CN116875631A - 生长素糖基转移酶基因ugt74e2在抑制植物炭疽病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生长素糖基转移酶基因UGT74E2在抑制植物炭疽病中的应用。所述生长素糖基转移酶基因UGT74E2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了UGT74E2基因的植物过表达载体，并获得了UGT74E2基因的转基因烟草纯合株系，该纯合株系在外源炭疽病菌注射下，形成的致病斑要小，形成的致病菌落数量要少，SOD、POD和CAT的活性明显升高。因此本发明通过实验证明了生长素糖基转移酶基因UGT74E2在抑制炭疽病中的明显作用，为培育抗病性转基因烟草提供理论依据和实验基础。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，特别涉及生长素糖基转移酶基因UGT74E2在抑制植物炭疽病中的应用。
背景技术
烟草炭疽病是烟草的主要病害之一，在烟草的全生育期均可发生，尤以苗期危害最重，严重时会造成整株死亡，烟苗成片烂掉。严重影响了烟草的产量和质量，造成烟草种植经济效益的损失。
生长素作为植物体内最早发现的一类重要内源激素，参与调控植物生长发育的诸多过程，如根、茎、叶和种子的发育，同时也参与了植物应激反应。生长素通常以游离型和结合型的状态存在，结合型生长素中一种重要形式是糖基化生长素，糖基化主要发生在生长素吲哚环侧链的羧基上，多以葡萄糖酯的形式存在。
小分子的糖基化往往会造成生物小分子在化学特性和生物活性上的重要变化，例如：增加了水溶性、增强了化学稳定性，尤其是还能降低、除去内源和外源物质的毒性等等，因此糖基化对植物生长发育、适应环境以及抗病性等方面起着重要作用。糖基转移酶是一类负责糖基化修饰的酶，它能将活性糖基从供体分子上转移到受体分子上。
拟南芥生长素糖基转移酶UGT74E2，在体外主要催化IBA糖基化。其过表达株系表现出植株矮化、多分枝、叶柄短、莲座叶紧凑、颜色墨绿、晚花1周等生长素缺陷表型，同时还表现出增强的抗盐抗旱性。
尽管目前针对生长素糖基化修饰的研究较多，但却没有任何有关于生长素糖基转移酶参与植物抗病性功能的报道被公开。
发明内容
本发明的目的是提供了生长素糖基转移酶基因UGT74E2在抑制植物炭疽病中的应用。本发明通过多种实验的获得生长素糖基转移酶UGT74E2的转基因烟草纯合株系，并通过实验验证了其调控对烟草抵抗炭疽病胁迫的功能。
为达到解决上述生产问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了生长素糖基转移酶基因UGT74E2在抑制植物炭疽病中的应用。
进一步的：所述基因UGT74E2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的：所述植物为烟草。
进一步的：所述应用的步骤为：
(1)构建包括基因UGT74E2的重组载体，转入农杆菌获得重组农杆菌；
(2)将所述重组农杆菌对野生型烟草侵染并获得具有抗性的不定芽，将不定芽进行生根培养获得抗性苗，培养后获得UGT74E2转基因烟草T1代；
(3)将UGT74E2转基因烟草T1代植株培养至开花结果，待种子成熟后，分别收取种子进行卡那霉素筛选，获得单基因拷贝插入的T2代，培养至开花结种，收T2代成熟种子进行卡那霉素筛选获得UGT74E2转基因烟草纯合株系。
进一步的：所述UGT74E2转基因烟草纯合株系受到炭疽病菌侵害后形成的致病斑明显小于野生型株系。
进一步的：所述UGT74E2转基因烟草纯合株系叶片中的炭疽病菌数量明显低于野生型株系。
进一步的：所述UGT74E2转基因烟草纯合株系中的SOD、POD和CAT活性均高于野生型株系。
进一步的：所述重组载体为pBSK-74E2.0。
与现有的技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明利用植物基因工程技术获得了UGT74E2异源表达转基因烟草的纯合株系。本发明通过实验证明了UGT74E2转基因烟草纯合株系的炭疽病病菌的致病斑明显小于野生型烟草，致病菌落的数量也少于野生型烟草，而且UGT74E2转基因烟草纯合株系的SOD、POD和CAT均明显高于野生型烟草。本发明的技术方案为植物中抗炭疽病的育种提供了理论依据和实验基础。
附图说明
图1是本发明中UGT74E2基因克隆的结果。
图2是本发明中UGT74E2克隆载体pBSK-74E2.0的PCR验证结果。
图3是本发明中UGT74E2克隆载体pBSK-74E2.0的酶切验证结果。
图4是本发明中植物过表达载体pBI-UGT74E2.0的PCR验证结果。
图5是本发明中植物过表达载体pBI-UGT74E2.0的酶切验证结果。
图6是本发明中pBI-UGT74E2.0重组农杆菌介导的叶盘法对野生型烟草进行侵染，愈伤组织的培养及诱导分化出不定芽。
图7是本发明中不定芽切下并插入选择性的生根培养基上进行生根培养，获得抗性苗。
图8是本发明中提取不同株系抗性苗的DNA进行PCR验证，初步获得UGT74E2异源表达的转基因烟草。
图9是本发明中UGT74E2转基因烟草纯合株系的筛选。(WT：野生型烟草在150mMKan筛选培养基上的筛选结果；1：UGT74E2转基因烟草T2代杂合株系在150mM Kan筛选培养基上的筛选结果；2：UGT74E2转基因烟草T3代纯合株系在150mM Kan筛选培养基上的筛选结果。)
图10是本发明中UGT74E2转基因烟草纯合株系RNA提取的结果。
图11是本发明中通过RT-PCR验证获得UGT74E2高表达的转基因烟草。
图12是本发明中炭疽病菌外源注射后，与野生型株系相比，UGT74E2转基因烟草的纯合株系形成的致病斑要小。
图13是本发明中叶片组织病菌数量的统计，UGT74E2转基因烟草的纯合株系中病菌数量明显低于野生型株系。
图14是本发明中炭疽病菌胁迫下，UGT74E2转基因烟草纯合株系的超氧化物歧化酶SOD活性明显高于野生型株系。
图15是本发明中炭疽病菌胁迫下，UGT74E2转基因烟草纯合株系的过氧化物酶POD活性明显高于野生型株系。
图16是本发明中炭疽病菌胁迫下，UGT74E2转基因烟草纯合株系的过氧化氢酶CAT活性明显高于野生型株系。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进一步的详细说明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：生长素糖基转移酶基因UGT74E2植物过表达重组农杆菌菌株的构建
1、生物信息学方法分析UGT74E2的基因序列
通过拟南芥数据库(http://www.arabidopsis.org)和NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide)，查找生长素糖基转移酶UGT74E2的基因序列，其CDS全长序列共计1362bp(如SEQ ID NO.1所示)。
2、获得UGT74E2的植物过表达重组农杆菌菌株
(1)构建UGT74E2的克隆载体。设计包括酶切位点和保护碱基的引物，克隆UGT74E2的CDS全长序列；通过连接酶体系将UGT74E2的CDS全长序列与pBSK克隆载体连接，构建重组质粒pBSK-74E2.0。其中，构建包括酶切位点的UGT74E2 CDS全长序列的克隆载体质粒所用的引物序列为：
UGT74E2(XbaⅠ)-F：5’-GCTCTAGAATGAGAGAAGGATCTCAT-3’(SEQ ID NO.2)；
UGT74E2(SacⅠ)-R：5’-GCCGAGCTCTCAACAAAACATAGAAACAAAC-3’(SEQ ID NO.3)。
(2)将构建的重组质粒pBSK-74E2.0转化大肠杆菌。经菌液PCR验证(图2)、质粒酶切验证(图3)和测序验证后，提取阳性菌株质粒。
检测UGT74E2克隆载体的重组质粒所用的PCR引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3。
(3)通过XbaⅠ和SacⅠ的双酶切体系分别双切pBSK-74E2.0的克隆重组质粒和pBI121质粒，分别回收目的片段后，进行连接反应，转入农杆菌菌株LBA4404中，经菌液PCR验证(图4)、质粒酶切验证(图5)和测序验证后，获得阳性重组菌株。
实施例2：UGT74E2异源表达转基因烟草纯合株系的构建
1、获得UGT74E2异源表达转基因烟草的T1代
(1)通过构建完成的pBI-UGT74E2.0/LBA4404重组农杆菌介导的叶盘法对野生型烟草进行侵染，愈伤组织的培养及诱导分化，从而获得具有抗性的不定芽(图6)。
(2)将获得的不定芽切下并插入选择性的生根培养基上进行生根培养，获得抗性苗(图7)。
(3)生根后的抗性苗，经过炼苗后移栽入土中，提取不同株系抗性苗的DNA进行PCR验证，初步获得UGT74E2异源表达转基因烟草的T1代(图8)。
筛选UGT74E2转基因烟草T1代的PCR引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。
2、筛选获得UGT74E2异源表达转基因烟草的纯合株系
(1)将通过DNA-PCR验证的UGT74E2转基因烟草T1代植株培养至开花结果，待种子成熟后，分别收取不同株系的种子进行卡那霉素筛选，获得单基因拷贝插入的T2代株系，分别移栽10棵，待培养至开花结种。收成熟种子进行卡那霉素筛选确定转基因烟草的纯合株系(图9)。
(2)提取单拷贝插入的UGT74E2转基因烟草的6个纯合株系，提取RNA(图10)，反转cDNA，进行RT-PCR检测UGT74E2在不同转基因烟草纯合株系的相对表达量，结果如图11所示，6个纯合株系的UGT74E2的表达量都明显升高，选取株系L-1和L-6作为实验材料。
实施例3：生长素糖基转移酶UGT74E2在烟草抗炭疽病中的作用
通过针管外源注射等量的炭疽病菌进入UGT74E2转基因烟草纯合株系(L-1和L-6)和野生型株系叶片的相同位置，侵染14天后，实验结果如图12所示，与野生型植株相比，UGT74E2转基因烟草纯合株系形成的致病斑要小。
实施例4：生长素糖基转移酶UGT74E2在烟草抗炭疽病中的作用
本实施例收获外源侵染炭疽病菌染病的不同株系的叶片，经过表面消毒后，切下相同大小的叶盘。研磨后，将稀释后的研磨液，取等量的匀浆液，接种在培养基上。
28℃下培养约2天，计算每个样品每次稀释的菌落形成单位。实验结果如图13所示，UGT74E2转基因烟草纯合株系形成的致病菌落数量明显少于野生型。
实施例5：生长素糖基转移酶UGT74E2在烟草抗炭疽病中的作用
本实施例收获外源炭疽病菌处理不同时间的不同株系的叶片，液氮速冻，采用试剂盒分别测定各个材料的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的活性。
实验结果如图14、图15和图16所示，UGT74E2转基因烟草纯合株系的SOD、POD和CAT均明显高于野生型烟草。
本发明通过上述实施例证明了UGT74E2转基因烟草纯合株系的炭疽病病菌的致病斑明显小于野生型烟草，致病菌落的数量也少于野生型烟草，而且UGT74E2转基因烟草纯合株系的SOD、POD和CAT均明显高于野生型烟草。本发明证明了生长素糖基转移酶UGT74E2具有明显的抑制烟草炭疽病的作用。
以上事实案例均只代表本发明技术方案，而不是对实验进行限制，虽然我们对实验方案进行了改进，但是同领域的科研人员仍然可以对前面叙述的实验方案进行进一步的改善或者对实验环节进行科学等同替换，这些变动并不使相应技术解决方案的实质偏离本发明要求保护的技术解决方案的精神和范围。
Claims (8)
1.生长素糖基转移酶基因UGT74E2在抑制植物炭疽病中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因UGT74E2的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为烟草。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用的步骤为：
(1)构建包括基因UGT74E2的重组载体，转入农杆菌获得重组农杆菌；
(2)将所述重组农杆菌对野生型烟草侵染并获得具有抗性的不定芽，将不定芽进行生根培养获得抗性苗，培养后获得UGT74E2转基因烟草T1代；
(3)将UGT74E2转基因烟草T1代植株培养至开花结果，待种子成熟后，分别收取种子进行卡那霉素筛选，获得单基因拷贝插入的T2代，培养至开花结种，收T2代成熟种子进行卡那霉素筛选获得UGT74E2转基因烟草纯合株系。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述UGT74E2转基因烟草纯合株系受到炭疽病菌侵害后形成的致病斑明显小于野生型株系。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述UGT74E2转基因烟草纯合株系叶片中的炭疽病菌数量明显低于野生型株系。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述UGT74E2转基因烟草纯合株系中的SOD、POD和CAT活性均高于野生型株系。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述重组载体为pBSK-74E2.0。
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