CN116854929B - 基于NH2-MIL-53（Al）的黄曲霉毒素B1的检测方法 - Google Patents
基于NH2-MIL-53（Al）的黄曲霉毒素B1的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于NH2‑MIL‑53(Al)的黄曲霉毒素B1的检测方法，属于黄曲霉毒素检测技术领域。本发明的NH2‑MIL‑53(Al)是由AlCl3·6H2O溶于超纯水中，在搅拌下加入NH2‑BDC，然后在搅拌条件下加入尿素水溶液，在150℃保持5h，自然冷却至室温，得到的黄色固体。本发明制备的NH2‑MIL‑53(Al)对AFB1具有较好的灵敏度和选择性，通过在静电纺丝纳米纤维薄膜上加载荧光探针，制备了便携式柔性传感器。柔性传感器与智能手机的成功结合大大降低了检测成本和时间，为现场AFB1的定性识别和定量检测提供了一种很有前景的方法。
Description
技术领域
本发明属于黄曲霉毒素检测技术领域，具体涉及一种基于NH2-MIL-53(Al)的黄曲霉毒素B1的检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1)是最有害和常见的真菌毒素，有必要建立一种经济、灵敏、简便和快速的AFB1检测方法。
目前，检测AFB1的方法主要有酶联免疫吸附试验、高效液相色谱法、膜流式免疫分析法、免疫分析色谱法和电化学法。色谱法虽然对AFB1的传感灵敏，但该法的成本高、样品制备过程复杂，对使用者的技术要求也高。在免疫测定色谱法中掺入生物分子也使得该方法不太稳健。这些方法还有一些共同的缺点，如设备昂贵，操作复杂且耗时。这些缺点可能会限制这些方法在发展中国家的广泛采用。发光金属有机骨架(LMOFs)作为一种新型的化学传感器，因其灵敏度上级、底物选择性好、重现性好、设备简单等优点而备受关注。迄今为止，已经有一些使用基于MOF的传感器来检测AFB1的报道。但这些传感器的感测机制是发光猝灭(即荧光猝灭)，通常被称为“关闭”感测，其缺乏基于发光“开启”原理操作的那些传感器的优点，如优异的灵敏度、选择性和实用性。因此，开发用于检测AFB1的稳健且高效的基于MOF的荧光“开启”传感器更有意义且需求量很高。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于NH2-MIL-53(Al)的黄曲霉毒素B1的检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种NH2-MIL-53(Al)，制备方法如下：
(1)将AlCl3·6H2O溶于超纯水中，在搅拌下加入NH2-BDC，搅拌，得到“溶液1”；
(2)将尿素溶于超纯水，得到“溶液2”；
(3)在连续搅拌下将“溶液2”缓慢加入“溶液1”中，搅拌混匀后，在150℃保持5h，自然冷却至室温，得到黄色固体；
(4)用去离子水洗涤黄色固体三次并通过离心分离，将黄色固体分散在DMF中，并将悬浮液在室温下、黑暗中搅拌24h，然后通过离心除去DMF；将上述固体再分散于甲醇中，在黑暗中、室温下搅拌24h，然后通过离心除去甲醇；
(5)将步骤(4)洗涤后的产物在50℃下真空干燥24h，即得NH2-MIL-53(Al)粉末。
上述NH2-MIL-53(Al)在黄曲霉毒素检测中的应用。
一种黄曲霉毒素的检测方法，将上述NH2-MIL-53(Al)制备成分散液，将待测样品溶液加入分散液中，室温孵育后，在330nm的激发下，记录混合溶液在430nm的荧光强度，对照荧光强度与黄曲霉毒素浓度的标准曲线，计算获得待测样品中黄曲霉毒素的含量。
上述NH2-MIL-53(Al)在制备检测黄曲霉毒素的试剂中的应用。
一种装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜，是上述的NH2-MIL-53(Al)通过静电纺丝的方法制备成纳米纤维膜。
在一个具体的实施例中，所述装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜制备方法如下：
取上述的的NH2-MIL-53(Al)粉末、聚丙烯腈(PAN)溶解在DMF中，在90℃下剧烈搅拌2小时，获得NH2-MIL-53(Al)/PAN溶液；将NH2-MIL-53(Al)/PAN溶液装入一次性针管中，放入静电纺丝设备中进行纺丝。
上述装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜在黄曲霉毒素检测中的应用，可用于检测谷物或花生中的黄曲霉毒素。
使用上述装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜检测黄曲霉毒素的方法，向装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜上滴加待测样品溶液，室温孵育后，拍摄纳米纤维的荧光照片，通过颜色识别软件快速获取照片的G和B数据，计算G/B的值，将其代入G/B和黄曲霉毒素浓度的关系曲线中，计算获得该物质中黄曲霉毒素浓度。
在一个具体的实施例中，所述待测样品溶液由以下方法制备而成：取粉碎的样品与乙腈混合，然后将上清液旋转蒸发至接近干燥，再分散在PBS溶液中，离心并通过0.22μm滤膜过滤，即得待测样品溶液。
本发明技术方案的优点
本申请提供了一种基于低浓度铝金属有机框架的荧光检测平台，用于检测AFB1。具体是采用NH2-MIL-53(Al)作为荧光平台。NH2-MIL-53(Al)在水溶液中具有呼吸效应和稳定性。氨基可以通过氢键、酸碱效应和配位键等多种分子间相互作用与AFB1相互作用。NH2-MIL-53(Al)对AFB1的灵敏度和选择性为快速检测食品中AFB1提供了一种新方法。此外，通过在静电纺丝纳米纤维薄膜上加载荧光探针，制备了便携式柔性传感器。柔性传感器与智能手机的成功结合大大降低了检测成本和时间，为现场AFB1的定性识别和定量检测提供了一种很有前景的方法。
附图说明
图1基于NH2-MIL-53(A1)的黄曲霉毒素B1检测原理；
图2NH2-MIL-53(A1)溶液的稳定性；
图3NH2-MIL-53(A1)的发射光谱；
图4NH2-MIL-53(A1)的激发、发射和紫外-吸收光谱；
图5NH2-MIL-53(A1)的XRD图谱；
图6NH2-MIL-53(A1)和NH2-BDC的傅立叶变换红外光谱；
图7NH2-MIL-53(A1)的热重分析(TGA)；
图8NH2-MIL-53(A1)和NH2-MIL-53(A1)+AFB1的紫外-吸收光谱；
图9荧光检测AFB1的灵敏度图和颜色变化图；
图10AFB1浓度的线性关系图；
图11G/B和AFB1浓度的关系线性曲线；
图12静电纺丝纳米纤维检测AFB1的图；
图13NH2-MIL-53(Al)的特异性；
图14NH2-MIL-53(Al)的抗干扰性。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明检测黄曲霉毒素B1的原理如图1所示，
采用AlCl3·6H2O和NH2-BDC在尿素溶液中制备成NH2-MIL-53(Al)；所制备的NH2-MIL-53(Al)在330nm的激发波长下，在430nm处有最强的荧光发射。可以将所制备的NH2-MIL-53(Al)直接分散于PBS溶液中制备成分散液，向分散液中加入待测样品，如果待测样品中含有AFB1，则检测430nm处的荧光强度，对照荧光强度与AFB1浓度的标准曲线获得待测样品中的AFB1浓度。
或者，将所制备的NH2-MIL-53(Al)通过静电纺丝的方法制备成装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜，向纳米纤维膜上滴加待测样品溶液，用智能手机拍摄纳米纤维的荧光照片。颜色识别APP可以将不同的颜色图片转换成RGB三个数值，取G和B数值的比值做图。通过颜色识别APP快速获取这些照片的G和B数据，计算G/B的值，将其代入G/B和AFB1浓度的关系线性曲线中，计算获得该物质中AFB1浓度。
实施例1
NH2-MIL-53(Al)的制备，步骤如下：
将1.448g AlCl3·6H2O溶于30mL超纯水中，在磁力搅拌下加入1.088g NH2-BDC，搅拌30min，得到“溶液1”。在另一个容器中，将0.576g尿素溶于10mL超纯水，得到“溶液2”。在室温和连续搅拌下将“溶液2”缓慢加入“溶液1”中，搅拌30min。将混合物转移到聚四氟乙烯内衬的反应釜中，在150℃保持5h。然后，将其自然冷却至室温。用去离子水洗涤黄色固体三次并通过离心(12000rpm，10min)分离。将黄色固体分散在40mL DMF中，并将悬浮液在室温下、黑暗中搅拌24h。然后通过离心除去DMF。将上述固体再分散于40mL甲醇中，在黑暗中、室温下搅拌24h。然后通过离心除去甲醇。最后，将产物在50℃下真空干燥24h。收集得到NH2-MIL-53(Al)粉末。
NH2-MIL-53(A1)发射光谱的测定：的发射光谱，在300-360nm的激发下分别记录0.55μg/mL NH2-MIL-53(A1)溶液的荧光光谱。结果如图2示：在激发波长为330nm时，可看出430nm处的峰值最高，因此330nm是NH2-MIL-53(A1)最佳激发波长。
检测不同pH值、温度、紫外照射和储存时间对NH2-MIL-53(A1)溶液稳定性的影响，具体测定方法如下：
pH：用不同pH的溶液稀释NH2-MIL-53(A1)溶液至0.55μg/mL，用酶标仪在330nm激发下测试荧光强度，记录在峰值430nm处的荧光强度。
温度：将0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)溶液置于不同的温度下，用酶标仪在330nm激发下测试荧光强度，记录在峰值430nm处的荧光强度。
紫外照射：将0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)溶液用紫外灯照射，用酶标仪在330nm激发下测试荧光强度，记录在峰值430nm处的荧光强度。
长期储存：将0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)溶液在室温下放置，测试它在1、3、5、7、15、30天的荧光稳定性，用酶标仪在330nm激发下测试荧光强度。
NH2-MIL-53(A1)溶液的稳定性如图3所示：通过研究NH2-MIL-53(A1)溶液在不同PH、温度、紫外照射和长期储存下的荧光强度，发现NH2-MIL-53(A1)溶液的荧光强度保持相对稳定。表明NH2-MIL-53(A1)溶液具有优异的光学性能，能够更好的用于后续对AFB1的检测。
NH2-MIL-53(A1)的激发、发射和紫外-吸收光谱的测定，步骤如下：
激发光谱：将0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)溶液加入到96孔黑色酶标仪板中，在430nm发射下，记录激发光谱。
发射光谱：将0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)溶液加入到96孔黑色酶标仪板中，在330nm激发下，记录发射光谱。
紫外-吸收光谱：取2mL NH2-MIL-53(A1)溶液加入石英比色皿中，放入紫外分光光度计中，在波长200-600nm范围内，记录紫外-吸收光谱。
结果如图4所示：表征了NH2-MIL-53(A1)的光学性质。紫外-吸收光谱显示在220和330nm处的两个特征吸收峰。在220nm处的吸收峰由C＝C基团的π-π*跃迁或C＝O基团的n-π*跃迁引起。在330nm处的特征吸收峰归因于C＝O/C-N基团的n-π*跃迁，这与荧光光谱的最佳激发波长一致。
NH2-MIL-53(A1)的XRD图谱，测定方法为：使用X射线衍射仪测量NH2-MIL-53(A1)粉末的XRD图谱。将NH2-MIL-53(A1)粉末研细，取适量粉末放入带凹槽的玻璃板上，放入仪器中进行测试。结果如图5所示：制备的NH2-MIL-53(A1)纳米片的前体结晶良好。典型的峰在8.8°，10.4°，15.0°，17.5°，20.0°和26.4°也证明了材料被成功制备。
NH2-MIL-53(A1)和NH2-BDC的傅立叶变换红外光谱，检测方法为：使用傅立叶变换红外光谱仪测量NH2-MIL-53(A1)粉末和NH2-BDC粉末的红外光谱。取适量的上述两种物质的粉末置于仪器上，刨除空气背景干扰后，记录红外光谱。结果如图6所示：3504cm-1和3390cm-1处的谱带对应于N-H键的不对称伸缩振动，表明NH2-MIL-53(Al)纳米片中含有丰富的羟基，这有助于其显著的水溶性。此外，在1000-1100cm-1处的新谱带来自Al-O键的伸缩振动，进一步表明NH2-BDC中的O原子与Al3+配位形成金属有机骨架。
NH2-MIL-53(A1)的热重分析(TGA)，检测方法为：使用差示扫描量热仪进行测试。称取最多0.5g的NH2-MIL-53(A1)的粉末置于小坩埚中，放入仪器，设置温度范围为30-800℃，测试其热稳定性。结果如图7所示：研究NH2-MIL-53(A1)的热稳定性，TGA数据揭示其在高达280℃下是热稳定的。
实施例2
装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜的制备，步骤如下：
取10mg实施例1方法制备的NH2-MIL-53(Al)粉末、1g聚丙烯腈(PAN)(Mw＝150000)溶解在9mL DMF中，在90℃下剧烈搅拌2小时，获得NH2-MIL-53(Al)/PAN溶液。
将上述NH2-MIL-53(Al)/PAN溶液装入10mL的一次性针管中，放入静电纺丝设备中进行纺丝。采用YFSP-T静电纺丝设备制备NH2-MIL-53(Al)纳米纤维膜，使用注射泵将溶液以0.002mms-1的速率进针，高压电压：30Kv，接收器转速：0.1r/min。
实施例3
NH2-MIL-53(Al)在检测黄曲霉毒素B1中的应用
室温下将5mg实施例1制备的NH2-MIL-53(A1)分散在10mL PBS(0.01M，pH＝7.4)中并超声5min。稀释后，制备0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)分散液；将待测样品加入NH2-MIL-53(A1)分散液中，室温下孵育5min后，在330nm的激发下，记录混合溶液在430nm的荧光强度。对照荧光强度与AFB1浓度的标准曲线，计算获得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
NH2-MIL-53(A1)和NH2-MIL-53(A1)+AFB1的紫外-吸收光谱的检测，方法为：分别取2mL NH2-MIL-53(A1)溶液和NH2-MIL-53(A1)+AFB1混合溶液加入石英比色皿中，放入紫外分光光度计中，在波长200-600nm范围内，记录紫外-吸收光谱。结果如图8所示：随着AFBl的添加，NH2-MIL-53(Al)在330nm处的吸收峰红移至340nm，这进一步证实了NH2-MIL-53(Al)与AFBl之间存在强相互作用。
荧光检测AFB1的灵敏度图和颜色变化，具体步骤为：在0.55μg/mL的NH2-MIL-53(Al)溶液中加入不同浓度的AFB1溶液，混匀后在室温下孵育5min。将各溶液加入到96孔黑色酶标仪板中，在330nm的激发下记录其荧光。结果如图9所示：可以看出随着AFB1浓度的增加，NH2-MIL-53(Al)的蓝色荧光被激发出来，且蓝光越来越强，即在430nm的峰值不断增强。AFB1浓度的线性关系如图10所示：AFB1添加量为0的430nm处的峰值作为基底，即F0，再取其他浓度的峰值作为F。计算F/F0，该比值和AFB1有线性关系，线性关系的R2＝0.99，证明线性关系良好，数据有意义，线性范围：0-40μM，检测限3.1ppb。
实施例4
NH2-MIL-53(Al)纳米纤维膜在检测黄曲霉毒素B1中的应用
将NH2-MIL-53(Al)纳米纤维裁剪成直径为1cm的圆盘状。滴加不同浓度的AFB1溶液15μL。5min后，在365nm的紫外灯照射下，用智能手机拍摄纳米纤维的荧光照片。通过颜色识别APP快速获取这些照片的G和B数据，计算G/B的值，将其代入G/B和AFB1浓度的关系线性曲线(如图11，线性范围：0-30μM，检测限：29.2ppb)中，计算获得该物质中AFB1浓度。
NH2-MIL-53(Al)纳米纤维检测AFB1的结果如图12所示：在365nm的紫外灯照射下观察颜色变化。可以通过肉眼清晰的观察到随着AFB1浓度的增加，蓝色荧光越来越强。
实施例5
NH2-MIL-53(Al)的特异性
室温下将5mg实施例1制备的NH2-MIL-53(A1)分散在10mL PBS(0.01M，pH＝7.4)中并超声5min。稀释后，制备0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)分散液并用于荧光实验。随后，向900μL分散液中加入50μL 100μM的AFB1溶液以达到AFB1最终浓度为5μM或其他干扰物质赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Hg2+、Co2+、Fe3+、Al3+、Ba2+、抗坏血酸(AA)、没食子酸(GA)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Try)、L-赖氨酸(Lys)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酸(Glu)、葡萄糖(GL)、蔗糖(SR)、乳糖(LC)、果糖(FR)、ML(麦芽糖)。室温下孵育5min后，在330nm的激发下，记录混合溶液在发射峰430nm处的荧光强度，计算F/F0的值，做图。F0指的是没有添加AFB1时在430nm处的荧光强度，F指的是加入AFB1或其他物质后在430nm处的荧光强度。所有测试重复三次，以确保统计准确性。
结果如图13所示：NH2-MIL-53(Al)对黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)具有较高的响应，其中对AFB1的响应最灵敏。
NH2-MIL-53(Al)的抗干扰性
室温下将5mg实施例1制备的NH2-MIL-53(A1)分散在10mL PBS(0.01M，pH＝7.4)中并超声5min。稀释后，制备0.55μg/mL的NH2-MIL-53(A1)分散液并用于荧光实验。随后，向分散液中加入100μM的AFB1溶液以达到AFB1最终浓度为5μM；然后向含有AFB1的溶液中加入干扰物质赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、Na+、K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Hg2+、Co2+、Fe3+、Al3+、Ba2+、抗坏血酸(AA)、没食子酸(GA)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Try)、L-赖氨酸(Lys)、L-半胱氨酸(Cys)、L-谷氨酸(Glu)、葡萄糖(GL)、蔗糖(SR)、乳糖(LC)、果糖(FR)、ML(麦芽糖)，研究在AFB1和干扰物同时存在的情况下，NH2-MIL-53(Al)的抗干扰性。其中，AFB1的浓度是5μM，OTA、ZEN的浓度也是5μM，其他干扰物质浓度是250μM。室温下孵育5min后，在330nm的激发下，记录混合溶液在发射峰430nm处的荧光强度，计算F/F0的值，做图。F0指的是没有添加AFB1时在430nm处的荧光强度，F指的是加入AFB1或其他物质后在430nm处的荧光强度。所有测试重复三次，以确保统计准确性。
结果如图14所示，在AFB1和干扰物同时存在的情况下，可以看出NH2-MIL-53(Al)的抗干扰性好。
实施例6
NH2-MIL-53(Al)检测实际样品中AFB1的应用实例及稳定性
待测样品预处理：取粉碎的大米样品(200g)与400mL乙腈混合20分钟，然后将上清液旋转蒸发至接近干燥，然后再分散在100mL PBS溶液中。再将混合物离心(10，000rpm，10分钟)并通过0.22μm滤膜过滤，即得待测样品溶液。
将待测样品溶液加入NH2-MIL-53(A1)分散液中，室温下孵育5min后，在330nm的激发下，记录混合溶液在在430nm的荧光光谱，对照荧光强度与AFB1浓度的标准曲线，计算获得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量。
或
将待测样品溶液滴加到NH2-MIL-53(Al)纳米纤维膜裁剪成的直径为1cm的圆盘上，5min后，用智能手机拍摄纳米纤维的荧光照片。通过颜色识别APP快速获取这些照片的G和B数据，计算G/B的值，将其代入G/B和AFB1浓度的关系线性曲线中，计算获得该物质中AFB1浓度。
检测方法的稳定性
采用上述方法处理大米样品，向空白大米样品溶液中分别加入AFB1并使其终浓度为0.1、0.5、1、2.5、5μmolL-1，将上述混合溶液加入NH2-MIL-53(A1)分散液中，室温下孵育5min后，在330nm的激发下，记录混合溶液在在430nm的荧光光谱，对照荧光强度与AFB1浓度的标准曲线，计算获得待测样品中黄曲霉毒素B1的含量，计算AFB1的回收率，结果如表1所示。
表1检测方法的稳定性
由表1可知，本发明方法的稳定性较好，可用于实际样品中AFB1的检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (2)
1.使用装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，向装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜上滴加待测样品溶液，室温孵育后，拍摄纳米纤维的荧光照片，通过颜色识别软件快速获取照片的G和B数据，计算G/B的值，将其代入G/B和黄曲霉毒素浓度的关系曲线中，计算获得待测样品溶液中黄曲霉毒素浓度；
所述装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜的制备方法如下：
取NH2-MIL-53(Al)粉末、聚丙烯腈(PAN)溶解在DMF中，在90℃下剧烈搅拌2小时，获得NH2-MIL-53(Al)/PAN溶液；将NH2-MIL-53(Al)/PAN溶液装入一次性针管中，放入静电纺丝设备中进行纺丝；
所述NH2-MIL-53(Al)粉末的制备方法如下：
(1)将AlCl3·6H2O溶于超纯水中，在搅拌下加入NH2-BDC，搅拌，得到“溶液1”；
(2)将尿素溶于超纯水，得到“溶液2”；
(3)在连续搅拌下将“溶液2”缓慢加入“溶液1”中，搅拌混匀后，在150℃保持5h，自然冷却至室温，得到黄色固体；
(4)用去离子水洗涤黄色固体三次并通过离心分离，将黄色固体分散在DMF中，并将悬浮液在室温下、黑暗中搅拌24h，然后通过离心除去DMF；将上述固体再分散于甲醇中，在黑暗中、室温下搅拌24h，然后通过离心除去甲醇；
(5)将步骤(4)洗涤后的产物在50℃下真空干燥24h，即得NH2-MIL-53(Al)粉末。
2.根据权利要求1所述使用装载NH2-MIL-53(Al)的静电纺丝纳米纤维膜检测黄曲霉毒素的方法，其特征在于，所述待测样品溶液由以下方法制备而成：取粉碎的样品与乙腈混合，然后将上清液旋转蒸发至接近干燥，再分散在PBS溶液中，离心并通过0.22μm滤膜过滤，即得待测样品溶液。
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Also Published As
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