CN102268445A - 一种辣椒疫霉菌诱导坏死蛋白Pcnpp1基因分离、体外突变及其沉默突变体制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，特别提供了克隆自辣椒疫霉的1个诱导坏死蛋白基因Pcnpp1及其诱导组织细胞死亡的功能特性。依据现代基因操作技术，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染辣椒寄主及其调控组织细胞死亡乃至导致受害部位产生明显坏死症状的性能；证明了该基因氨基酸序列中4个氨基酸为蛋白酶活性关键氨基酸。因此，该技术发明提供了辣椒疫霉一个具诱导坏死性能的重要功能基因及其研究技术体系，相关技术规程为深入开展植物病原卵菌重要功能基因研究提供了的技术储备。
Description
技术领域
本发明属分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种辣椒疫霉菌诱导坏死蛋白基因分离、体外突变及其沉默突变体制备方法。此外，系证明了该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白诱导辣椒、烟草叶片组织细胞坏死乃至产生明显症状的功能特性。
背景技术
植物病原卵菌侵染寄主、破坏寄主防御系统乃至对寄主产生破坏或致病作用，其中效应蛋白是病原卵菌分泌的一类重要效应因子，如诱导坏死蛋白(necrosis-inducing protein，NPP)是植物病原卵菌侵染或与寄主互作过程中分泌的一种坏死效应蛋白，具破坏寄主免疫系统、诱导寄主组织细胞坏死乃至产生明显症状的作用，因此该类效应蛋白是植物病原卵菌侵染寄主过程中分泌的一类重要的致病因子。
诱导坏死蛋白(NPP)是由细菌、真菌及卵菌等分泌的一种重要蛋白因子，能诱导双子叶植物组织细胞产生坏死反应，还能激发植物产生乙烯、MAP激酶活化、植保素合成、PR基因诱导及胞质Ca2+释放等防御反应。该类基因广泛分布于不同生物中，但不同生物体的该类基因数量存在差异。研究表明多数细菌、真菌基因组中含2-4个NPP基因，而多数植物病原卵菌基因组中含多个NPP基因成员。根据辣椒疫霉(Phytophthora capsici)全基因组信息，辣椒疫霉基因组中约含27个NPP基因，而且资料表明NPP基因家族分布特性可能与病菌寄主范围多样性或功能特异性有关。研究表明，一些非致病性生物也含适宜数量的NPP基因，由此推理NPP蛋白功能具多样性，不同种菌NPP基因数量、结构及其功能特性存在差异。此外，不同物种的NPP基因氨基酸序列高度保守，绝大多数NPP基因氨基酸序列N端存在两个半胱氨酸，中间部分均具GHRHDWE基序，该保守区与其它已知蛋白序列无同源性，说明该类蛋白具功能特异性。另外，NPP基因成员广泛存在于多数微生物体内，由此推断该类基因在病原与寄主植物互作过程中可能起重要的作用。资料表明NPP蛋白在植物病原菌致病过程中扮演着重要的角色，已积累了一些有关植物病原细菌、真菌NPP基因克隆及其功能信息，但还没有关植物病原卵菌NPP基因克隆及其功能研究的资料积累。
在世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物的病害，给农业造成了严重的经济损失，在此基础上，选取重要物病卵菌材料，以重要致病因子基因为研究对象，借助基因与蛋白操作技术，探明关键基因功能特性，创建其技术操作体系，预期研究具重要的理论与实践意义。目前无公开发表过辣椒疫霉NPP基因功能研究技术规程及其致病相关功能特性技术材料。
发明内容
基于上述的原因，本发明提供了1个克隆自辣椒疫霉的诱导坏死蛋白基因Pcnpp1及其功能分析技术，特别涉及该蛋白基因的分离、体外突变及其沉默突变体制备方法，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主及其病程发展过 程，利用体外基因突变技术界定了4氨基酸为调控该蛋白酶活性的关键氨基酸，并立足于基因转化和基因沉默技术证明了该基因具破坏寄主叶片组织细胞的性能，导致受害部位产生明显的症状。因此，该基因是辣椒疫霉NPP基因家簇中的一个重要功能基因，本技术发明为深入开展植物病原卵菌致病基因功能特性研究提供了适宜的技术储备，创建了其技术操作技术规程，充实植物病原卵菌与寄主互作的分子机制资料，利于建立卵菌病害综合防控技术策略。
本发明提供的npp基因，其基因序列如Seq ID No：1所示；其蛋白质氨基酸序列为Seq ID NO：2所示。该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白能够导致辣椒、烟草叶片产生坏死。
该基因有705个碱基，编码一种含234个氨基酸的蛋白质，分子量为25.5kDa，信号肽含有18个氨基酸(为Seq ID NO：2序列中1-18的氨基酸)，无N-糖基化位点，无内含子。
该npp基因与JGI中的，所有npp基因氨基酸序列进行比对，发现1个npp基因(jgi/phycaf7/7756)与Pcnpp1基因氨基酸同源性高达99.57％，其它结构完全相同，因此可以确认该基因为辣椒疫霉一个npp基因。
该基因的具体克隆制备方法为：
1、基因克隆具体步骤：
A：采用CTAB法提取辣椒疫霉DNA，参试菌株CBS121657，荷兰菌种保藏中心提供；
B：根据已报道的辣椒疫霉基因组诱导坏死蛋白基因序列，设计特异引物pcnpp1F(其序列如Seq ID No：3所示)和pcnpp1R(其序列如Seq ID No：4所示)，利用PCR技术扩增辣椒疫霉诱导坏死蛋白基因，阳性克隆测序获得基因全长；
2、辣椒疫霉诱导坏死蛋白Pcnpp1基因在辣椒烟草内瞬时表达步骤：
A：根据上面获得的Pcnpp1基因序列，设计特异引物pvxF(其序列如Seq ID No：5所示)和pvxR(其序列如Seq ID No：6所示)，构建Pcnpp1基因瞬时表达载体(如附图1所示)，将目的基因克隆至表达载体PVX(pGR106)中。
B：提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选抗利福平及卡那霉素的农杆菌转化子。
C：阳性农杆菌化子利用LB液体培养基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片中，使其进行瞬时表达。
3、Pcnpp1基因活性位点突变及其突变基因瞬时表达方法具体步骤：
A：根据已报道的npp基因氨基酸序列结构，借助overlap-PCR方法，利用引物Seq ID No：3-14分别将其与其它同类基因比对分析界定的4个关键氨基酸(D112A，H120A，D123A，E125A)进行点突变及线性突变D112A/H120A/D123A/E125A，以验证这4个氨基酸是否为该基因的酶活性中心关键氨基酸。
B：突变序列经测序验证后，利用引物Seq ID No：5和Seq ID No：6构建PVX(pGR106)表达载体。提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，筛选抗利福平及卡那霉素的农杆菌转化子。
C：筛选的农杆菌转化子用LB液体培养基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml) 震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片，使其进行适宜的瞬时表达，通过与对照症状比较，确定活性位点氨基酸突变效果。
4、辣椒疫霉诱导坏死蛋白Pcnpp1基因沉默突变体获得及致病性鉴定步骤：
A：根据Pcnpp1基因序列，设计特异引物gsF(其序列如Seq ID No：17所示)和gsR(其序列如Seq ID No：18所示)，构建Pcnpp1基因沉默表达载体，将目的基因克隆至沉默表达载体PHAM34中。
B：分别提取重组表达质粒以及标记质粒PHSPNpt，按比例混合后转化辣椒疫霉原生质体，同时以野生型辣椒疫霉菌株及仅转化标记质粒PHSPNpt的菌株为对照，筛选抗G418的转化子。
C：转化子再培养及表型生物学分析。
D：分别提取转化子菌株及其对照菌株基因组总RNA，设计Pcnpp1基因特异引物nppRTF(其序列如Seq ID No：19所示)和nppRTR(其序列如Seq ID No：20所示)；辣椒疫霉内参基因actinA基因特异引物actinAF(其序列如Seq ID No：21所示)和actinAR(其序列如Seq ID No：22所示)，然后分别借助反转录PCR(RT-PCR)及荧光定量PCR(Q-RT-PCR)在基因水平检测Pcnpp1基因沉默效率。
E：沉默转化子菌株与对照组(野生型辣椒疫霉菌及转化标记质粒PHSPN菌株)的游动孢子分别接种于辣椒叶片，观察比较接种辣椒叶片的症状变化。
本发明所用的载体和宿主菌均为常见，pUC19为Pcnpp1基因宿主载体，DH5α为宿主细胞，PVX(pGR106)为Pcnpp1基因表达载体，农杆菌GV3101为该基因的表达宿主菌，PHAM34为沉默表达载体，PHSPNpt为沉默表达的标记质粒。
综上所述，本发明提供了1个克隆自辣椒疫霉的诱导坏死蛋白基因Pcnpp1及其功能分析技术，特别涉及该蛋白基因的分离、体外突变及其沉默突变体制备方法。该基因是辣椒疫霉NPP基因家簇中的一个重要功能基因，本技术发明为深入开展植物病原卵菌致病基因功能特性研究提供了适宜的技术储备，创建了其技术操作技术规程，充实植物病原卵菌与寄主互作的分子机制资料，利于建立卵菌病害综合防控技术策略。
附图说明
图1.Pcnpp1基因重组表达载体示意图；
图中Kan为卡那抗性，Cla I和Not I为双酶切位点，Pcnpp1为目的基因；
图2.Pcnpp1基因于烟草叶片中瞬时表达的组织细胞病变结果灰度图；
图中A：Pcnpp1基因农杆菌转化子接种烟草叶片3天后产生坏死斑；B：空载体pGR106接种烟草叶片3天后无任何症状；C：双蒸水接种烟草叶片3天后无任何症状，阳性对照；
图3.Pcnpp1基因辣椒叶片中的瞬时表达结果灰度图；
图中A：Pcnpp1基因农杆菌转化子接种辣椒叶片3天后产生明显坏死斑；B：空载体pGR106接种辣椒叶片3天后无任何症状；C：双蒸水接种辣椒叶片3天后无任何症状，阳性对照；
图4.Pcnpp1基因4个关键氨基酸点突变或线性突变后于烟草叶片内瞬时表达引起叶片的症状反应灰度图；
图中A：Pcnpp1野生型基因接种烟草叶片7天后产生坏死斑，B：PVX空载体接种烟草叶片7天后无任何症状；C：双蒸水接种烟草叶片7天后无任何症状；D：Pcnpp1D112A接种烟草叶片7天后无任何症状；E：Pcnpp1H120A接种烟草叶片7 天后无任何症状；F：Pcnpp1D123A接种烟草叶片7天后无任何症状；G：Pcnpp1E125A接种烟草叶片7天后无任何症状；H：Pcnpp1112/120/123/125A接种烟草叶片7天后无任何症状，结果表明野生型基因能够导致烟草叶片产生坏死斑，该基因4个关键氨基酸点突变或线性突变均使基因编码的蛋白酶活性丧失；
图5.Pcnpp1基因4个关键氨基酸点突变或线性突变后于辣椒叶片内瞬时表达引起叶片的症状反应灰度图；
图中A：Pcnpp1野生型基因接种辣椒叶片7天后产生坏死斑，B：PVX空载体接种辣椒叶片7天后无任何症状；C：双蒸水接种辣椒叶片7天后无任何症状；D：Pcnpp1D112A接种辣椒叶片7天后无任何症状；E：Pcnpp1H120A接种辣椒叶片7天后无任何症状；F：Pcnpp1D123A接种辣椒叶片7天后无任何症状；G：Pcnpp1E125A接种辣椒叶片7天后无任何症状；H：Pcnpp1112/120/123/125A接种辣椒叶片7天后无任何症状，结果表明野生型基因能够导致辣椒叶片产生坏死斑，4个关键氨基酸的分别突变或同时突变菌使其编码的酶活性丧失；
图6.Pcnpp1基因稳定沉默RT-PCR检测结果电泳图；
图中显示Pcnpp1基因在沉默转化子中的转录水平。M：DNA标准分子量，WT：野生型辣椒疫霉菌株，CK：转标记质粒转化子，A6：Pcnpp1基因沉默转化子；辣椒疫霉持家基因actinA为内参，actinA基因的表达水平在所有参试菌株中一致。Pcnpp1基因在野生型和对照菌株中均呈现很高的表达量，而在沉默菌株中其表达量几乎检测不到；
图7.Pcnpp1基因稳定沉默荧光定量PCR检测结果示意图；
WT：野生型辣椒疫霉菌株，CK：转标记质粒转化子，Pcnpp1：目的基因沉默转化子；图中显示Pcnpp1基因于沉默菌株中表达量很低，与对照相比减少80％，成功沉默；
图8.Pcnpp1基因沉默转化子致病性测定结果灰度图；
图中显示利用游动孢子接种法测定Pcnpp1基因沉默转化子致病性结果：A：沉默转化子游动孢子接种3天后辣椒叶片症状；B：野生型辣椒疫霉菌株游动孢子接种3天后辣椒叶片症状；C：含标记质粒的辣椒疫霉菌转化子游动孢子接种3天后辣椒叶片症状；D：双蒸水处理叶片，野生型和对照菌株处理的辣椒叶片于第3天均产生严重水浸状坏死乃至腐烂症状，而沉默转化子菌株处理的辣椒叶片仅产生轻微的症状，说明Pcnpp1基因沉默降低了辣椒疫霉对辣椒叶片的破坏作用，因此该基因属辣椒疫霉的一个重要致病基因。
具体实施方式
本发明所提供的实例，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等(Blackwell科学出版社，1988)所述的操作技术规程，或按照制造厂商建议的实验条件。
实施例1(基因克隆及测序)
选取的参试材料为强致病辣椒疫霉菌株CBS121657，荷兰菌种保藏中心提供，根据已报道的NPP基因信息分析辣椒疫霉基因组序列，鉴定辣椒疫霉全基因组中NPP基因成员，设计特异引物pcnpp1F(其序列如Seq ID No：3所示)和pcnpp1R(其序列如Seq ID No：4所示)，利用PCR方法扩增筛选获得目的基因。
1、采用CTAB法提取高质量辣椒疫霉菌基因组DNA
辣椒疫霉菌株CBS121657移植于燕麦培养基平板，28℃生化培养箱内培养3天后，取3块直径为4mm的菌块移植于盛有100mL液体燕麦培养基的三角瓶中， 于28℃恒温摇床振荡培养5天，过滤菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后按照以下步骤提取参试菌株基因组DNA：
(1)将菌丝粉末转入1.5mL离心管，加入700μL DNA提取缓冲液，轻轻混匀，置65℃水浴锅中30-60min。
(2)加入等体积氯仿∶异戌醇(24∶1)，轻摇10-20min，10000r/min离心10min。
(3)取上清液于另一离心管内，加入等体积冰冻异丙醇，室温下静置20min，10000r/min离心10min，去上清，无水乙醇冲洗1-2次，烘干，加入600μL TE缓冲液，轻摇2-3次。
(4)加入等体积饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻摇10-20min，10000r/min离心10min。
(5)取上清液于另一离心管内，重复步骤2和3，但第3步用无水乙醇代替冰冻异丙醇。
(6)倒掉上清液，加入70％乙醇冲洗2-3次，37℃下烘干，加入300μL TE溶液溶解。
取5μL DNA样品于1％琼脂糖凝胶电泳，检测DNA片断长度，D然后置于-20℃冰柜中长期保存、备用。
2、PCR扩增目的基因
反应体系为：ddH2O(32.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCL2(4μL)，dNTP(4μL)，上下游引物，上游引物pcnpp1F(其序列如Seq ID No：3所示)，下游引物pcnpp1R(其序列如Seq ID No：4所示)各1μL，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。
取10μL反应产物电泳，确定含目标基因单克隆、测序。借助NCBI中的BLAST程序对获得的基因全长进行同源序列比对，确定目的基因，根据基因全长序列推测目的基因氨基酸序列，预测其蛋白质分子量约为25.5kDa。
PCR反应程序为：95℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
实施列2(Pcnpp1基因在辣椒、烟草叶片内的瞬时表达)
1、辣椒疫霉总RNA提取及反转录
1.1辣椒疫霉总RNA提取
(1)辣椒疫霉CBS121657在液体燕麦培养基上于28℃培养3天后，取0.1g样品经液氮研磨，移入1ml Trizol溶液室温静置5min。
(2)加入0.2mL氯仿，充分混合混匀，4℃下12000rpm/min离心15min，吸取上清，重复一至多次。
(3)吸取上清，每1ml Trizol加入0.25倍异丙醇和0.25倍RNA沉淀剂，充分混匀，室温放置10min，4℃下12000rpm/min离心10min。
(4)收集RNA沉淀，用75％乙醇洗涤2次，重复离心。
(5)吸尽残存乙醇，或使残余乙醇挥发。
(6)加50-100μl DEPC处理的水，将RNA溶液贮存于-70℃保存备用。
1.2反转录合成cDNA第一链
(1)取1-2μg总RNA，加入ddH2O至9.5μL，75℃变性5分钟，冰浴5分钟，稍微离心。
(2)加10X扩增缓冲液2μL。
(3)加10mmol/L dNTP混合液2μL。
(4)加25mmol/LMgCl2 4μL。
(5)加引物Oligo-dT 1μL。
(6)加RNA酶抑制剂0.5μL。
(7)加反转录酶M-MLV 1μL。
(8)加反应总体系20μL。
(9)反应液混合后，室温放置10分钟，42℃温浴60分钟，85℃水浴放置10分钟。
(10)加入180μL ddH2O混匀，稍微离心，-20℃下保存，阴性对照3个分别是：①加入第一链cDNA反应所需的所有试剂，不加模板RNA；②加除反转录酶外的所有试剂；③加除引物外的所有试剂。
2、Pcnpp1基因成熟肽序列分离
(1)根据已获得的基因Pcnpp1全长序列，以参试辣椒疫霉菌CBS121657的cDNA为模板进行PCR扩增，获得其cDNA全长。
(2)根据其cDNA全长，设计表达引物，去除信号肽序列和3`、5`非编码区序列，并在上游引物特异引物pvxF(其序列如Seq ID No：5所示)引入Cla I酶切位点，下游引物pvxR(其序列如Seq ID No：6所示)引入Not I酶切位点，扩增产物含Pcnpp1基因编码的成熟蛋白序列。
反应体系为50μL：扩增Pcnpp1基因全长获得cDNA模板(2μL)，10×buffer(5μL)，dNTP(4μL)，上下游引物各1μL，TaqE(0.5μL)，ddH2O(32.5μL)。
PCR反应程序为：94℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
取10μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，送上海博亚生物有限公司测序，获得Pcnpp1基因表达序列，然后目的基因回收连接pGEM-T Easy Vector，转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选、质粒DNA酶切鉴定，筛选阳性克隆质粒pGEM-T/Pcnpp1。
3、Pcnpp1基因瞬时表达
3.1PVX表达载体的构建
(1)Cla I和Not I双酶切pGEM-T/Pcnpp1质粒，回收插入片断。
(2)与同样双酶切的PVX(pGR106)表达质粒连接，转化大肠杆菌DH5α。
(3)转化后的DH5α经卡那霉毒抗性筛选，获得菌落经37℃摇床过夜后提取质粒。
(4)重组质粒pGR106/Pcnpp1酶切及测序鉴定。
3.2农杆菌转化
首先根据以下步骤进行重组质粒提取：
(1)将含有质粒的大肠杆菌接种于含适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡培养至对数生长期。
(2)取1mL菌液至1.5mL的离心管中，8000rpm，离心1min。
(3)去上清，收集菌体。
(4)加入200μL预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，震荡悬浮菌体。
(5)加入400μL新鲜配制的溶液II(0.2M NaCl，1％SDS)，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。
(6)加入300μL预冷的溶液III(3M K+，5M Ac-，)，颠倒混匀液体，置冰层5min，12000rpm，离心5min，上清转入另一只离心管中。
(7)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀，12000rpm离心5min。
(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。
(9)沉淀用70％乙醇洗2次，倒置干燥。
(10)回溶于30μL TE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测，其余-20℃下保存。
然后利用冻融法进行农杆菌转化，具体步骤如下：
(1)挑GV3101单菌落于3ml LB液体培养基中(含利福平50mg/ml)，28℃下，200rpm震荡培养24h。
(2)按1∶100比例转接100ml LB液体培养基中(含利福平50mg/ml)，在相同条件下继续培养6-7h至OD＝0.6左右，用于制备感受态。
(3)取1.5ml菌液13000rpm离心30s，弃上清，用800μl CaCl2重悬菌体，于冰层放置30min，而后13000rpm离心30s弃上清。
(4)再用100μl CaCl2重悬菌体，冰层放置备用。
(5)取10μl质粒加入200μl感受态细胞中，冰层放置30min，然后在液氮中放置1min，然后立刻转至37℃水浴中热击5min。
(6)迅速加入800μl LB液体培养基于28℃下，200rpm震荡培养2h。
(7)然后稍试离心收集菌体，将其涂布于LB液体培养基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)，28℃下，倒置培养48h。
(8)农杆菌转化子筛选，挑取平板上的单斑转化子于LB液体培养基中震荡培养，然后提取质粒进行双酶切和PCR验证。
3.3农杆菌阳性转化子接种辣椒、烟草幼苗叶片
(1)将筛选的转化子于LB液体培养基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)，28℃下，200rpm震荡培养24h后，离心收集菌体于等体积MMA(10mmol/LMgCl2、10mmol/L MES和100mmol/L AS)中继续诱导培养3小时，诱导后的菌体接种于5-6叶期的辣椒和本生烟幼苗，用5mL的无针头无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片叶脉中，空载体和双蒸水处理作对照，每个处理重复3次，接种后的辣椒、烟草叶片于空气湿度75％的22℃培养箱中黑暗培养2天后，转入人工气候室培养，接种后每天观察记录症状变化，至第10天为止。其结果如图2和图3所示。
实施列3(Pcnpp1活性位点氨基酸点突变及线性突变基因于辣椒、烟草叶片的瞬时表达)
1、活性位点突变
(1)根据已获得Pcnpp1基因全长序列，以参试辣椒疫霉菌CBS121657的RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得其cDNA全长，补充RNA提取方法。
(2)根据预测活性位点的4个氨基酸，4个关键氨基酸分别突变，D112A突变引物：其序列如Seq ID No：7-8，Seq ID No：9-10所示)；H120A突变引物：其序列如Seq ID No：7-8，Seq ID No：9-10所示)；D123A突变引物：其序列如Seq ID No：7-8，Seq ID No：11-12所示)；E125A突变引物：其序列如Seq ID No：7-8，Seq ID No：13-14所示)；4个关键氨基酸D112/H120/D123/E125/A同时突变，突变引物序列如Seq ID No：13-14，Seq ID No：15-16所示，以Pcnpp1 cDNA为模板，扩增突变序列，所采用的扩增技术为常规PCR技术，并将扩增产物测序验证。反应体系为50μL：扩增Pcnpp1基因全长获得cDNA模板(2μL)，10×buffer(5μL)，dNTP(4μL)，上、下游引物各1μL，TaqE(0.5μL)，ddH2O(32.5μL)。PCR反应程序为： 94℃ 4min；94℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
(3)突变序列测序验证后，用于PVX载体构建。
2、PVX载体构建
(1)Cla I和Not I双酶切突变质粒，回收插入片断。
(2)与同样双酶切的PVX(pGR106)表达质粒连接，转化大肠杆菌DH5α。
(3)转化后的DH5α经卡那霉毒抗性筛选，获得菌落经37℃摇床过夜提取质粒。
(4)提取质粒经酶切及测序鉴证后用于转化农杆菌。
3、农杆菌转化
根据以下步骤进行重组质粒提取：
(1)将含有目的质粒的大肠杆菌接种于含适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡培养至对数生长期。
(2)取1mL菌液至1.5mL离心管中，8000rpm，离心1min。
(3)去上清，收集菌体。
(4)加入200μL预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，震荡悬浮菌体。
(5)加入400μL新鲜配制的溶液II(0.2M NaCl，1％SDS)，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。
(6)加入300μL预冷的溶液III(3M K+，5M Ac-，)，颠倒混匀液体，置冰层5min，12000rpm，离心5min，上清转入另一只离心管中。
(7)加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀，12000rpm离心5min。
(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。
(9)沉淀用70％乙醇洗2次，倒置干燥。
(10)回溶于30μL TE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测，其余-20℃保存。
然后按照如下步骤利用冻融法进行农杆菌转化：
(1)挑GV3101单菌落于3ml LB液体培养基中(含利福平50mg/ml)，在28℃下，200rpm震荡培养24h。
(2)按1∶100比例转接100ml LB液体培养基中(含利福平50mg/ml)，相同条件下继续培养6-7h至OD＝0.6左右，用于制备感受态。
(3)取1.5ml菌液13000rpm离心30s，弃上清，用800μl CaCl2重悬菌体，于冰层放置30min，而后13000rpm离心30s弃上清。
(4)再用100μl CaCl2重悬菌体，冰层放置备用。
(5)取10μl质粒加入200μl感受态细胞中，冰层放置30min后，在液氮中放置1min，然后立刻转到37℃水浴中热击5min。
(6)迅速加入800μl LB液体培养基于28℃下，200rpm震荡培养2h。
(7)然后稍试离心收集菌体，将其涂布于LB液体培养基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)，28℃下，倒置培养48h.
(8)农杆菌转化子筛选，挑取平板上转化子的单斑于LB液体培养基中震荡培养，然后提取质粒进行双酶切和PCR验证。
4、农杆菌阳性转化子接种辣椒、烟草幼苗叶片
将筛选的转化子在LB液体培养基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)，28℃ 下，200rpm震荡培养24h；然后离心收集菌体在等体积MMA(10mmol/L MgCl2、10mmol/L乙酰丁香酮和100mmol/L AS)中继续诱导培养3h。
诱导后的菌体接种5-6叶期辣椒幼苗叶片和本生烟幼苗叶片，用5mL的无针头无菌注射器将农杆菌悬浮液压入叶片叶脉中，空载体和双蒸水作对照。每个处理重复3次，接种后的辣椒、烟草幼苗于75％空气湿度，22℃的培养箱中黑暗培养2天后，转入人工气候室培养，接种后每天观察记录症状变化，至到第10天为止，其结果如图4和图5所示。
实施列4(Pcnpp1基因菌体内沉默及其沉默转化子菌株致病性测定)
1、Pcnpp1基因沉默表达载体的构建
(1)根据已获得的Pcnpp1基因全长序列，以参试辣椒疫霉菌CBS121657的RNA为模板进行RT-PCR扩增，获得其cDNA全长(RNA提取步骤)。
(2)根据其cDNA全长，设计引物，在上游引物(其序列如Seq ID No：7所示)引入Sma I酶切位点，下游引物(其序列如Seq ID No：8所示)引入Sma I酶切位点用于扩增含Sma I酶切位点的Pcnpp1基因全长序列，用于沉默表达载体构建。
反应体系为50μL：扩增Pcnpp1基因全长获得cDNA模板(2μL)，10×buffer(5μL)，dNTP(4μL)，上下游引物各1μL，TaqE(0.5μL)，ddH2O(32.5μL)。
PCR反应程序为：94℃ 4min；94℃ 1min，57℃ 30s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
取10μL反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得Pcnpp1基因，然后与同样双酶切的PHAM34表达质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，经Amp抗性筛选、质粒DNA酶切鉴定，得到阳性克隆质粒PHAM34/Pcnpp1，送上海博亚生物有限公司测序。
2、质粒提取
分别提取重组质粒PHAM34/Pcnpp1以及沉默标记质粒PHSPNpt，步骤如下：
(1)将含有重组质粒的大肠杆菌接种于含适量抗生素的LB培养基中，37℃，220-250rpm震荡培养至对数生长期。
(2)取1mL菌液至1.5mL离心管中，8000rpm，离心1min。
(3)去上清，收集菌体。
(4)加入200μL预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)，震荡悬浮菌体。
(5)加入400μL新鲜配制的溶液II(0.2M NaCl，1％SDS)，颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。
(6)加入300μL预冷的溶液III(3M K+，5M Ac-，)，颠倒混匀液体，置冰层5min，12000rpm，离心5min，上清转入另一只离心管中。
(7)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀，12000rpm离心5min。
(8)上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10min，12000rpm离心10min，去上清。
(9)沉淀用70％乙醇洗2次，倒置干燥。
(10)回溶于30μL TE(含20μg的RNA酶)中，取5μL电泳检测，其余-20℃保存。
3、辣椒疫霉转化
3.1辣椒疫霉菌株培养
(1)将参试辣椒疫霉菌CBS121657于V8培养基平板25℃下黑暗培养4d，从菌落边缘切取2×2mm菌丝块重新转移至NPB固体培养基，在同样条件下培养 4d。
(2)从菌落边缘切取10×10mm菌丝块，与装有50ml液体NPB培养基250ml三角瓶中，每瓶6块菌丝块，共培养三瓶，25℃下黑暗培养2d。
3.2辣椒疫霉原生质体转化
(1)开始转化前2-3h，配制40％聚乙二醇-4000溶液，完全溶解后，用细菌过滤器除去菌体后置冰层。
(2)用包有纱布的烧杯过滤收集菌丝，将菌丝用20ml 0.8M的甘露醇漂洗一次，然后将菌丝移入50ml离心管中并加入35ml 0.8M甘露醇，室温下摇洗10min。
(3)配制20ml酶解液，在灭菌烧杯中溶解后备用。
(4)将洗过的菌丝加到酶解液中，在室温下酶解，酶解40-50min后，镜鉴酶解效果。
(5)用包有双层micra-cloth(Sigma)的50ml烧杯中过滤原生质体，然后将滤出液倒入50ml离心管中，4℃ 1500rpm离心3min，弃上清液。
(6)加入6ml W5 solution(5mM KCl，125mM CaCl2，154mM NaCl，177mM葡萄糖)轻轻重悬原生质体，再加入W5 solution至35ml，4℃ 1500rpm离心4min，弃上清液。
(7)加入6ml W5 solution轻轻重悬原生质体，将浓度调至2×106/ml，于冰层放置30min，然后于4℃ 1500rpm离心4min，弃上清液。
(8)加入等体积的MMg solution(0.4M甘露醇，15mM MgCl2，4mM 2-(N-吗啉)-乙基磺酸)重悬原生质体，室温放置10min。
(9)取若干50ml离心管，然后分别加入pHSPN(约5μl)及15-20μl待转化质粒。
(10)每支离心管中加入1ml原生质体，至于冰层5-10min。
(11)每支离心管中加入三次580μl的聚乙二醇-4000溶液，共1.74ml聚乙二醇-4000溶液，加入过程轻轻转动离心管，确保聚乙二醇-4000与原生质体均匀混合，冰层放置20min。
(12)于灭菌培养皿中加入10ml利马豆培养液(PM)，再加入20μl氨苄(Amp)贮液(50μg/ml)。
(13)每支离心离心管中先加入2ml PM培养液，并缓慢颠倒一次，冰层放置2min后，再向分别加入8ml PM培养液并缓慢颠倒一次，冰曾放置2min。
(14)将离心管中的液体于25℃下静置过夜培养。
(15)从过夜生长的培养皿中取5μl于显微镜下检查再生情况，并将皿中液体吸入50ml离心管中，2000rpm 5min。
(16)弃上清液，使管内液体剩5ml左右，使其悬浮，然后于43℃下，加入15ml含20μg/ml G418的PM固体培养基，吹干水汽，在25℃下黑暗培养2d；
(17)观察培养基表面菌丝生长情况，待有大量菌丝生长后，用10ml含50μg/ml G418的PM固体培养基覆盖生长的菌丝，并继续培养。
(18)培养3-4d后，待覆盖培养基长出菌丝，将最终生长的菌落初步定为转化子，并于10℃冰箱内长期保存，用于生物学性状和基因型分析。
3.3Pcnpp1基因沉默转化子菌株生物学表型分析
沉默转化子进行生物学性状分析，包括菌丝、菌落形态及生长速率，孢子囊形态大小及数量，游动孢子鞭毛有无、萌发率及数量等。
3.4Pcnpp1基因沉默转化子菌株沉默效率分析
提取转化子培养菌体总RNA后，进行沉默效率分析，设计RT-PCR反应引物(其序列如Seq ID No：19和Seq ID No：20)。以辣椒疫霉actinA基因为内参(其序列如Seq ID No：21和Seq ID No：22)，以野生型菌株及转化标记质粒菌株为对照。
PCR反应采用体系为：ddH2O(32.5μL)，10×buffer(5μL)，MgCL2(4μL)，dNTP(4μL)，上下游引物各1μL，DNA(2μL)，TaqE(0.5μL)。反应条件为：94℃预变性5min，然后进行以下循环；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃总延伸10min.PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析，其结果如图6所示。
同时利用SYBR Green荧光定量PCR分析Pcnpp1基因转化子沉默效率，设计RT-PCR反应引物(序列如Seq ID No：19和Seq ID No：20所示)，以辣椒疫霉actinA基因为内参(序列如Seq ID No：21和Seq ID No：22)，以野生型菌株及转化标记质粒菌株为对照，反应体系：2.5×realMasterMix及20×SYBR solution混合物9μL，上下游引物各0.5μL，cDNA 2μL，ddH2O 8μL。
利用Bio-Radi Cycler进行反应，条件如下：
95℃预变性2min，然后进行扩增；94℃变性15s，55℃退火15s，68℃延伸30s，共45个循环，最后65-95℃制备溶解曲线。选择actinA为内参基因，每个样品重复三次，用2-ΔΔCt法对样本基因进行表达差异相对定量分析，计算方法为ΔΔCt＝(CTtargetCTactinA)待测样本-(CTtargetCTactinA)校准样本，其结果如图7所示。
4.3.5辣椒疫霉Pcnpp1基因沉默转化子致病性测定
游动孢子诱导：
(1)将参试辣椒疫霉菌株转移至10％V8培养基培养4d，从菌落边缘挑取菌丝块移至新鲜10％V8培养基继续培养4d备用。
(2)挑取菌落边缘菌丝块至10％V8培养基培养，25℃黑暗培养5-6d。
(3)加灭菌水(以浸没菌丝为宜)，每隔1d换水至游动孢子产生，并调节游动孢子浓度至1×105个/ml。利用游动孢子悬浮液进行致病性分析。
按照如下步骤接种辣椒叶片进行致病性测定：
将诱导的游动孢子接种培育的自交系辣椒(5-6叶期)叶片，游动孢子浓度调至1×105个/ml。将选取叶片消毒：70％乙醇处理30s，0.1％升汞处理7min，于灭菌水中冲洗3次，晾干备用，晾干后将叶片平铺于预准备水琼脂平板，每个平板放置3片，每个叶片接种2μl游动孢子悬浮液，每个样品接10个叶片，野生型辣椒疫霉菌、标记质粒的转化子游动孢子悬浮液及无菌水作对照，每个实验重复3次，每天观察记载症状变化，拍照记录，其结果如图8所示。
Claims (4)
1.一种辣椒疫霉诱导坏死蛋白基因Pcnpp1，其特征在于：其基因序列如SeqID No：1所示；其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，该基因编码的农杆菌瞬时表达蛋白能够导致辣椒、烟草叶片产生坏死。
2.一种辣椒疫霉诱导坏死蛋白基因Pcnpp1基因分离克隆及其在辣椒烟草内瞬时表达的方法，其特征在于：其步骤如下：
1)Pcnpp1基因分离克隆具体步骤：
A：采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA；
B：根据已报道的细菌、真菌、卵菌的诱导坏死蛋白基因序列信息，比较分析辣椒疫霉全基因组信息，正确鉴定其诱导坏死基因成员，并设计特异引物pcnpp1F，其序列如Seq ID No：3所示，和pcnpp1R，其序列如Seq ID No：4所示，分离目的基因，阳性克隆测序获得基因全长序列；
2)Pcnpp1基因在辣椒烟草内瞬时表达的具体步骤：
A：Pcnpp1基因PVX表达载体构建：设计特异引物pvxF(其序列如Seq ID No：5所示)和pvxR(其序列如Seq ID No：6所示)，构建Pcnpp1基因瞬时表达载体，将目的基因克隆至表达载体PVX(pGR106)；
B：提取上述重组表达载体质粒，转化农杆菌GV3101感受态细胞，利用抗生素利福平及卡那霉毒筛选阳性农杆菌转化子；
C：将上步筛选出的阳性农杆菌化子利用LB液体培养基，其中含卡那霉毒和利福平各50mg/ml，震荡培养，收集菌体后，用无菌注射器将农杆菌悬浮液压入辣椒、烟草叶片中，使其进行瞬时表达。
3.如权利要求1所述Pcnpp1基因，其活性位点突变及其突变基因瞬时表达方法，其特征在于：其步骤如下：
1)根据已报道的necrosis-inducing protein，NPP蛋白结构，利用overlap-PCR方法，利用基因序列如Seq ID No：3-14的引物分别将其与其它同类基因比对分析界定的该类基因活性位点氨基酸的4个氨基酸：D112A，H120A，D123A，E125A进行点突变及线性突变；
2)突变序列测序验证后，利用引物其基因序列分别如Seq ID No：5的pvxF和Seq ID No：6的pvxR所示，构建PVX(pGR106)表达载体，提取上述重组表达载体质粒，然后转化农杆菌；
3)筛选阳性农杆菌转化子接种辣椒、烟草，通过比较接种寄主叶片症状变化情况，比较活性位点突变效果。
4.如权利要求1所述的Pcnpp1基因，其稳定沉默表达载体构建及其沉默菌株制备方法，其特征在于：其步骤如下：
A：根据Seq ID No：1所示的Pcnpp1基因序列，设计特异引物gsF，其序列如Seq ID No：17所示，和特异引物gsR，其序列如Seq ID No：18所示，构建Pcnpp1基因沉默表达载体，将目的基因克隆至沉默表达载体PHAM34中；
B：将上述重组载体转化辣椒疫霉原生质体，利用抗生素G418筛选阳性辣椒疫霉转化子；
C：所获得的阳性农杆菌转化子培养，诱发产生游动孢子后接种辣椒叶片进行致病性测定。
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