：叶片反面；C：紫外照射；D：台盼蓝染色。

具体实施方式

为了探讨RxLR效应因子在辣椒疫霉菌中的功能和致病机理，本发明选用辣椒疫霉菌标准菌株LT1534作为实验材料，结合现有的相关理论基础与实验条件，筛选出效应因子RxLR553394进行研究。

首先通过JGI数据库筛选出效应因子RxLR553394的碱基序列与其所编码的氨基酸序列，然后从辣椒疫霉LT1534中克隆出RxLR553394，根据测序结果与Fungi DB进行序列比对，比对结果完全一致，随后对RxLR553394进行生物信息学分析。将效应因子 RxLR553394连接到pBIN-GFP2载体上，利用转化农杆菌的瞬时表达的技术，在本氏烟中瞬时表达探究其功能，并且用Western Blot技术方法检测了基因蛋白的表达。结果发现效应因子RxLR553394能够在烟草中正常表达，不能引起烟草叶片的坏死，也不能抑制INF1(晚疫病激发子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)诱导的PTI，但是可以抑制Bax诱导的PCD。在本氏烟中瞬时表达效应因子RxLR553394之后，在共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位，结果发现效应因子RxLR553394定位在细胞核与细胞质中。

随后为进一步探究效应因子RxLR553394的功能，使用RNA干扰技术在辣椒疫霉LT1534中将其沉默，获得沉默转化子。对沉默转化子的生物学特征和致病能力进行分析，分别在辣椒和烟草中，接种LT1534、空载转化子和沉默转化子。结果发现，沉默转化子的生长速率及其菌丝形态与LT1534和空载转化子相比，没有明显变化。沉默转化子侵染辣椒和烟草的病斑明显减小，说明沉默RxLR553394使辣椒疫霉的致病性明显减弱。在本氏烟中瞬时表达RxLR553394，验证沉默转化子致病力能否恢复，结果发现瞬时表达RxLR553394能够使沉默转化子的致病性得到恢复。

研究结果显示，效应因子RxLR553394的功能可以抑制Bax诱导的细胞死亡，并且在细胞质和细胞核中发挥作用。通过分析效应因子RxLR553394的致病能力，沉默的转化子的感染性降低。说明RxLR553394在感染寄主植物中起着关键作用，为研究辣椒疫霉效应因子的功能和致病机制提供理论依据。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的大肠杆菌感受态Trans 5α购自泰安润梦生物科技技术有限公司；农杆菌菌株GV3101感受态由山东农业大学蔬菜病虫生物学重点实验室提供，也可市购获得；携带Bax、INF1的农杆菌菌株由南京农业大学植保学院窦道龙教授惠赠(参见WangQ,Han C,Ferreira A O,et al.Transcriptional Programming and FunctionalInteractions within the Phytophthora sojae RXLR Effector Repertoire[J].ThePlant Cell, 2011,23(6):2064-2086)。瞬时表达所用的载体pBIN-GFP2(图1)和基因沉默所用的载体pTOR-GFP(图2)均由南京农业大学植保学院窦道龙教授惠赠，也可市购获得。

以下实施例中涉及到的引物：按照引物设计的原则，利用软件DNAMAN和引物设计网站(https://sg.idtdna.com/primerquest/home/index)进行引物设计，设计了克隆辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因的全长引物，构建pBIN载体、构建pTOR载体时所需要的带有酶切位点的引物以及验证沉默转化子qRT-PCR的引物。设计的引物序列如表1 所示，引物由瑞博兴科生物公司合成。

表1 引物信息

实施例1辣椒疫霉RxLR553394基因克隆与序列分析

以辣椒疫霉菌LT1534总DNA为模板，按照PCR反应体系进行效应因子 RxLR553394基因克隆：25μL 10×PCR Mix，2μL上游引物，2μL下游引物，2μL DNA， 19μL ddH₂O，总体系为50μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55-65 ℃退火30s，72℃延伸10min，30个循环；72℃延伸10min。

PCR反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，结果如图3所示。PCR扩增结果显示，效应因子RxLR553394能扩增得到特异的目的条带，条带的大小与预期相符合。在紫外灯下用刀片将目的条带切下并进行胶回收。将基因回收产物构建到pEASY-T3 载体上，并转化到大肠杆菌中，挑取单克隆菌落摇菌培养后进行菌落PCR扩增。将疑似菌液送到测序公司进行检验。测序结果比对正确后，摇菌提质粒于-20℃保存备用。效应因子RxLR553394基因序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示。

利用Fungi DB网站对RxLR553394进行了序列比对，效应因子RxLR553394不存在同源性基因。效应因子的基本生物学信息利用DNAMAN软件进行分析。通过序列分析，可知辣椒疫霉效应因子RxLR553394序列全长为441bp，开放阅读框ORF为438bp，编码147个氨基酸，预测编码蛋白的分子量16.88kD。第55-58位氨基酸(RALR)为 RxLR，1-22位氨基酸为信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。

实施例2辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因核定位预测

利用网站(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)对辣椒疫霉效应因子RxLR553394的核定位进行预测，结果显示，效应因子RxLR553394有一个核定位序列为KPFKRREYKG，评分为6，推测其可能定位在细胞核与细胞质中。

实施例3辣椒疫霉效应因子RxLR553394功能的研究

3.1农杆菌介导的瞬时表达体系构建

将RxLR553394的基因去掉信号肽，根据pBIN-GFP2表达载体中的酶切位点，设计带有酶切位点的引物，克隆到基因片段后进行胶回收得到基因的回收产物，通过酶切、连接和转化将效应因子RxLR553394构建到pBIN-GFP2表达载体上，转化完成后挑取单克隆农杆菌菌斑进行菌落PCR验证，所用引物为pBIN-GFP2载体引物，验证结果如图4所示。结果表明，效应因子RxLR553394-GFP已经成功转化到农杆菌中，低温保存菌液，以备后续活化或接种实验。

重组质粒的构建方法如下：

(1)以辣椒疫霉菌LT1534总DNA为模板，用RxLR553394的带酶切位点的引物克隆效应因子片段，并进行切胶回收。

(2)将克隆的RxLR553394基因片段与载体pBIN-GFP2的质粒进行双酶切，基因片段酶切体系为：2μL 10×反应缓冲液、0.2μg DNA、1μL KpnI内切酶、1μL BamH I 内切酶，ddH₂O补足至30μL；载体酶切体系为：4μL 10×反应缓冲液、2μg DNA、2μL KpnI内切酶、2μLBamH I内切酶，ddH₂O补足至40μL。将酶切产物进行回收。

(3)将酶切产物进行连接，16℃连接6h以上，得到连接产物。酶切产物连接体系为：10μL SolutionI、3μL载体、7μL基因片段。

(4)向连接产物中加入30-50μL大肠杆菌感受态Trans 5α，轻轻吸打混匀，冰浴30min。

(5)在42℃水浴锅中水浴45s，然后快速放置于冰上冰浴2min。

(6)加入500μL无抗性液体LB培养基，37℃，200rpm震荡培养箱孵育45min-1h。

(7)室温下6000rpm离心1min，用100μL上清液重悬沉淀，然后均匀涂在含有Kana(50μg/μL)的固体LB平板上，37℃恒温培养箱中黑暗培养10-18h。

(8)沾取单克隆菌落至含有Kana(50μg/μL)的液体LB中，于37℃200rpm震荡培养箱中培养6-8h，将培养好的菌液做菌落PCR扩增，送至测序公司进行检验。序列比对完全一致，表明成功地将RxLR553394构建到pBIN-GFP2载体上(RxLR553394-GFP 重组质粒)。

农杆菌感受态的制备与转化：

将构建好的RxLR553394-GFP重组质粒转化至农杆菌中，进行后续对效应因子功能的研究，感受态的制备方法如下：

(1)将农杆菌GV3101(-80℃保存)置于冰上融化1h左右，沾取少量的农杆菌菌液，在含有Rif抗性的固体LB培养基上划折线，28℃恒温培养箱中黑暗培养2天。

(2)挑针沾取单克隆菌落于100ml含有Rif抗性液体LB中，28℃，200rpm震荡培养箱震荡培养至OD₆₀₀约0.5。

(3)将菌液转移至50mL BD管中，冰浴30min，4℃，4500rpm离心5min。

(4)弃上清，加入15mL 0.2M CaCl₂(预冷)，轻轻重悬，然后冰浴30min。

(5)然后4℃，4500rpm离心5min，收集菌体。

(6)弃上清，加入2ml含有20％甘油的0.1M CaCl₂(预冷)，轻轻重悬，分装入2mL 离心管(预冷)中，每管分装100μL，液氮速冻后于-80℃保存备用。

获得农杆菌感受态之后，将RxLR553394-GFP转化至农杆菌中，冻融法转化农杆菌的方法如下：

(1)向含有重组质粒的离心管中加入30μL农杆菌感受态，轻轻吸打混匀后，冰浴30min。

(2)液氮速冻1min后，在37℃水浴锅中水浴5min。

(3)加入500μL无抗性的液体LB，于28℃，200rpm震荡培养箱震荡培养3-5h。

(4)低速离心2min，将离心好的菌液均匀涂在含有Rif、Kana抗性的固体LB培养基中黑暗培养5天。

(5)观察到固体LB中出现单克隆菌落时，沾取单克隆菌斑到含Rif、Kana抗性的1mL液体LB培养基中震荡培养10h-18h。

(6)吸取菌液，用载体引物进行菌落PCR检验，如果检验正确即转化成功，便可保存菌液以备后续实验。

3.2效应因子RxLR553394自身致病性分析

探究效应因子自身功能的接种方案如下：在同一叶片，分别接种含有RxLR553394-GFP，INF1，GFP的诱导液(诱导液的组成：10mM的MgCl₂ 100ml、0.5M 的MES 2ml、0.1M的AS200μl)，一周左右观察症状并拍照记录。探究效应因子抑制 INF1引发的PTI功能的接种方案如下：在同一叶片，分别接种含有RxLR553394--GFP， Avr3a，GFP的诱导液，24h后接种含有INF1的诱导液，一周左右观察症状并拍照记录。探究效应因子抑制Bax引发的PCD功能的接种方案如下：在同一叶片，分别接种含有RxLR553394-GFP，GFP的诱导液，24h后接种含有Bax的诱导液，一周左右观察症状并拍照记录。农杆菌接种方法如下：

(1)将已转化重组质粒的农杆菌加入到50mL含有Rif、Kana抗性液体LB中，于 28℃，260rpm震荡培养6-8h，至OD₆₀₀约为1.0。

(2)室温下3500rpm，离心5min，倒掉上清液(保留少量用于重悬)并收集菌体，用10mM MgCl₂震荡摇晃洗涤2-3次。

(3)配制农杆菌诱导液，用适量的诱导液悬浮菌体，使菌液的OD₆₀₀达到0.5左右，然后在28℃培养箱中黑暗培养3-5h。

(4)使用生长较好的本氏烟，选取长势较好的且大小基本一致的叶片接种农杆菌。在叶片需要接种的相应的位置扎一个小孔，用注射器吸菌液取，从叶片背面注射菌液至叶片中。

(5)一周左右观察接种叶片的症状，并对叶片拍照记录。

台盼蓝染色实验：

(1)将水煮沸，放入盛有台盼蓝稀释液的烧杯，预热1min。

(2)将接种过的叶片转移到台盼蓝稀释液中，沸水浴1-2min，期间轻轻摇晃，防止煮样不均匀。

(3)将叶片连同台盼蓝稀释液一同倒入大培养皿中，浸泡12-18h。

(4)将浸泡过台盼蓝稀释液的叶片取出，更换水合氯醛脱色液，继续浸泡，此时的叶片比较柔软，更换时注意不要损伤叶片，大约每12h更换一次水合氯醛，直到叶片完全脱色。

(5)将脱色后的叶片放入95％酒精浸泡后拍照。

利用农杆菌介导的瞬时表达技术，验证效应因子RxLR553394自身致病性，以空载GFP和诱导液作为阴性对照，以INF1为阳性对照，分别接种至同一时期的长势相同的本氏烟叶片，每次接种15-20片，重复3-4次，以保证实验结果的可靠性，避免偶然性的发生。接种7天后观察结果，拍照记录，并进行台盼蓝染色，更加直观的表现出坏死的程度，接种结果如图5所示。结果表明，与空载GFP和Buffer相比，接种7天后，阳性对照INF能够引起本氏烟叶片坏死，效应因子RxLR553394不能够引起本氏烟叶片的坏死。

3.3效应因子RxLR553394抑制INF1引发的PTI功能分析

以空载GFP和诱导液作为阴性对照，无毒基因Avr3a为阳性对照，分别接种至同一时期的长势相同的本氏烟叶片，24h后接种含有INF1的诱导液，每次接种15-20片，重复3-4次，以保证实验结果的可靠性，避免偶然性的发生。接种7天后观察结果，拍照记录，并进行台盼蓝染色，更加直观的表现出坏死的程度，接种结果如图6所示。结果表明，与空载GFP和诱导液相比，接种7天后，阳性对照Avr3a能够抑制INF1引起本氏烟叶片坏死，效应因子RxLR553394不能够抑制INF1起本氏烟叶片的坏死。

3.4效应因子RxLR553394抑制PCD引发的PTI功能分析

以空载GFP和诱导液作为阴性对照，分别接种至同一时期的长势相同的本氏烟叶片，24h后接种Bax，每次接种15-20片，重复3-4次，以保证实验结果的可靠性，避免偶然性的发生。接种7天后观察结果，拍照记录，并进行台盼蓝染色，更加直观的表现出坏死的程度，接种结果如图7所示。结果表明，与空载GFP和诱导液相比，接种7 天后，效应因子RxLR553394能够明显抑制Bax引起本氏烟叶片的坏死。

3.5效应因子RxLR553394亚细胞定位

本发明所用的植物表达载体pBIN-GFP2，在共聚焦显微镜下显绿色荧光，可以用于检测细胞中蛋白表达所在的位置。将含有效应因子RxLR553394-GFP与空载GFP的诱导液分别接种至本氏烟的叶片上，48h后用荧光显微镜初步观察，确定基因是否正常表达，然后制作叶片切片使用共聚焦显微镜观察亚细胞定位，观察结果如图8所示。结果显示，效应因子RxLR553394的亚细胞定位，均定位在细胞质与细胞核中。

3.6Western Blot检测蛋白的表达

为了验证效应因子RxLR553394能够在烟草中正常表达，选取生长4-6周的长势较好的本氏烟，利用农杆菌瞬时表达技术，将效应因子RxLR553394接种于烟草叶片中瞬时表达，48h后在黑暗条件下用长波紫外灯照射，并选取荧光程度高的叶片，液氮磨样，提取蛋白进行Western Blot检测蛋白表达，也可同时检测验证效应因子 RxLR553394功能时的其他蛋白表达情况。验证结果如图9所示。结果显示，目的条带如黑色箭头指示，下方为对应内参Actin结果，表明效应因子RxLR553394、GFP、 INF1和Bax的蛋白均能在本氏烟中正常表达。

Western Blot检测方法如下：

(1)将农杆菌瞬时表达2天后的本氏烟叶片摘下，用液氮研磨至粉末状，将100mg左右的叶片粉末收集到到2mL离心管中，加650μL的2×加样缓冲液，上下颠倒混匀，冰上放置。

(2)将样品置于沸水中煮沸5min，振荡混匀，再次煮沸5min。

(3)室温下12000rpm离心5min，吸取上清液至新的离心管中，再次离心5min，彻底去除沉淀。

(4)吸取上清至新的离心管中，准备上样，剩下的-20℃保存。

(5)准备SDS-PAGE电泳，每个泳道加20-40μL样品，5-8μL Marker，电压调至 150V，时间约为2h。

(6)电泳后，将泡过的蛋白胶与PVDF膜放到转膜仪中，进行恒流转膜，时间约为1.5h。

(7)转膜结束后，取下PVDF膜于方盒中，加入TBST洗涤3-5次(水平摇床)，每次5min左右。

(8)然后向方盒中加入25mL 5％的脱脂奶粉封闭液，室温下封闭1.5-2h(水平摇床)。

(9)加入25ml一抗(3000：1)，孵育90min(水平摇床)。

(10)孵育结束后用TBST洗涤4次，每次5min；加入25mL二抗(5000-20000：1)，室温下反应1h(水平摇床)。

(11)反应结束后用TBST洗涤3次，每次5min。

(12)加入显色液(1:1配比)，ECL显影拍照。

其中，一抗为单克隆抗体鼠抗一抗Anti-GFP，二抗为兔抗鼠二抗，一抗、二抗均购自Invitrogen公司。

实施例4辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因沉默

4.1辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默载体构建

以辣椒疫霉LT1534总DNA为模板，利用带有酶切位点(EcoR I与EcoR V)的基因沉默片段引物，根据基因沉默的原理，将基因沉默片段反向插入，因此设计酶切位点时，与载体的酶切位点相反。基因片段选取了250bp，如图10所示，进行PCR扩增，得到目的条带，如图11所示，然后切胶回收，通过酶切连接转化实验，将基因片段构建到pTOR-GFP沉默载体上，挑取带有沉默载体质粒的大肠杆菌单克隆菌落摇菌，利用载体引物进行菌落PCR验证，结果如图12所示，结果表明，效应因子RxLR553394 基因沉默载体构建成功。

4.2PEG介导的原生质体转化：包括制备原生质体、原生质体转化和原生质体重生三部分。

A、原生质体的制备：

(1)选取在NPB固体培养基上长势较好的辣椒疫霉菌LT1534，用直径为5mm的打孔器沿着平板外沿打一圈小孔，选取10-15块菌饼移植到无菌培养皿中，加入35mL液体NPB培养基，于25℃培养箱黑暗培养2天后取出备用，不可培养时间过长，菌体过老会影响后续质壁分离。

(2)将每个培养皿中的液体NPB培养倒入废液缸，可以不去掉琼脂培养基，用 25-30mL的无菌去离子水漂洗一次。

(3)用25-30mL的0.8M甘露醇再漂洗一次。

(4)将菌丝转移至深培养皿中，加入30mL 0.8M甘露醇，室温下浸泡10min，使其质壁分离，为了使质壁分离的效率提高，可用灭菌手术刀将菌丝充分散开。

(5)在浸泡10min期间，配制酶解液和PEG4000，酶解液室温下备用，PEG4000 用0.45μm的细菌过滤器过滤除菌，4℃保存备用。

(6)浸泡完毕后，弃滤液，收集菌丝，加入20mL左右的酶解液，将菌丝充分分散开，使酶解的效果达到最佳。

(7)用锡箔纸将培养皿封闭，室温下50rpm轻轻震荡40-60min(水平摇床)，酶解效果可以通过在光镜下观察释放出原生质体的数量来确定。

(8)用70μm BD Falcon Cell strainer细胞滤网过滤酶解产物，弃培养基残渣和菌丝碎片，收集原生质体滤液于50mL BD管中。

(9)将50mL BD置于水平离心机中，室温下1200×g离心2min。

(10)弃滤液，加入30mL W5solution(W5 solution的组成：KCl 0.093g、 CaCl₂·2H₂O 4.6g、154mM NaCl 2.25g、葡萄糖7.8g，加水定容至250mL)洗涤原生质体，为了方便重悬，可以先加入15mL W5液重悬原生质体，然后再加15mL补足至 30mL。

(11)室温下1200×g离心2min，将W5液去除干净。

(12)根据载体质粒样品数量，加入适量的MMG solution(MMG solution的组成：甘露醇18.22g、MgCl₂·6H₂O0.76g、MES 2mL，加水定容至250mL)重悬原生质体(10mL 的MMG溶液对应10个样品左右)，室温静置10min，原生质体制备完成。

B、原生质体转化试验方法：

(1)向50mL BD管中加入20μL载体质粒与1mL原生质体，轻轻摇晃使其混匀，不可剧烈摇晃，然后冰浴10-20min。

(2)将储存在4℃的PEG4000取出，吸取1.74mL PEG4000分三次(每次0.58mL)缓慢加入到50mL BD管中，并轻轻摇晃使其混匀，动作要轻柔。

(3)冰浴15min后加入25mL含有Amp(50μg/μL)抗性的液体PM培养基(提前放于4 ℃预冷)。

(4)冰浴10min后，25℃恒温培养箱中黑暗培养12-18h(倾斜放置)。

C、原生质体重生试验方法：

(1)取出培养箱中的原生质体，室温下2000×g离心2min。

(2)弃上清，剩余约10ml溶液重悬原生质体。

(3)向每个50mL BD管中加入25mL含有(G418、Rif 50μg/μL)抗生素的固体PM 培养基，轻轻颠倒混匀。

(4)将每个BD管中的PM培养基平均倒入两个灭菌的培养皿中，25℃恒温培养箱中黑暗培养。

沉默疑似转化子的验证：

重生后的平板上会长出菌落，每个单克隆菌落为一个疑似转化子，扣取单克隆菌落至含有G418(50μg/μl)抗生素的固体NPB培养基中，25℃黑暗培养5天。选取在 NPB固体培养基上长势较好的疑似转化子移菌备份，剩余的部分切成小块，加入35mL 液体NPB培养基黑暗培养5天，取出后收集菌丝提取总RNA，然后设计引物，通过 qRT-PCR检验沉默效率，以LT1534为对照，重复三次实验，沉默效率达到80％左右，即为沉默成功。最终筛选获得了两个沉默效率80％以上的沉默转化子和一个空载转化子。

4.3辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默转化子生物学分析

4.3.1 RxLR553394沉默转化子生长速率分析

将辣椒疫霉LT1534、空载转化子、RxLR553394沉默转化子于同一时间转移至新的无抗生素固体NPB培养基中，每个菌株做15个重复，于25℃恒温培养箱中黑暗倒置培养3天后，观察菌落的生长情况，对各个平板的菌落直径进行测量并拍照记录，并对菌落直径的数据进行处理。实验结果如图13所示。结果表明，与辣椒疫霉LT1534 及空载转化子相比，效应因子RxLR553394沉默转化子菌落的生长速度、菌落直径及形态没有明显的变化。

4.3.2 RxLR553394沉默转化子菌丝形态与孢子囊形态

将培养好的辣椒疫霉LT1534及其转化子的插片平板取出，用镊子将玻片从培养基中取出，制作临时玻片，也可以制作永久玻片以备后续观察，在OLYMPUS BX-53 荧光显微镜40×下观察并拍摄DIC照片。然后将平板打孔并用去离子水冲洗数小时，放至低温下6-8h诱导产生孢子囊，用牙签挑取菌丝于载玻片上，制作临时玻片于显微镜下40×观察孢子囊的形态并拍摄DIC照片，拍摄时要迅速，挑取菌丝后将平板继续放回低温培养箱中，防止孢子囊在室温下破裂释放游动孢子，影响对孢子囊的观察效果。实验结果如图14所示。结果显示，与LT1534和空载转化子相比，两个沉默转化子的菌丝形态与孢子囊的形态均没有明显的变化，说明沉默效应因子RxLR553394 对辣椒疫霉菌的生长发育没有明显影响。

4.4辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默转化子致病性分析

4.4.1辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默转化子对辣椒的致病性

选取长势一致的LT1534、空载转化子和沉默转化子，用5mm打孔器打取菌饼，以备接种。选取生长5周左右的辣椒苗和本氏烟，选择长势相同的叶片用注射器针头扎小孔，接种菌块进行侵染。用辣椒疫霉标准菌株LT1534作为对照，每个大培养皿放8片叶片，做3次重复实验。2天后观察症状并拍照记录，再进行紫外观察和台盼蓝染色观察。结果如图3-16所示。结果显示，与LT1534和空载转化子相比，沉默转化子侵染辣椒的病斑大小明显减小，说明沉默效应因子RxLR553394使得辣椒疫霉侵染辣椒的能力下降了，降低了辣椒疫霉的致病性。

4.4.2辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默转化子对本氏烟的致病性

选取生长5周左右的本氏烟，用同一时期的LT1534、空载转化子和沉默转化子，在长势相同的叶片用注射器针头扎小孔，接种菌块进行侵染。用辣椒疫霉标准菌株 LT1534作为对照，每个大培养皿放6片叶片，做3次重复实验。2天后观察症状并拍照记录病斑直径大小，再进行紫外观察和台盼蓝染色观察。结果如图16所示。结果显示，与LT1534和空载转化子相比，沉默转化子侵染本氏烟的病斑大小明显减小，说明沉默效应因子RxLR553394使得辣椒疫霉侵染本氏烟的能力下降了，降低了辣椒疫霉的致病性。

4.4.3辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默转化子致病性恢复

为了探究辣椒疫霉效应因子RxLR553394沉默转化子被削弱的致病性，能否通过瞬时表达得以恢复，因此选取生长5周左右的本氏烟，在长势相同的叶片用注射器针头扎小孔，先接种农杆菌GFP与RxLR553394-GFP进行瞬时表达，24h后用同一时期的LT1534、空载转化子和沉默转化子，接种菌块进行侵染。每个大培养皿放6片叶片，做3次重复实验。2天后观察症状并拍照记录病斑直径大小，再进行紫外观察和台盼蓝染色观察。结果如图17所示。结果显示，与接种了空载GFP的LT1534和沉默转化子相比，接种了553394-GFP的沉默转化子侵染本氏烟的病斑大小明显增大，说明瞬时表达效应因子RxLR553394能够使辣椒疫霉的致病性得以恢复。

本发明对辣椒疫霉效应因子RxLR553394的功能进行了验证，通过对其生物信息学的预测，确定了信号肽的位置，以及预测了其亚细胞定位。在此基础上，利用去信号肽的基因序列，将基因构建到pBIN-GFP2表达载体上，利用农杆菌介导的瞬时表达系统，对其功能做了初步探究，发现RxLR553394不能引起寄主植物叶片的坏死，也不能抑制INF1引发的坏死，但是可以抑制Bax引发的坏死。同时，还在辣椒疫霉中沉默了RxLR553394，发现其不能影响辣椒疫霉的正常生长，但是可以削弱辣椒疫霉的致病性，从而确定效应因子RxLR553394是在侵染寄主植物的过程中发挥作用，为辣椒疫霉致病机理与寄主互作的探究提供了理论基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 441

<212> DNA

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 1

atgcgcctcg gttacttctt gcttgcgact atcgttggat ttttggcttg tgacaatgcc 60

acagcttccg tctcggagtc tacaagctcc aagctgaccg cgcgcgagga acatcccatc 120

cacggacgta ttggcgactt tactgccggc catgacaaca agcgagctct acgcagcgaa 180

gatgaagacg gcgatgctga cgactccgat gacgaagaga gagatctgat tctttcaacg 240

atccatcgac caaagtactg gcgctggttt aaggctggaa tgaccccgta cgcggtccaa 300

caagttttgg gtctcacagg cgtcagacgt ctctggaagc ccttcaagag gcgtgagtac 360

aagggctatg tcgtgttcta cactgagcag tgccacaagc cggaatacca cgatttctgc 420

aagaaacacg ccgacccgta g 441

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 2

Met Arg Leu Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Thr Ile Val Gly Phe Leu Ala

1 5 10 15

Cys Asp Asn Ala Thr Ala Ser Val Ser Glu Ser Thr Ser Ser Lys Leu

20 25 30

Thr Ala Arg Glu Glu His Pro Ile His Gly Arg Ile Gly Asp Phe Thr

35 40 45

Ala Gly His Asp Asn Lys Arg Ala Leu Arg Ser Glu Asp Glu Asp Gly

50 55 60

Asp Ala Asp Asp Ser Asp Asp Glu Glu Arg Asp Leu Ile Leu Ser Thr

65 70 75 80

Ile His Arg Pro Lys Tyr Trp Arg Trp Phe Lys Ala Gly Met Thr Pro

85 90 95

Tyr Ala Val Gln Gln Val Leu Gly Leu Thr Gly Val Arg Arg Leu Trp

100 105 110

Lys Pro Phe Lys Arg Arg Glu Tyr Lys Gly Tyr Val Val Phe Tyr Thr

115 120 125

Glu Gln Cys His Lys Pro Glu Tyr His Asp Phe Cys Lys Lys His Ala

130 135 140

Asp Pro

145

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> 辣椒疫霉(Phytophthora capsici)

<400> 3

Ser Val Ser Glu Ser Thr Ser Ser Lys Leu Thr Ala Arg Glu Glu His

1 5 10 15

Pro Ile His Gly Arg Ile Gly Asp Phe Thr Ala Gly His Asp Asn Lys

20 25 30

Arg Ala Leu Arg Ser Glu Asp Glu Asp Gly Asp Ala Asp Asp Ser Asp

35 40 45

Asp Glu Glu Arg Asp Leu Ile Leu Ser Thr Ile His Arg Pro Lys Tyr

50 55 60

Trp Arg Trp Phe Lys Ala Gly Met Thr Pro Tyr Ala Val Gln Gln Val

65 70 75 80

Leu Gly Leu Thr Gly Val Arg Arg Leu Trp Lys Pro Phe Lys Arg Arg

85 90 95

Glu Tyr Lys Gly Tyr Val Val Phe Tyr Thr Glu Gln Cys His Lys Pro

100 105 110

Glu Tyr His Asp Phe Cys Lys Lys His Ala Asp Pro

115 120

<210> 4

<211> 192

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Met Asp Gly Ser Gly Glu Gln Leu Gly Ser Gly Gly Pro Thr Ser Ser

1 5 10 15

Glu Gln Ile Met Lys Thr Gly Ala Phe Leu Leu Gln Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Asp Arg Ala Gly Arg Met Ala Gly Glu Thr Pro Glu Leu Thr Leu Glu

35 40 45

Gln Pro Pro Gln Asp Ala Ser Thr Lys Lys Leu Ser Glu Cys Leu Arg

50 55 60

Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn Met Glu Leu Gln Arg Met Ile

65 70 75 80

Ala Asp Val Asp Thr Asp Ser Pro Arg Glu Val Phe Phe Arg Val Ala

85 90 95

Ala Asp Met Phe Ala Asp Gly Asn Phe Asn Trp Gly Arg Val Val Ala

100 105 110

Leu Phe Tyr Phe Ala Ser Lys Leu Val Leu Lys Ala Leu Cys Thr Lys

115 120 125

Val Pro Glu Leu Ile Arg Thr Ile Met Gly Trp Thr Leu Asp Phe Leu

130 135 140

Arg Glu Arg Leu Leu Val Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp Glu Gly

145 150 155 160

Leu Leu Ser Tyr Phe Gly Thr Pro Thr Trp Gln Thr Val Thr Ile Phe

165 170 175

Val Ala Gly Val Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Trp Lys Lys Met Gly

180 185 190

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)

<400> 5

Met Asn Phe Arg Ala Leu Phe Ala Ala Thr Val Ala Ala Leu Val Gly

1 5 10 15

Ser Thr Ser Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ser Gln Gln Thr Val Ala Tyr

20 25 30

Val Ala Leu Val Ser Ile Leu Ser Asp Thr Ser Phe Asn Gln Cys Ser

35 40 45

Thr Asp Ser Gly Tyr Ser Met Leu Thr Ala Thr Ser Leu Pro Thr Thr

50 55 60

Glu Gln Tyr Lys Leu Met Cys Ala Ser Thr Ala Cys Lys Thr Met Ile

65 70 75 80

Asn Lys Ile Val Ser Leu Asn Ala Pro Asp Cys Glu Leu Thr Val Pro

85 90 95

Thr Ser Gly Leu Val Leu Asn Val Tyr Ser Tyr Ala Asn Gly Phe Ser

100 105 110

Ser Thr Cys Ala Ser Leu

115

Claims

1.辣椒疫霉效应因子RxLR553394基因，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)的基因：

(a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.含有权利要求1所述基因的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

3.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在抑制Bax介导的植物细胞死亡中的应用，所述植物为辣椒或烟草。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述基因通过质粒导入植物中或通过基因工程手段整合到植物染色体上。

5.权利要求1所述基因或权利要求2所述生物材料在植物育种中抑制Bax介导的植物细胞死亡或削弱辣椒疫霉的致病性中的应用，所述植物为辣椒或烟草。