CN116874573A - 一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24及其应用 - Google Patents

一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24及其应用，本发明通过本发明鉴定到一个新的果生炭疽菌分泌植物免疫激活蛋白CfCE24,其可以被植物识别从而激发植物免疫反应，能够诱导植物免疫反应机制(包括防卫相关物质的产生、防御相关基因的表达等)，有望开发成新型生物农药以应用到农业的绿色可持续生产中。

Description

一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说是一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24及其应用。
背景技术
炭疽菌属物种是重要的植物病原体，并且可以感染许多植物宿主，其引起的炭疽病经常在作物上造成严重的危害。
梨炭疽病是梨树上的一种重要真菌病害，其中由果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)引起的梨炭疽病是我国主要梨产区的重要病害之一，在梨树生长和果实成熟时期均可发生，引起果实腐烂、叶片提前脱落造成树势衰弱，严重影响梨的产量和品质。
梨炭疽病又称苦腐病、晚腐病，主要为害果实，也能侵染枝干和叶片等。
目前，梨炭疽病依然是威胁人类梨产业安全的重大隐患之一，极大地限制了梨产业的发展。
效应子是病原菌与寄主互作时产生，并通过干扰植物的抗病信号途径帮助自身成功定殖及侵入的一类小的分泌蛋白，是解析病害发生机制和植物抗病性状的关键。
在病原菌侵染植物过程中，植物会利用细胞表面的模式识别受体(PatternRecognition Receptors,PRRs)识别病原菌分泌的效应子，触发植物的基础免疫反应。这些能够激活植物免疫反应的因子通常被称为植物免疫激发子(Plant Immunity Inducer，PII)，其中很重要的一类是植物免疫激活蛋白。
目前，鉴定病原菌分泌的新型植物免疫诱抗蛋白已经成为植物保护领域的重要发展方向。
参考文献
1.吴良庆,朱立武,衡伟,等.砀山梨炭疽病病原鉴定及其抑菌药剂筛选[J].中国农业科学,2010,43(18):3750-3758.
2.Zhang P F,Zhai L F,Zhang X K,et al.Characterization ofColletotrichum fructicola,a new causal agent of leaf black spot disease ofsandy pear(Pyrus pyrifolia)[J].European Journal of Plant Pathology,2015,143(4):651-662.
3.Li H N,Jiang J J,Hong N,et al.First report of Colletotrichumfructicola causing bitter rot of pear(Pyrus bretschneideri)in China[J].PlantDisease,2013,97(7):1000-1000.
4.Giraldo M C,Valent B.Filamentous plant pathogen effectors in action[J].Nature Reviews Microbiology,2013,11(11):800-814.5.Jones J D G,Dangl JL.The plant immune system[J].nature,2006,444(7117):323-329.
5.Jones J D G,Dangl J L.The plant immune system[J].nature,2006,444(7117):323-329.
发明内容
本发明的目的在于提供一种果生炭疽菌分泌的效应分子CfCE24，其具有激活植物免疫的活性。
本发明的另一目的在于提供该果生炭疽菌的效应分子CfCE24的编码基因。
本发明的又一目的在于提供上述植物免疫激活蛋白CfCE24编码基因的重组表达载体。
本发明的又一目的在于提供上述蛋白和基因在激活植物免疫反应方面的应用。
作为一种优选技术方案，一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24为是如下(a)或(b)：
(a)具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激活植物免疫反应功能相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。
本发明还提供包含上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
优选的，所述的植物表达载体为将所述的基因转入ClaI和XmaI双酶切的pSuper载体得到的；所述的重组表达载体是将所述的基因插入BamHI和NdeI双酶切的pET-28a得到的。
提高植物抗病能力、提高植物防御能力及提高植物对病原菌抗性通过果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE61的方式实现；具体包括如下步骤:
S1：将权利要求1中所述果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE61的编码基因连接到植达载体上，然后转化大肠杆菌，获得重组质粒；
S2：将重组质粒转入农杆菌，并在植物上瞬时表达。
优选的，所述植物表达载体优选为pSuper载体。
优选的，所述大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5α。
优选的，所述的农杆菌优选为农杆菌GV3101。
优选的，上述果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24在诱导植物防御反应及提高植物抗病中的应用。
本发明还提供一种诱导植物抗性反应的方法，在植物叶片中注射述的蛋白CfCE24。
优选的，所述植物为梨树。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明鉴定到一个新的果生炭疽菌分泌植物免疫激活蛋白CfCE24,其可以被植物识别从而激发植物免疫反应，能够诱导植物免疫反应机制(包括防卫相关物质的产生、防御相关基因的表达等)，有望开发成新型生物农药以应用到农业的绿色可持续生产中。
附图说明
图1为植物表达载体pSuper::CfCE24模式图；
图2为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达CfCE24后诱导的烟草叶片过敏反应检测；
图3为原核表达获得的CfCE24纯化蛋白SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色检测；
图4为利用植物表达载体在烟草叶片上注射表达CfCE24后诱导植物防卫相关基因的表达；
图5为植物免疫激活蛋白CfCE24诱导烟草抗辣椒疫霉菌的效果图及发病统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法,通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明实施例所涉及引物由南京擎科生物科技有限公司合成。
实施例一：编码基因的克隆
(1)总RNA提取：以果生炭疽菌菌丝体为实验材料，总RNA的抽提采用Vazyme公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。
(2)反转录生成第一链：取1μg RNA作模板，根据Vazyme公司HiScript II反转录试剂盒使用说明进行cDNA合成。取适量的反转录产物用于随后的基因克隆PCR。
(3)以cDNA为PCR模板，扩增CfCE24基因的成熟序列：
PCR引物扩增序列：
上游引物：SEQ ID NO.3
TACACCAAATCGACTCTAGAATGCAGTTCGCCTACTTCCT
下游引物：SEQ ID NO.4
GGAAATTCGAGCTCGGTACCTTAGACGCAGCTGTCGCTGC
50μL反应体系：2×Phanta Max Mix Buffer 25μL，10mM dNTPs 1μL，Vazyme DNAPolymerase 1μL，模板cDNA2μL，加水至50μL；PCR扩增程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸5min；利用琼脂糖凝胶进行电泳分离，核酸染料染色照相，记录结果，并切胶回收PCR产物。
用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme)对电泳条带进行回收(该PCR产物条带即为植物免疫激活蛋白CfCE24基因，送南京擎科公司测序，序列如SEQID NO.1所示，其所编码的植物免疫激活蛋白CfCE24氨基酸序列如SEQID NO.2所示)。
切胶回收的PCR产物根据CloneExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme)按照说明操作连接到XbaI和KpnI双酶切的pSuper载体上得到含有pSuper::CfCE24连接产物。
将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5ɑ，涂LB(含卡纳50μg/mL)平板，37℃培养12h后菌落PCR验证挑取两个阳性克隆按照质粒提取试剂盒操作(Vazyme)提取质粒，送南京擎科公司测序。
测序正确的质粒转化到农杆菌GV3101中，涂含有相应抗生素的LB平板(卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)，28℃培养48h后菌落PCR验证挑取正确克隆进行后续实验。
结果显示：获得植物表达载体pSuper::CfCE24，其模式图如图1所示。
实施例二：烟草中瞬时表达CfCE24诱导坏死反应的检测
(1)农杆菌培养
分别从平板上挑取含有相关载体的农杆菌GV3101单菌落，接种到4mL LB液体培养基中(含卡纳霉素50μg/mL，利福平50μg/mL)于恒温摇床上28℃，180rpm培养过夜至OD600为0.6。将过夜培养的GV3101农杆菌液6000g离心3min收集菌体。
用缓冲液(组分：10mM2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，10mM MgCl2，0.1mMacetosyringone pH5.6)悬浮菌液后离心收集菌体。重复洗2次后，用缓冲液稀释菌液，最终浓度各为0.5。
(2)烟草叶片瞬时表达CfCE24
配好的农杆菌用1mL去掉针头的注射器注射到烟草叶片中，注射后烟草于温室(22-25℃、16h光照/8h黑暗)培养。
(3)坏死反应的检测
农杆菌注射表达4-5天后，观察烟草叶片的坏死情况，待出现明显表型后，采集叶片进行拍照。
结果：与阴性对照GFP相比，CfCE24和阳性对照INF1都能够引起烟草叶片细胞坏死，如图2所示。
实施例三：CfCE24进行原核表达和纯化蛋白诱导防卫相关基因的表达
(1)原核表达载体的构建
以果生炭疽病菌与梨互作的cDNA文库为模板，根据载体酶切位点设计特异性引物。
上游引物：SEQ ID NO.5
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCTCGACCCGGCCACC
下游引物：SEQ ID NO.6
ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGACGCAGCTGTCGCT
用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs)克隆目的基因。随后使用ClonExpress一步克隆试剂盒(Vazyme)将克隆片段连接至植物表达载体pET-28a，用热击法将载体转化至大肠杆菌DH5α感受态，挑取阳性克隆，摇菌并提取质粒，测序验证。
(2)蛋白诱导表达
将步骤(1)所获得的正确质粒用热击法将转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态，经过卡那霉素筛选后挑取单克隆至5mL LB，37℃，200rpm培养10h。按照比例(1:100)于100mL LB中扩大培养至OD600＝0.6，加入0.3M IPTG进行诱导表达，16℃，200rpm培养24h，5000g，离心10min收集菌体，PBS缓冲液(pH7.4)洗涤两次。将菌体重悬于裂解缓冲液(20mM Na2HPO4，300mM NaCl，pH7.4，1mg/mL lysozyme，1mMPMSF，1.98mM巯基乙醇)，超声破碎15min，10000g离心10min，吸取上清液获得CfCE24粗蛋白。
(3)蛋白纯化
用适量的Ni-NTA(Thermo Scientific)树脂填充柱。
能够使缓冲液通过重力流从树脂中排出。
通过将蛋白质提取物与等体积的平衡缓冲液(20mM磷酸钠、300mM氯化钠和10mM咪唑；pH 7.4)混合来制备样品。
用两倍树脂床体积的平衡缓冲液平衡柱子，让缓冲液从柱子中流出。将制备好的蛋白提取物加入树脂中，在管中收集流通液。
如果需要，重新应用流过一次以最大化吸附。用两倍树脂床体积的清洗缓冲液(含25mM咪唑的PBS；pH 7.4)洗涤树脂并收集流出液。
使用新的收集管重复此步骤。用两倍树脂床体积的洗脱缓冲液(含250mM咪唑的PBS；pH 7.4)从树脂上洗脱His标签蛋白。重复此步骤两次，将每个馏分收集在单独的管中。
用PBS(20mM磷酸钠、300mM氯化钠；pH 7.4)缓冲液进行透析。
结果：所获得的CfCE24纯化蛋白(His-CfCE24)进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色后能看到明显的目的条带(约25kDa)，如图3所示。
实施例四：CfCE24纯化蛋白诱导防卫烟草相关基因的大量上调表达
(1)烟草叶片注射CfCE24纯化蛋白
将实施案例3所获的纯化蛋白进行浓度测定，稀释至1μM。用1mL去掉针头的注射器将稀释后的纯化蛋白注射到烟草叶片中，同时注射PBS缓冲液作为对照(Buffer)，完成后注射完成后置于温室(22-25℃、16h光照/8h黑暗)培养。
(2)总RNA提取
以CfCE24纯化蛋白处理4h的烟草样品为实验材料，总RNA的抽提采用Vazyme公司RNA提取试剂盒按照说明操作，用分光度计检测其RNA含量和质量。
(3)反转录生成第一链
取1μg RNA作模板，根据Vazyme公司HiScript II反转录试剂盒使用说明进行cDNA合成。取适量的反转录产物用于随后的实时定量PCR反应。
(4)实时定量PCR反应
NbPR1定量前引物：SEQ ID NO.7
CCGCCTTCCCTCAACTCAAC
NbPR1定量后引物：SEQ ID NO.8
GCACAACCAAGACGTACTGAG
NbPR4定量前引物：SEQ ID NO.9
GGCCAAGATTCCTGTGGTAGAT
NbPR4定量后引物：SEQ ID NO.10
CACTGTTGTTTGAGTTCCTGTTCCT
NbCYP71D20定量前引物：SEQ ID NO.11
AAGGTCCACCGCACCATGTCCTTAGAG
NbCYP71D20定量后引物：SEQ ID NO.12
AAGAATTCCTTGCCCCTTGAGTACTTGC
PCR反应体系包含cDNA 1μL，RealStar Fast SYBR qPCR Mix 10μL，前后引物各1μL，水7μL。反应程序：I:95度2分钟，II:95度15秒，60度30秒，步骤II应40个循环。溶解曲线分析程序是：95度15秒，60度1分钟，95度15秒。
结果：与对照(Buffer)相比，1μM的CfCE24纯化蛋白能够诱导烟草防卫相关基因的大量上调表达，如图4所示。
实施例5：CfCE24纯化蛋白增强烟草对核盘菌和辣椒疫霉的抗性
(1)烟草叶片注射CfCE24纯化蛋白
测定实施案例3所获纯化蛋白的浓度并稀释至1μM。用1mL去掉针头的注射器将稀释后的纯化蛋白注射到烟草叶片中，同时注射PBS缓冲液作为对照(Buffer)，完成后注射完成后置于温室(22-25℃、16h光照/8h黑暗)培养。
(2)烟草叶片分别接种核盘菌和辣椒疫霉
核盘菌是引起油菜菌核病的病原，属于真菌，寄主范围广、对农作物危害大；辣椒疫霉是引起诱导辣椒疫病的病原，属于卵菌，对农作为具有重要危害。蛋白诱导12h后，在上述处理的叶片上分别接种提前准备好的核盘菌和辣椒疫霉，最后置于温室(22-25℃、16h光照/8h黑暗)培养。24h后观察、统计核盘菌的发病情况并拍照；36h后观察、统计辣椒疫霉的发病情况并拍照。
结果：与对照(Buffer)相比，1μM的CfCE24纯化蛋白能够显著增强烟草叶片对核盘菌和辣椒疫霉的抗性，如图5所示
本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列说明：
CfCE24基因全长核苷酸序列：SEQ ID NO.1
ATGCAGTTCGCCTACTTCCTCCTCGCCGCCCCCGCCCTCGTGGCCGCCACCCTCGACCCGGCCACCTCCAACACCAAGGGCGCCTGCCCGAGCGTCTACAACTGCAGCGCGACCAAGGTGTCCAAGGCCATCCAGGCCGCCGAGTGCTCGCACAACACGCGCACCTCCAAGACGCAGACCTTTGCCGTCTTCGAGACGGACCACCAATACGACGGCAACAACGGCGCCCCCTACGGCACCTGCTCCGCGTACACCTGCGACCCGCCCACGAGCTCGCAGATGACGACTGACGCGGACTGCTGGACCTTCTTCTGGAGCGGCGAGGGAACTTCCTCTGGCGAGGGCGCTGGATGCATCAAGGACCCCAACACTGGCGAGTGCGGCTGCGAGAACTCTGATGGAACCTTCGTTCCTGGCAGCGACAGCTGCGTCTAA
CfCE24成熟蛋白序列：SEQ ID NO.2
MTLDPATSNTKGACPSVYNCSATKVSKAIQAAECSHNTRTSKTQTFAVFETDHQYDGNNGAPYGTCSAYTCDPPTSSQMTTDADCWTFFWSGEGTSSGEGAGCIKDPNTGECGCENSDGTFVPGSDSCV
实施案例1中的PCR引物扩增序列：
上游引物：SEQ ID NO.3
TACACCAAATCGACTCTAGAATGCAGTTCGCCTACTTCCT
下游引物：SEQ ID NO.4
GGAAATTCGAGCTCGGTACCTTAGACGCAGCTGTCGCTGC
实施案例3中的PCR引物扩增序列：
上游引物：SEQ ID NO.5
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGACCCTCGACCCGGCCACC
下游引物：SEQ ID NO.6
ACGGAGCTCGAATTCGGATCCTTAGACGCAGCTGTCGCT
实施案例4中的实时定量PCR反应引物
NbPR1定量前引物：SEQ ID NO.7
CCGCCTTCCCTCAACTCAAC
NbPR1定量后引物：SEQ ID NO.8
GCACAACCAAGACGTACTGAG
NbPR4定量前引物：SEQ ID NO.9
GGCCAAGATTCCTGTGGTAGAT
NbPR4定量后引物：SEQ ID NO.10
CACTGTTGTTTGAGTTCCTGTTCCT
NbCYP71D20定量前引物：SEQ ID NO.11
AAGGTCCACCGCACCATGTCCTTAGAG
NbCYP71D20定量后引物：SEQ ID NO.12
AAGAATTCCTTGCCCCTTGAGTACTTGC

Claims (10)

1.一种果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24，是如下(a)或(b)：
(a)具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与激活植物免疫反应功能相关的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。
2.含有权利要求1所述蛋白CfCE24的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体为重组表达载体或表达载体；所述的植物表达载体为将所述的基因转入ClaI和XmaI双酶切的pSuper载体得到的；所述的重组表达载体是将所述的基因插入BamHI和NdeI双酶切的pET-28a得到的。
4.如权利要求1所述的提高植物抗病能力、提高植物防御能力及提高植物对病原菌抗性通过果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE61的方式实现；具体包括如下步骤:
S1：将权利要求1中所述果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE61的编码基因连接到植达载体上，然后转化大肠杆菌，获得重组质粒；
S2：将重组质粒转入农杆菌，并在植物上瞬时表达。
5.如权利要求4所述果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24的应用，其特征在于：所述植物表达载体优选为pSuper载体。
6.如权利要求4所述果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24的应用，其特征在于：所述大肠杆菌优选为大肠杆菌DH5α。
7.如权利要求4所述果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24的应用，其特征在于：所述的农杆菌优选为农杆菌GV3101。
8.权利要求1所述的果生炭疽菌分泌的植物免疫激活蛋白CfCE24、权利要求2所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在诱导植物防御反应及提高植物抗病中的应用。
9.一种诱导植物抗性反应的方法，在植物叶片中注射述的蛋白CfCE24。
10.如权利要求9所述的一种诱导植物抗性反应的方法，其特征在于：所述植物为梨树。
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