CN118546978A - AcPME2基因在调控植株生物量和抗逆性中的应用 - Google Patents
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程和分子育种技术领域，具体涉及AcPME2基因在调控植株生物量和抗逆性中的应用，所述AcPME2基因的基因编码的蛋白含有果胶甲基酯酶结构域。过表达所述的AcPME2基因或其蛋白的表达或者活性，增加生物量和抗逆性；抑制或者降低所述的AcPME2基因或其蛋白的表达或活性，减少生物量和降低抗逆性。本发明通过控制果胶甲基酯酶活性可用于增加园艺植物的产量和提高抗逆性。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和分子育种技术领域，具体涉及AcPME2基因在调控植株生物量和抗逆性中的应用。
背景技术
近年来，随着全球气候变化，各种非生物胁迫越来越频繁。由于高等植物的固根性无法逃避恶劣的环境压力。因此，在其整个生命周期中，植物经常暴露于各种非生物胁迫，如干旱、高盐度、冰冻、寒冷、和高温。非生物胁迫改变植物的生理性状和代谢，影响生长发育过程，最终导致作物产量和品质下降。干旱被认为是对作物产量产生不利影响的最有害的胁迫之一。据估计，作物在不利的环境条件下，产量不到其潜在产量的一半，其中缺水是最严重的压力。预计到2050年，干旱将在世界一半以上的可耕地上对植物生长和作物生产力造成严重问题。尽管通过改进耕作和灌溉方法可以通过节水来提高作物产量，但在水分不足的条件下，对作物抗逆性的遗传基础进行修改是一项迫切需要的补充策略，以提高生产力。植物对干旱胁迫具有广泛的生理、生化、细胞和分子适应性，从而使它们能够生存。
细胞壁是植物细胞最基本的组成结构,它在植物细胞的生长发育、抵御外部侵害、细胞内及细胞间的信息传递中起着非常重要的作用。细胞壁主要是由大量的多聚糖包括纤维素、半纤维素以及果胶、酶和结构蛋白复合而成。果胶主要包括半乳糖醛酸聚糖,鼠李半乳醛酸聚糖和,不同植物及不同组织中果胶组成成分各不相同。果胶在不同植物类群细胞壁中的比例也有所不同。果胶是植物细胞壁主要成分之一。大多数植物初生细胞壁主要包含纤维素、半纤维素和果胶。果胶甲基酯酶(pectin methylesterase,PME)存在于所有植物组织中，并且存在于至今所发现的所有种属中。PME是果胶代谢关键酶，主要催化植物细胞壁中果胶的去甲酯化反应，使得果胶随后在多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,PG)和果胶裂解酶(Pectin lyase,PL)等酶的共同作用下降解，最终使细胞壁松弛；或者通过钙离子形成交联结构，最终使细胞壁坚硬。
作为植物细胞壁的主要成分，果胶对细胞壁机械强度的维持和细胞黏附、细胞伸长等有重要作用。而PME参与细胞壁果胶的代谢(即重塑)，进而参与植物营养生长和生殖发育相关的重要生理过程，包括细胞壁延伸和硬化、细胞粘附和分离、果实成熟、木材发育、茎伸长、叶片生长、小孢子发生、花粉管生长和种子萌发等诸多方面。PME还参与植物对生物和非生物胁迫响应过程，前人已有较多总结。但是目前还没有相关果胶甲基酯酶(PMEs)同时影响植物生物量和抗逆性相关的报道。
鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。
发明内容
本发明的目的在于解决如何利用AcPME2基因调控生物量和抗逆性，提供了AcPME2基因在调控植株生物量和抗逆性中的应用。
为了实现上述目的，本发明公开了AcPME2基因在调控植株生物量和抗逆性中的应用，所述AcPME2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过过表达AcPME2基因增加植株生物量，通过抑制AcPME2基因表达减少植株生物量。
所述AcPME2基因的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述植株为拟南芥、番茄或猕猴桃植株。
本发明还公开了AcPME2基因在调控植株抗逆性中的应用，所述AcPME2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过过表达所述AcPME2基因提高植株抗旱性，通过抑制AcPME2基因表达降低植株抗旱性。
所述植株为拟南芥、番茄或猕猴桃植株。
与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明通过将AcPME2基因的表达调控果胶甲基酯酶的活性，从而调控植株的生物量和抗旱性，可用于增加园艺植物的产量和提高抗逆性。
AcPME2过表达植株的生物量增加：与对照相比，AcPME2过表达拟南芥表现出更大的叶片面积以及更重的鲜重；AcPME2过表达番茄植株整体变大，表现出更大的叶片和果实；AcPME2过表达猕猴桃植株整体变大及鲜重增加，表现出更大的叶片。
AcPME2过表达植株对干旱胁迫表现出抗性：在干旱条件下，与对照相比，AcPME2过表达拟南芥表现出更长的主根和侧根，鲜重增加；AcPME2过表达猕猴桃和番茄的根表现出更多更粗壮。说明AcPME2过表达植株更抗旱。
附图说明
图1(a)为过表达AcPME2转基因拟南芥在添加或不添加Mannitol的培养基中生长8d的表型；
图1(b)为突变体pme和回补pme-PME转基因拟南芥在添加或不添加Mannitol的培养基中生长8d的表型；
图1(c)为不同类型拟南芥叶片面积
图1(d)为不同类型拟南芥鲜重；
图1(e)为不同类型拟南芥主根长；
图1(f)为不同类型拟南芥侧根长；
图1(g)为不同类型拟南芥PME活性；
图2(a)为AcPME2过表达番茄的果实，图2(b)为AcPME2过表达番茄的组培苗，图2(c)为AcPME2过表达番茄的叶片，图2(d)为AcPME2过表达番茄的植株；
图2(e)为AcPME2过表达番茄的单果重；
图2(f)为AcPME2过表达番茄的直径
图2(g)为AcPME2过表达番茄的可溶性固形物；
图3(a)～图3(c)为AcPME2过表达猕猴桃的生根组培苗，图3(d)AcPME2过表达猕猴桃的组培苗；
图3(e)为AcPME2过表达猕猴桃植株的叶片面积；
图3(f)为AcPME2过表达猕猴桃植株的净重；
图3(g)为AcPME2过表达猕猴桃植株的根长；
图3(h)为AcPME2过表达猕猴桃植株的单株根的数量；
图4(a)为干旱处理前的AcPME2过表达猕猴桃小苗，图4(b)为干旱处理20d的AcPME2过表达猕猴桃小苗，图4(c)为干旱处理20d的AcPME2过表达猕猴桃小苗根的状态，图4(d)为干旱处理前的AcPME2过表达番茄小苗，图4(e)为干旱处理20d的AcPME2过表达番茄小苗，图4(f)干旱处理20d的AcPME2过表达番茄小苗根的状态；
图4(g)为干旱处理20d的AcPME2过表达猕猴桃的鲜重；
图4(h)为干旱处理20d的AcPME2过表达猕猴桃的叶绿素含量；
图4(i)为干旱处理20d的AcPME2过表达番茄的鲜重；
图4(j)为干旱处理20d的AcPME2过表达番茄的叶绿素含量。
具体实施方式
以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
1、基因克隆与比对
提取四倍体猕猴桃红阳叶片的RNA，反转录成cDNA作为模板来扩增AcPME2(Actinidia06151)基因，得到了1859bp的DNA片段，这些片段的序列都已通过测序进行验证。用软件DNAMAN6.0对AcPME2的氨基酸序列进行比对。
2、过表达载体构建
(1)靶标序列设计：
AcPME2-F：caccagtctctctctaagcttCCTGCATTTTCATTTCCTAG；
AcPME2-R：ctagaggatcaattcgagctcAACAAAAGAACAAAATGTAGAGA。
(2)载体构建：
使用DH5α大肠杆菌、GV3101农杆菌，载体为PHB。
3、猕猴桃AcPME2基因的全长克隆
(1)根据AcPME2基因的cDNA序列和载体PHB中BamHⅠ和XbaⅠ酶切位点的两侧序列，因符合同源重组的要求而设计出引物，利用PCR方法克隆基因，反应体系如下：
| 组分 | 体积 |
| PrimeSTAR | 20μL |
| cDNA | 2μL |
| AcPME2-F(10μmol/L) | 2μL |
| AcPME2-R(10μmol/L) | 2μL |
| ddH2O | up to 40μL |
AcPME2基因的PCR反应程序：95℃，5min；98℃，15sec；52℃，20sec；72℃，2min；30cycles；72℃，5min。
(2)用第一轮PCR产物当作PCR体系的cDNA，做第二轮PCR扩增，PCR反应程序同上。
(3)制作琼脂糖凝胶，用PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，按照DNA回收试剂盒的说明对琼脂糖凝胶目的片段进行回收。
(4)用BamHⅠ和XbaⅠ限制性内切酶对PHB质粒进行双酶切，用琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行验证，切取与基因大小相应的目的条带的琼脂糖凝胶，按照DNA回收试剂盒的说明对琼脂糖凝胶目的片段进行回收。酶切的反应体系：
| 组分 | 体积 |
| 2×Tango buffer | 4μL |
| BamHⅠ | 1μL |
| XbaⅠ | 1μL |
| 质粒 | 1μL |
| ddH2O | up to 20μL |
在37℃条件下酶切2h。
(5)将PHB载体与AcPME2基因的目的片段进行重组反应连接，线性载体与目的片段的比率范围是1:3-1:10。连接的反应体系：
| 组分 | 体积 |
| 5×反应缓冲液 | 4μL |
| 重组酶 | 1μL |
| 线性化载体(ng/μL) | 5..4μL |
| 插入片段 | 1.3μL |
| ddH2O | up to 20μL |
在37℃条件下连接30min，立刻做大肠杆菌转化试验。
(6)用DH5α大肠杆菌感受态对连接产物进行转化。从-80℃冰箱拿出的感受态放置在冰上5min，待其融化后轻弹几下管壁使细胞重悬，加入10μl连接产物到感受态细胞中，轻弹几下，在冰上放置30min；在42℃的水浴热激45s，快速放在冰上静置5min；加入无抗生素的LB液体培养基700μl，在37℃，200r/min的摇床震荡培养1h；4000r/min离心1min，弃去上清液，留下100μl左右的菌液，将菌液混匀后均匀的吸打在含有相应抗生素的LB平板上，倒置在37℃的培养箱过夜培养。
(7)菌落PCR单克隆阳性鉴定，AcPME2基因的鉴定的引物与PCR反应扩增的引物一致。
4、GV3101农杆菌的遗传转化
(1)用提取质粒的试剂盒提取测序正确的相应的载体质粒；
(2)往融化后的GV3101农杆菌感受态中加入10μl质粒，用移液枪吸打混匀后在冰上静置10min；
(3)放入液氮中速冻5min，在37℃水浴5min后立刻放置冰上5min；
(4)加入无抗生素的LB液体培养基700μl，在28℃，200r/min的摇床震荡培养4h；
(5)4000r/min离心1min，弃去上清液，留下100μl左右的菌液，将菌液混匀后均匀的吸打在含有相应抗生素的YEP平板上，倒置在28℃的培养箱培养3-4d；
(6)长出单菌落后做菌液PCR进行验证。
5、拟南芥遗传转化
AcPME2基因采用对拟南芥的花序浸泡的方法进行遗传转化，具体过程如下：
(1)挑取经鉴定是阳性的单克隆在YEP的培养基中，28℃，200r/min条件下活化1-2h；
(2)将5mL活化的菌液加入到含有Kana抗性的300mLYEB液体培养基中，28℃，200r/min条件下培养24h左右；
(3)6000r/min离心10min，弃上清液，加入5％的蔗糖溶液，混匀，离心，弃上清液，再加入5％的蔗糖溶液重复一次，最后配制成OD600为0.6至0.8的转化液，加入silwet L-77至终浓度为0.05％；
(4)将拟南芥提前一天浇透水并剪去果荚。把拟南芥的花序浸入转化液浸泡1min左右，移除后表面附有一层薄膜，用保鲜袋包好密封，测放入托盘遮光培养，24h去掉保鲜袋后立即直立放置正常培养，7d后再侵染转化一次；
(5)拟南芥种子成熟后收集AcPME2基因的种子记作T0代种子；
(6)AcPME2基因的T0代种子在75％酒精消毒3min，无菌水清洗2-3遍，然后用15％次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗5-6遍，最后均匀分布在添加20mg/L潮霉素的1/2MS培养基中萌发，用野生型拟南芥种子在添加20mg/L潮霉素的1/2MS培养基和不添加潮霉素的1/2MS培养基中分别萌发做对照，筛选出的拟南芥阳性苗会长出两片子叶、两片真叶且长根，筛选成活的苗移栽土培，待植株成熟后，采集叶片提取DNA做PCR阳性鉴定获得转基因植株T1代。将这些独立转基因株系进行扩繁，并从T2代中筛选出T-DNA插入纯和的株系，并收集T3代种子进行后续的表型分析。
6、突变体拟南芥的获得
在AraShare公司购买pme突变体拟南芥种子，得到转化苗后将其种植于安徽农业大学人工气候室，鉴定突变体植株。
7、番茄和猕猴桃转基因苗的获得
全长cDNA序列AcPME2插入到PHB载体中。使用以下方法将构建的35S::AcPME2载体转化到‘红阳’和‘Mico Tom’愈伤组织中，农杆菌(GV3101)介导转化。简而言之，将新鲜的愈伤组织浸泡在含有35S::AcPME2的农杆菌溶液中15分钟，然后转移到补充有30mg/L潮霉素的选择培养基中，以筛选抗性愈伤组织。得到转化苗后将其种植于安徽农业大学人工气候室，通过潮霉素抗性鉴定阳性转基因植株。
表达量检测：
提取阳性植株的RNA，反转录用Q Select RT SuperMix for qPCR试剂盒(诺唯赞，南京)进行反转录，操作按其说明书进行。
检测植株表达量，检测引物序列如下：
AcPME2-F TCACCGGCCAACCTGATTAC
AcPME2-R GGGATATGGCTATGGTGGGC
qRT-PCR反应体系：
| 组分 | 体积 |
| SYRR Green PCR Master Mix | 10μL |
| Forward primer | 0.5μL |
| Reverse primer | 0.5μL |
| cDNA | 1μL |
| ddH2O | 8μL |
qRT-PCR反应程序：
8、转基因拟南芥、番茄和猕猴桃的表型观察
AcPME2过表达植株的生物量增加：与对照相比，AcPME2过表达表现出更大的叶片面积以及更重的鲜重(图1(a)、图1(c)、图1(d))；pme突变体的叶片面积和鲜重小于野生型(图1(b)、图1(c)、图1(d))；pme-PME回补的表型介于野生型和过表达之间(图1(b)、图1(c)、图1(d))。AcPME2过表达植株对干旱胁迫表现出抗性：在干旱条件下，与对照相比，AcPME2过表达表现出更长的主根和侧根，鲜重增加(图1a、图1e、图1f)；pme突变体的抗旱性小于野生型(图1(b)、图1(e)、图1(f))；pme-PME回补的抗旱性介于野生型和过表达之间(图1(b)、图1(e)、图1(f))。这些结果表明，AcPME2过表达提高了拟南芥的生物量和抗旱性。
把AcPME2基因分别转入Mico Tom番茄，得到AcPME2过表达植株。确定了AcPME2过表达植株的生物量增加：与对照相比，AcPME2过表达植株整体变大(图2(b)、图2(d))，表现出更大的叶片和果实(图2(a)、图2(c)、图2(e)、图2(f))；与对照相比，AcPME2过表达番茄果实的可溶性固形物增加(图2(g))；这些结果表明，AcPME2过表达提高了Mico Tom番茄的生物量。
把AcPME2基因分别转入红阳猕猴桃，得到AcPME2过表达植株。确定了AcPME2过表达植株的生物量增加：与对照相比，AcPME2过表达植株整体变大(图3(c)、图3(d))及鲜重增加(图3(f))，表现出更大的叶片(图3(a)、图3(e))；与对照相比，AcPME2过表达植株根的长度和数量增加(图3(b)、图3(c)、图3(g)、图3(h))；这些结果表明，AcPME2过表达提高了红阳猕猴桃的生物量。
由于AcPME2过表达红阳比野生型红阳叶片面积更大，根的长度和数量增加。甘露醇处理红阳和AcPME2过表达红阳小苗20d，红阳叶片黄化的程度更明显(图4(a)、图4(b)、图4(h))；AcPME2过表达红阳的根比红阳的更多更粗壮(图4(c))；说明AcPME2过表达红阳比红阳更抗旱。甘露醇处理Mico Tom番茄和AcPME2过表达Mico Tom番茄小苗20d，Mico Tom番茄叶片黄化的程度更明显(图4(d)、图4(e)、图4(j))；AcPME2过表达Mico Tom番茄的根比MicoTom的更多更粗壮(图4(f))；说明AcPME2过表达Mico Tom番茄比Mico Tom番茄更抗旱。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。
Claims (5)
1.AcPME2基因在调控植株生物量中的应用，其特征在于，所述AcPME2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，通过过表达所述AcPME2基因增加植株生物量，通过抑制AcPME2基因表达减少植株生物量。
2.如权利要求1所述的AcPME2基因在调控植株生物量中的应用，其特征在于，所述AcPME2基因的编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的PME基因家族在调控植株生物量中的应用，其特征在于，所述植株为拟南芥、番茄或猕猴桃植株。
4.AcPME2基因在调控植株抗逆性中的应用，通过过表达所述AcPME2基因提高植株抗旱性，通过抑制AcPME2基因表达降低植株抗旱性。
5.如权利要求4所述的PME基因家族在调控植株生物量中的应用，其特征在于，所述植株为拟南芥、番茄或猕猴桃植株。
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