CN116903593A - 一种氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、药物组合物和用途 - Google Patents

一种氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、药物组合物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了式I所示化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物，药物组合物和用途。本发明提供的式I所示的氘代异喹啉‑氨基嘧啶类化合物对EGFR突变体具有很好的抑制活性，对癌症特别是非小细胞肺癌具有良好的治疗作用。

Description

一种氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、药物组合物和用途
技术领域
本发明属于创新药物化学领域，涉及一种氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、药物组合物及应用。
背景技术
EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）是一种跨膜蛋白，又叫ErbB-1或者HER1，属于表皮生长因子受体家族（ErbBs）。截至目前，人类发现的ErbB家族共有4种亚型，分别是ErbB1（EGFR）、ErbB2（HER2/neu）、ErbB3（HER3）和ErbB4（HER4）。它与所有的酪氨酸激酶一样，都含有胞外区域、跨膜区域和胞内区域这三个区域结构。EGFR以及其胞内的信号传导通路在恶性肿瘤，尤其是非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中高表达。当胞外结构域与特定的配体结合后，如表皮生长因子（EGF）、转化生长因子α（TGF-α）、细胞素和上皮调节蛋白等，EGFR会发生自聚形成同源二聚体或者和其它的ErbB家族成员形成异源二聚体，导致胞质结构域中关键酪氨酸发生残基磷酸化，继而激活下游的信号通路，从而调控细胞的生长、增殖、迁移等过程。EGFR信号转导失调促进肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭、迁移和转移。因此，EGFR已经成为抗肿瘤药物的有效靶点。
第一代EGFR抑制剂，代表药物包括吉非替尼和厄洛替尼，对携带EGFR激活突变L858R和Del 19的非小细胞肺癌患者具有较好的疗效，但是绝大数患者在经过大约一年的治疗后会呈现出不同程度的耐药情况。50%~60%发生耐药原因是患者体内出现EGFR T790M突变。为了解决这一耐药问题，研究人员开发了第二代不可逆EGFR抑制剂，代表药物包括阿法替尼，但是该类EGFR抑制剂对野生型EGFR选择性较低，导致严重的不良反应。因此，研究人员开发了第三代高选择性不可逆EGFR抑制剂，代表药物包括奥希替尼和奥莫替尼。但是用药一段时间后，该类抑制剂引导至EGFR T797S突变，也会出现耐药性。研究人员开发了第四代EGFR抑制剂，包括变构抑制剂和作用于ATP结合口袋的抑制剂。BLU945是一种作用于激酶ATP结合口袋的新型四代抑制剂，该化合物对L858/T790M/T797S和Del19/T790M/T797S具有强效抑制活性，对正常细胞毒性较小，目前进入早期临床阶段。
氘代药物是指将药物分子中的部分氢原子替换为氘。由于氘在药物分子中形状和体积与氢接近，氘代药物一般会保留原来药物的生物活性和选择性。由于C-D键比C-H键更稳定，使得氘代药物在化学反应过程中，C-D键更不容易断裂，其半衰期会延长。自2000年以来，氘代策略便被广泛应用于药物的研究中。
发明内容
本发明提供了一种如式I所示的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物，其结构如下：
。
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11 、R12 、R13或R14独立地选自氢或氘，同时，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10 、R11 、R12 、R13或R14至少有一个选自氘；
R15为CH3或CD3。
在一些实施方案中，所述的如式I所示的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物为如下任一种，
。
本发明提供了一种如式I所示的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物在制备EGFR突变体抑制剂中的应用。
在一些实施方案中，所述的EGFR突变体选自del19、L858R或T790M的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的EGFR突变体选自L858R/T790M双突变体、del 19/T790M双突变体、L858R/T790M/T797S三突变体、del 19/T790M//T797S三突变体。
本发明提供了一种I所示化合物的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述的癌症为肺癌。
在一些实施方案中，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述的癌症为与EGFR突变体相关的癌症。
在一些实施方案中，所述的与EGFR突变体相关的癌症为肺癌，和所述的与EGFR突变体相关的癌症为非小细胞肺癌。
本发明提供了一种药物组合物，其含有如式I所示的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物，及药学上可接受的载体或辅料。
在所述的药物组合物中，所述的如式I所示的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物、或其药学上可接受的盐、异构体、代谢产物、前药、溶剂合物或水合物用量为治疗有效量。
本发明提供了一种药物组合物在制备EGFR突变体抑制剂的用途。
在一些实施方案中，所述的EGFR突变体选自del19、L858R或T790M的一种或多种。
在一些实施方案中，所述的EGFR突变体选自L858R/T790M双突变体、del 19/T790M双突变体、L858R/T790M/T797S三突变体、del 19/T790M//T797S三突变体。
本发明提供了一种药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述的癌症为肺癌。
在一些实施方案中，所述的肺癌为非小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述的癌症为与EGFR突变体相关的癌症。
在一些实施方案中，所述的与EGFR突变体相关的癌症为与EGFR突变体相关的肺癌。
所述的药用辅料可为药物生产领域中广泛采用的那些辅料。辅料主要用于提供一个安全、稳定和功能性的药物组合物，还可以提供方法，使受试者接受给药后活性成分以所期望速率溶出，或促进受试者接受组合物给药后活性成分得到有效吸收。所述的药用辅料可以是惰性填充剂，或者提供某种功能，例如稳定该组合物的整体pH值或防止组合物活性成分的降解。所述的药用辅料可以包括下列辅料中的一种或多种：粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂、填充剂、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。
本发明的药物组合物可根据公开的内容使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋或冻干工艺。
本发明所述的药物组合物可以任何形式给药，包括注射（静脉内）、粘膜、口服（固体和液体制剂)、吸入、眼部、直肠、局部或胃肠外（输注、注射、植入、皮下、静脉内、动脉内、肌内）给药。本发明的药物组合物还可以是控释或延迟释放剂型（例如脂质体或微球）。固体口服制剂的实例包括但不限于粉末、胶囊、囊片、软胶囊剂和片剂。口服或粘膜给药的液体制剂实例包括但不限于悬浮液、乳液、酏剂和溶液。局部用制剂的实例包括但不限于乳剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、贴剂、糊剂、泡沫剂、洗剂、滴剂或血清制剂。胃肠外给药的制剂实例包括但不限于注射用溶液、可以溶解或悬浮在药学上可接受载体中的干制剂、注射用悬浮液和注射用乳剂。所述的药物组合物的其它合适制剂的实例包括但不限于滴眼液和其他眼科制剂；气雾剂：如鼻腔喷雾剂或吸入剂；适于胃肠外给药的液体剂型；栓剂以及锭剂。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的游离体形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的游离体形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸（形成碳酸盐或碳酸氢盐）、磷酸（形成磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、硫酸（形成硫酸盐或硫酸氢盐）、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；有机酸盐还包括氨基酸（如精氨酸等）的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的游离体形式。化合物的游离体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
本发明的“药学上可接受的盐”可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。
术语“异构体”是指具有相同化学式而有不同的原子排列的化合物。
术语“代谢产物”是指式I所示化合物或其盐通过体内代谢产生的药学活性产物。这种产物可以从例如所给药的化合物的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺、酯化、脱酯、葡糖醛酸化、酶促裂解等产生。因此，本发明包括本发明的化合物的代谢产物，包括使本发明的化合物与哺乳动物接触足够得到其代谢产物的一段时间的方法而产生的化合物。
代谢产物的鉴定典型地通过制备本发明化合物的放射性标记的同位素、将其以可检测的剂量（例如，大于约0.5 mg/kg）非肠道给予动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴、或人，允许充分的时间以发生代谢（典型地约30秒到30小时）和从尿、血液或其它生物样本分离其转化产物。这些产物容易分离，因为它们是被标记的（其它通过利用能够结合存在于代谢物中的抗原表位的抗体分离）。以常规的方式确定代谢物结构，例如，通过MS，LC/MS或NMR分析。通常，代谢物的分析是以与本领域技术人员公知的常规药物代谢研究相同的方法进行的。只要代谢物产物不是以其它方式在体内不能被发现，否则它们可用于本发明化合物的治疗剂量给药的检定测定法。本发明的化合物可以在一个或多个构成该化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素标记化合物，比如氚（3H），碘-125（125 I）或C-14（14C）。本发明的化合物的所有同位素组成的变换，无论放射性与否，都包括在本发明的范围之内。
除了盐的形式，本发明所提供的化合物还存在前药形式。本文所描述的化合物的前药容易地在生理条件下发生化学变化从而转化成本发明的化合物。可在体内转化以提供生物活性物质（即式I所示化合物）的任何化合物是在本发明的范围和主旨内的前药。例如，含有羧基的化合物可形成生理上可水解的酯，其通过在体内水解以得到式I所示化合物本身而充当前药。所述前药优选口服给药，这是因为水解在许多情况下主要在消化酶的影响下发生。当酯本身具有活性或水解发生在血液中时，可使用肠胃外给药。
本发明的积极进步效果在于：
（1）本发明化合物对EGFR突变体具有很好的抑制活性。
（2）本发明化合物的血药浓度提高、半衰期延长、降低了单次给药剂量。
（3）本发明化合物对癌症具有良好的治疗作用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：化合物5的合成
步骤一：化合物2的合成
将原料1（20 g，78.9 mmol）溶于无水DCM（300 mL）中，向上述溶液中加入TEA（9.55g, 94.6 mmol），将反应液冷却至0 ℃，然后缓慢滴加MsCl（9.93 g, 86.7 mmol），滴加完成后，反应液缓慢升至室温，室温下搅拌过夜反应。然后，向反应液中加入水淬灭反应，DCM萃取（100 mL×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩制得化合物2（23.5g，90%）MS(ESI, m/z): 332 (M++1).
步骤二：化合物3的合成
将化合物6 （15.3 g, 101 mmol）溶于无水DMF中，0℃下，向上述反应液中加入叔丁醇钾（12.4 g，110 mmol）搅拌30 min，然后将化合物2（26 g, 78.4 mmol）的DMF溶液加入到上述反应液中，反应升温至60℃，搅拌过夜反应，冷却至室温，加入水淬灭反应，乙酸乙酯萃取（100 mL×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化制得化合物3（24.5g，80%）。MS (ESI, m/z): 391 (M++1).
步骤三：化合物4的合成
将化合物3（24 g, 61.9 mmol）溶于DMA（240 mL）中，向上述溶液中加入LiCl（20.9g, 495 mmol），然后升高反应液温度至150℃，TLC点板直至反应完全后，停止反应，冷却至室温，向反应液中加入水，乙酸乙酯萃取（100 mL×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化制得化合物3（14.4g，70%）。MS (ESI, m/z): 333 (M++1).
步骤四：化合物5的合成
将原料4（19 g, 57.3 mmol）溶于甲醇（300 mL）中，向上述溶液中加入Pd(OH)2(5.7 g)和三氟乙酸（9mL），室温下搅拌反应。待反应完全后，过滤，滤液浓缩制得化合物5的粗品，直接投入下一步反应。MS (ESI, m/z): 167 (M++1).
实施例2：化合物14和15的合成
步骤一：化合物8的合成
将原料7（22.6 g，100 mmol）溶于无水DCM（300 mL）中，-78℃下，向上述溶液中缓慢加入DIBALH的二氯甲烷溶液（300 mmol，1M，300 mL），滴加完成后，在-78℃下继续搅拌反应30 min。加入过量的酒石酸钾钠剧烈搅拌2-4 h。硅藻土抽滤，滤液浓缩制得化合物8（14.7g，85%）。MS (ESI, m/z): 185 (M++1).
步骤二：化合物9的合成
将化合物8（14 g，70.1 mmol）溶于THF（200 mL）中，向上述溶液中加入CD3ZnI的THF溶液（73mL, 73 mmol, 1M）和四三苯基膦钯（93 mg，0.08 mmol），室温下搅拌反应12h。待反应完成后，加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，乙醚萃取（50 mL×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩制得化合物9（3.2 g，50%）。MS (ESI, m/z): 76 (M++1).
步骤三：化合物rac-10的合成
将化合物9（3.2 g，42.7 mmol）溶于氯仿（100 mL）中，0℃下，向上述溶液中缓慢滴加溴（3.5mL，64.1 mmol），滴加完成后，15℃下搅拌反应30 min。向反应液中加入硫代硫酸钠淬灭反应，DCM萃取（20 mL×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩制得化合物rac-10，直接投入下一步反应。MS (ESI, m/z): 235 (M++1).
步骤四：化合物rac-11的合成
15 ℃下，将化合物rac-10（8.9 g，38.2 mmol）溶于THF（200 mL），向上述溶液中缓慢滴加氢氧化钾（2.2 g，38.2 mmol）水溶液（180 mL），将反应液升温至室温，搅拌反应2 h。加入水和乙酸乙酯，乙酸乙酯萃取（200 mL×3），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩制得化合物rac-11，直接投入下一步反应。MS (ESI, m/z): 153 (M++1).
步骤五：化合物12的合成
将化合物rac-11和二苯甲基胺12（38.3mmol，7g）溶于无水乙醇（100 mL）中，向上述溶液中加入碳酸氢钠（4.8 g，57.3mmol），反应液室温下搅拌80 h，然后升高温度至65℃下再搅拌反应24 h。冷却至室温，抽滤，滤液浓缩，残渣溶于DCM中，饱和氯化铵洗涤，污水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化制得化合物rac-12（3.9 g，40%）。使用手性柱，采用SFC拆分制得化合物12。
步骤六：化合物13的合成
将化合物12 (200 mg, 0.78 mmol) 溶于乙醇 (3 mL)中，向上述溶液中加入HCl的1,4-二氧六环溶液（4M, 3.12 mmol, 1 mL），20% Pd(OH)2/C (122 mg, 0.86 mmol)。反应液中通入氢气（50 psi），室温下搅拌反应16 h。停止反应，硅藻土抽滤，滤液浓缩，残渣再溶于乙醇（5mL）中，向溶液中加入HCl的1,4-二氧六环溶液（4M, 3.12 mmol, 1 mL），20% Pd(OH)2/C (122 mg, 0.86 mmol)，通入氢气（50 psi），室温下搅拌反应22h。停止反应，硅藻土抽滤，浓缩，乙醚打浆制得盐酸盐 (55 mg, 56%)。MS (ESI, m/z): 91 (M++1).
化合物14和化合物15的合成参考实施例1化合物5的合成，只需更换相应的原料即可。
实施例3：化合物20的合成
步骤一：化合物17的合成
将化合物16（5 g，22.8 mmol）溶于无水DMF（50mL）中，0 ℃下向上述溶液中加入NaH（1.1 g，27.4 mmol）反应1 h，加入氘代碘甲烷（4g，27.4 mmol），0℃下继续反应1h。停止反应，加入饱和氯化胺溶液淬灭反应。乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，柱层析分离纯化制得化合物17（3.8g，70%）。MS (ESI, m/z): 237 (M++1).
步骤二：化合物18的合成
将化合物17（4.7g，20 mmol）溶于DCM（40 mL）中，向溶液中加入三氟乙酸（13mL），室温下搅拌反应1h。停止反应，浓缩制得三氟乙酸盐，直接投入下一步反应。
步骤三：化合物19的合成
将化合物18（4.0g，17.4 mmol）和化合物21（1.8 g，13.9 mmol）溶于异丙醇（34mL）中，加入三乙胺（7.2 mL，52.2 mmol），反应液升高温度至100 ℃，搅拌反应12 h，浓缩，柱层析分离纯化制得化合物19（2.7g，60%）。MS (ESI, m/z): 227 (M++1).
步骤四：化合物20的合成
将化合物19（226 mg，1 mmol）混悬于THF（1 mL）和重水（1 mL）中，加入氢氧化钾（56mg）和催化量的四丁基氟化铵，加热回流24h。停止反应，减压除掉溶剂，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，柱层析分离纯化制得化合物20（148 mg，65%）。MS (ESI, m/z):228 (M++1).
实施例4：化合物23的合成
将化合物22（226 mg，0.26 mmol）中加入氘代乙酸（2.5 mL），120℃回流36小时，TLC监测反应完全，减压浓缩，柱层析分离纯化制得化合物23（35 mg, 60%）。MS (ESI, m/z): 228 (M++1).
实施例5：化合物S1的合成
步骤一：化合物23的合成
将化合物24（900 mg，3.16 mmol）、化合物14（525 mg，3.16 mmol）和碳酸铯（2.1g，6.32 mmol）溶于1,4-二氧六环（10 mL）中，加入XantphosPd G4（243 mg，0.15 mmol），氮气保护，反应液温度升高至100℃，搅拌反应3h。停止反应，冷却至室温，加入水，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，柱层析分离纯化，制得化合物23（700mg，60%）。MS (ESI, m/z): 370 (M++1).
步骤二：化合物S-1的合成
将化合物25（50 mg，0.14 mmol）和26（32mg，0.14 mmol）溶于1,4-二氧六环（1mL）中，加入碳酸铯（91 mg，0.28 mmol）和BrettPhos precatalyst (Gen IV)，氮气保护，反应液温度升高至90 ℃，搅拌反应16 h，停止反应，冷却至室温，过滤浓缩，制备分离制得化合物S1（23 mg，30%）。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63(s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J =8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J =25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42(m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d,3H, J = 6.0 Hz), 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 560 (M++1).
实施例6：化合物S2的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q,1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z):563 (M++1).
实施例7：化合物S3的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)，1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS(ESI, m/z): 558 (M++1).
实施例8：化合物S4的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)，1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS(ESI, m/z): 558 (M++1).
实施例9：化合物S5的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H),1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)，1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 561 (M++1).
实施例10：化合物S6的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H),1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)，1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 561 (M++1).
实施例11：化合物S7的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 564 (M++1).
实施例12：化合物S8的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 564 (M++1).
实施例13：化合物S9的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 566 (M++1).
实施例14：化合物S10的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H),1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 567 (M++1).
实施例15：化合物S11的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H),1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 567 (M++1).
实施例16：化合物S12的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H) , 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 563 (M++1).
实施例17：化合物S13的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H),2.89 (q, 1H,J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z):560 (M++1).
实施例18：化合物S14的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H),2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 561 (M++1).
实施例19：化合物S15的合成
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合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H),2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 561 (M++1).
实施例20：化合物S16的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H),2.89 (q, 1H,J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H)。MS (ESI, m/z): 566 (M++1).
实施例21：化合物S17的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H)。MS (ESI, m/z): 567 (M++1).
实施例22：化合物S18的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 3.37 (s, 3H), 2.99 (s, 3H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz),1.86-1.65 (m, 2H)。MS (ESI, m/z): 567 (M++1).
实施例23：化合物S19的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m,2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z):563 (M++1).
实施例24：化合物S20的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d,1H, J = 49.3 Hz), 4.69 (dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz),4.27-4.11 (m, 1H), 3.72-3.42 (m, 5H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 2.99 (s, 3H),1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz), 1.31 (dd, 6H, J = 6.8, 1.9 Hz)。MS (ESI, m/z): 566 (M++1).
实施例25：化合物S21的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 2.99 (s, 3H), 1.86-1.65 (m, 2H),1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 561 (M++1).
实施例26：化合物S22的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 2.99 (s, 3H), 1.86-1.65 (m, 2H),1.42 (d, 3H, J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 561 (M++1).
实施例27：化合物S23的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.47 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H,J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 564 (M++1).
实施例28：化合物S24的合成
合成方法如实施例5，只需更换相应的原料即可。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ9.90 (s, 1H), 9.06 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.00 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 7.42 (d,1H, J = 8.0 Hz), 6.56 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 4.94 (d, 1H, J = 49.3 Hz), 4.69(dt, J = 25.9, 6.4 Hz, 2H), 4.47 (d, 1H, J = 13.2 Hz), 4.27-4.11 (m, 1H),3.72-3.42 (m, 5H), 2.89 (q, 1H, J = 7.3 Hz), 1.86-1.65 (m, 2H), 1.42 (d, 3H,J = 6.0 Hz)。MS (ESI, m/z): 564 (M++1).
实施例29：野生型EGFR和突变体EGFR酶抑制活性测试
实验方法：将待测化合物用DMSO稀释至10mM母液，然后用激酶缓冲液稀释得到1μM至10 μM的化合物溶液。将本发明化合物的系列稀释溶液（6μL）加入到96孔板中。将纯化的野生型EGFR蛋白和EGFR突变体，del 19、L858R、L858R/T790M、del 19/T790M、del19/T790M/T797S和L858R/T790M /T797S在激酶缓冲液中稀释，并添加至待测化合物溶液中，室温下孵育2h。然后，将近似ATP浓度（1mM）的ATP和底物溶液（Ulight-PolyGT）添加至含有化合物溶液和酶的各个孔中（各12μL），并孵育1h。然后，向反应混合液中添加由EDTA、水和兰斯检测缓冲液制成的终止溶液（各12μL）以停止磷酸化，振荡5min后，将含有铕标记抗体、水和兰斯检测缓冲液的检测液（各12μL）添加至反应混合液，再次孵育50min。底物磷酸化是在添加检测溶液并孵育50min后测量的665nM发射值得函数。
如表1所示，与BLU-945相比，实施例化合物对EGFR各个突变体的酶抑制活性和对野生型EGFR的选择性均有所提高。
表1 待测化合物对野生型EGFR和突变体EGFR酶抑制活性（IC50 nM）
编号 EGFRWT del19 L858R L858R/T790M del19/T790M L858R/T790M/T797S del19/T790M/T797S
S1 820 10 3.7 0.18 0.42 0.23 0.33
S2 813 12 3.7 0.22 0.40 0.22 0.33
S3 865 8.0 2.2 0.15 0.32 0.19 0.20
S4 872 7.5 2.0 0.14 0.28 0.15 0.22
S5 883 6.3 2.3 0.12 0.22 0.12 0.18
S6 880 6.3 1.9 0.10 0.17 0.10 0.15
S7 875 7.0 2.0 0.11 0.15 0.09 0.12
S8 875 6.9 0 0.13 0.13 0.09 0.12
S9 823 8.8 3.2 0.18 0.27 0.15 0.23
S10 893 6.0 1.7 0.11 0.13 0.09 0.12
S11 899 6.0 1.5 0.09 0.10 0.07 0.10
S12 803 10.2 3.6 0.22 0.30 0.27 0.21
S13 799 10.4 3.8 0.29 0.30 0.28 0.23
S14 810 9.3 2.7 0.20 0.29 0.25 0.20
S15 817 9.3 2.8 0.20 0.29 0.26 0.27
S16 823 8.0 3.0 0.24 0.32 0.28 0.27
S17 873 7.9 1.9 0.19 0.25 0.20 0.19
S18 872 7.3 1.8 0.17 0.23 0.20 0.18
S19 830 8.0 2.4 0.20 0.27 0.22 0.29
S20 833 8.3 2.7 0.19 0.23 0.20 0.30
S21 865 8.5 2.5 0.20 0.25 0.18 0.27
S22 877 7.8 2.8 0.23 0.26 0.19 0.29
S23 878 6.5 2.6 0.10 0.18 0.16 0.19
S24 880 6.5 2.5 0.09 0.18 0.16 0.20
BLU-945 690 32 7.5 0.44 0.82 0.49 0.72
实施例30：AlphaLISA检测细胞内EGFR抑制
表达EGFR突变的Ba/F3细胞悬浮于含有10%牛血清的RPMI 培养基中，细胞密度为1.0 × 106 cells/mL。第二天，收集细胞，并采用新鲜培养基稀释细胞1.25 × 106 cells/m，取40 μL接种于384孔板中，不同浓度的化合物加入到孔板中，37℃下共培养4 h。然后，离心5min（3000 rpm），去掉培养基，破解细胞。采用AlphaLISA SureFire Ultra DetectionKit检测实施例化合物对细胞内EGFR磷酸化抑制活性。
如表2所示，与BLU-945相比，实施例化合物对细胞内磷酸化EGFR的抑制活性均有所提高。
表2 待测化合物对Ba/F3细胞中EGFR磷酸化的抑制活性（IC50 nM）
编号 Ba/F3-L858R/T790M/T797S Ba/F3-del19/T790M/T797S
S1 1.5 1.8
S2 1.2 1.34
S3 0.9 1.0
S4 0.8 1.0
S5 0.8 1.2
S6 0.75 0.95
S7 0.99 0.88
S8 0.98 1.12
S9 1.70 1.50
S10 1.10 1.23
S11 0.97 1.10
S12 1.90 1.80
S13 1.90 1.90
S14 1.80 1.85
S15 1.80 1.62
S16 1.90 1.77
S17 0.98 1.02
S18 0.85 1.10
S19 1.11 1.90
S20 1.23 1.73
S21 1.09 1.68
S22 1.05 1.00
S23 0.99 0.88
S24 1.00 0.79
BLU-945 3.80 4.70
实施例31：抗增殖活性测试
化合物癌细胞抑制活性数据用MTT方法来检测，MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT（黄色的噻唑兰）可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490 nm/570 nm波长处检测其光吸收值，可间接反映活细胞数量。所用细胞系包括：PC9携带突变体Del19；H1975细胞携带L858R/T790M突变；A431细胞野生型具体实验步骤如下：
（1）收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液；每孔细胞数量约为7000个，在5% CO2，37 ◦C孵育过夜至细胞完全贴壁；
（2）设置药物浓度梯度，每个浓度梯度设置3个复孔，将药物稀释到对应培养基中至所需终浓度，吸出96孔板中原有培养基，加入配好的含所需终浓度药物的培养基100 μL，在5% CO2，37 ◦C孵育；并同时设置空白组（只含100 μL培养基，不含细胞，后续处理与其他各孔相同）与对照组（含有细胞与培养基）；
（3）药物处理至44小时时每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/ml），继续培养4h（药物处理细胞共48小时）；
（4）吸干净孔内培养液（如细胞出现悬浮，则先2500 rpm离心5min再吸出培养基）。每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡至结晶物充分溶解。在酶标仪上检测OD 490 nm处各孔的吸光值；
（5）计算抑制率：抑制率=1-（加药组OD值-空白组OD值)/（对照组OD值-空白组OD值）=（对照组OD值-加药组OD值）/（对照组OD值-空白组的OD值）；
（6）按上述实验步骤重复三次，得出三次抑制率的平均值，利用IC50计算器算出药物的IC50值。
表3 待测化合物的抗细胞增殖活性（IC50, nM）
编号 PC9 H1975 A431
S1 49 3.0 ＞1000
S2 58 4.1 ＞1000
S3 56 3.2 ＞1000
S4 52 3.0 ＞1000
S10 51 2.9 ＞1000
S13 60 2.9 ＞1000
S17 43 2.5 ＞1000
S23 44 2.4 ＞1000
S24 56 2.6 ＞1000
BLU-945 101 10.3 ＞1000
如表3所示，与BLU-945相同，部分实施例化合物对携带EGFR突变体Del19的PC9和携带双突变体L858R/T790M的H1975细胞具有显著的抑制活性，而对表达野生型EGFR的A431细胞抑制活性较低，这说明实施例化合物对携带EGFR突变体的肿瘤细胞具有强的抑制活性，且毒副作用较低。
实施例32：待测化合物药代动力学性质检测
选用雄性SD大鼠，口服 （2.5 mg/kg）或静脉注射（1 mg/kg）给药，于给药后5min，15min，30min，1h，2 h，4 h，8 h，10 h，24 h，从眼底静脉丛连续取血置于含有肝素的EP管中，离心、取上层血浆进行LC-MS/MS分析，根据测试所得的血药浓度-时间数据，采用WinNonlin软件计算药代动力学参数，计算口服生物利用度。
研究结果表明，BLU-945在大鼠中的口服生物利用度为48%，半衰期2.4 h；化合物S17口服生物利用度提高至65%，半衰期延长至4.9 h，这说明氘代化合物的氘代动力学性质显著改善，可以降低化合物S17的单次给药剂量。
最后有必要说明的是，以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种如式I所示的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，其结构如下：
；
其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11 、R12 、R13或R14独立地选自氢或氘，同时，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R10 、R11 、R12 、R13或R14至少有一个选自氘；
R15为CH3或CD3。
2.一种如权利要求1所述的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物为以下任一化合物： 。
3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的一种如权利要求1或2所述的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体或辅料。
4.一种如权利要求1或2所述的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备EGFR突变体抑制剂中的应用。
5.一种如权利要求3所述的药物组合物在制备EGFR突变体抑制剂中的应用。
6.一种如权利要求1或2所述的氘代异喹啉-氨基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
7.一种如权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的癌症选自肺癌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的癌症选自非小细胞肺癌。
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