CN116836804A - 一种植烟土壤微生态环境测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生态环境测定技术领域，具体为一种植烟土壤微生态环境测定方法；本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，首先采用棋盘格式划定取样点，并在每个取样点分层取样，使得所取样的植烟土壤能够全面、可靠的进行后续的测定，然后对土壤样品进行微生物分离和测定和理化性质测定；本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，不仅能够对土壤微生物进行全面评测，而且还能够对土壤各项生化指标进行测定，便于土壤的状况。
Description
技术领域
本发明涉及生态环境测定技术领域，具体为一种植烟土壤微生态环境测定方法。
背景技术
烟草是茄科烟草属的一年生草本植物，叶长圆状披针形、披针形、长圆形或卵形，先端渐尖，基部渐窄成耳状半抱茎，叶柄不明显或成翅状；花序圆锥状，花萼筒状或筒状钟形，裂片三角状披针形，花冠漏斗状，淡黄、淡绿、红或粉红色，基部带黄色；蒴果卵圆形或椭圆形，与宿萼近等长；种子圆形或宽长圆形，褐色；花果期为夏秋季。
土壤是烟草种植的重要载体，为烟草的生长提供水分和养分，同时也是重要的非再生型自然资源。烟草产量、品质和风味与土壤养分关系密切，适宜的土壤养分是烟草优质、高产的重要基础。然而，随着化肥工业的发展，烟草的种植过程中有机肥施用量迅速下降，化肥长期大量施用，导致植烟土壤污染、肥力和有机质严重下降。同时，烟田连作较为严重，而烟草又是忌连作作物，长期连作会引起植烟土壤板结，养分失调，导致烟草对土壤养分的吸收率降低，严重制约烟叶产量和品质的提高，因此需要对土壤机能进行恢复，但在对土壤机能进行恢复前，需要对土壤进行微生态环境的测定。因此，如何有效测定微生态环境已经成为烟草种植业亟待解决的重要问题。
因此，本发明提供一种植烟土壤微生态环境测定方法，用于解决上述所提出的相关技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植烟土壤微生态环境测定方法，本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，不仅能够对土壤微生物进行全面评测，而且还能够对土壤各项生化指标进行测定，便于土壤的状况。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种植烟土壤微生态环境测定方法，包括以下步骤：
Ⅰ、对待测定的植烟土壤进行取样；
II、对土壤样品进行微生物分离和测定；
所述微生物分离和测定包括以下步骤：
ⅰ、微生物培养基的选择：牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌，高氏1号培养基培养放线菌，马丁氏培养基培养真菌；
ⅱ、微生物的分离：将采集的土壤样品按取样点和采集深度进行分类，然后按0.1～0.2g/mL的固液比将磨碎的土壤样品置于无菌水中，充分震荡摇匀，并吸取适量的土壤悬浮液加入牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基平板，均匀涂布，细菌37℃培养，真菌和放线菌28℃培养，细菌1d后，真菌、放线菌3～4后观察并挑取不同菌落进一步分离培养，待分离纯化培养完成后，分别测定阳面和阴面不同高度土壤中细菌、真菌和放线菌的数量；
iii、微生物的测定：将细菌进行16SrDNA序列的测定，真菌进行ITS序列的测定，然后在NCBI上将测定的菌株序列信息输入到DNA序列数据库GenBank中，进行BLAST同源性对比分析，与其中已知的菌株序列进行对比，分析其亲缘和进化关系，并用绘制菌株的系统进化树；
III、对土壤样品进行理化性质测定；
所述理化性质包括以下内容：
土壤吸水的测定；
土壤pH值的测定；
土壤有效磷的测定。
本发明进一步的设置为：在所述步骤Ⅰ中取样的过程如下：
在取样区域以棋盘格式划定取样点；
在各取样点分别取四次土壤样品，每次的取样土壤样品重量在1～2kg；
对土壤样品进行信息登记。
本发明进一步的设置为：所述四次土壤样品的取样深度分别为0～10cm、10～20cm、20～40cm以及40～60cm。
本发明进一步的设置为：所述步骤III中的土壤吸水的测定的过程如下：
A、取适量的土壤样品，将其风干后，过2毫米筛，然后置于已知重量的容器中，用天平称取重量；
B、再将容器盖套置在容器上，放进烘箱，于102～110℃温度下烘6h，取出后，冷却至室温，再称重；
C、重复步骤B，至重量不在变化为止，计算土壤吸水。
本发明进一步的设置为：所述步骤C中的计算土壤吸水的公式为：式中，h1为风干土壤样品和容器的重量之和(g)，h2为烘干土壤样品和容器的重量之和(g)，H为容器的重量(g)。
本发明进一步的设置为：所述步骤III中的土壤pH值的测定的过程如下：
取适量的土壤样品，将其风干后，按0.4g/mL的固液比将土壤样品溶于蒸馏水中；
再于转速为200～300r/min的条件下搅拌混合4～5min后，静止30min，用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值。
本发明进一步的设置为：所述步骤III中的土壤有效磷的测定的过程如下：
a、取适量的土壤样品，将其风干后，按0.05g/mL的固液比将土壤样品充分溶解在碳酸氢钠溶液中，得到试样溶液，再不加入土壤样品，制备得到空白溶液备用；
b、分别取含磷0.00mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.40mg/L、0.60mg/L、0.80mg/L、1.00mg/L、1.20mg/L的磷标准系列溶液，于30℃条件下静置40min后，用1cm光径比色皿在波长880nm处，以标准溶液的零点凋零后进行比色测定，绘制标准缺陷；
c、吸取试样溶液，按2:1的体积比加入钼锑抗显色剂，缓慢摇动后将与试样溶液等体积的去离子水倒入，摇匀后，于30℃的室温环境中放置40min，然后用1cm光径比色皿在波长880nm处，以标准溶液零点凋零后进行比色测定，同时进行空白溶液的测定，并计算土壤中有效磷含量。
本发明进一步的设置为：在所述步骤c中的计算土壤中有效磷含量的公式为：P有效磷＝[(α-α1)×V×D/(m×1000)]×1000，式中，α为以标准曲线为基础，计算出的显色液内磷的浓度，α1为以标准曲线为基础，计算出的空白试样内磷的浓度(mg/L)，V为显色液体积(mL)，D为分取倍数，试样溶液与分取体积之比，m为土壤样品质量(g)。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，首先采用棋盘格式划定取样点，并在每个取样点分层取样，使得所取样的植烟土壤能够全面、可靠的进行后续的测定，然后对土壤样品进行微生物分离和测定和理化性质测定；本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，不仅能够对土壤微生物进行全面评测，而且还能够对土壤各项生化指标进行测定，便于土壤的状况，具有更广阔的市场前景，更适宜推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种植烟土壤微生态环境测定方法的流程图；
图2为本发明一种植烟土壤微生态环境测定方法中微生物分离和测定的流程图；
图3为本发明一种植烟土壤微生态环境测定方法中土壤pH值的测定的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
如图1～图3所示，本发明提供了一种植烟土壤微生态环境测定方法，包括以下步骤：
Ⅰ、对待测定的植烟土壤进行取样。
其中，取样的过程如下：
在取样区域以棋盘格式划定取样点；
在各取样点分别取四次土壤样品，每次的取样土壤样品重量在1～2kg；
对土壤样品进行信息登记。
进一步的，四次土壤样品的取样深度分别为0～10cm、10～20cm、20～40cm以及40～60cm。
在本实施例中，需要说明的是，土壤样品的采集作为最基础的步骤，往往没到受到重视，技术不标准，不到位，继而影响测定植烟土壤微生态环境测定准确性，本发明采用棋盘格式划定取样点，并在每个取样点分层取样，使得所取样的植烟土壤能够全面、可靠的进行后续的测定，在本实施例中，信息登记包括但不限于取样点位置、深度、取样人等信息。
II、对土壤样品进行微生物分离和测定。
所述微生物分离和测定包括以下步骤：
ⅰ、微生物培养基的选择：牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌，高氏1号培养基培养放线菌，马丁氏培养基培养真菌；
ⅱ、微生物的分离：将采集的土壤样品按取样点和采集深度进行分类，然后按0.1～0.2g/mL的固液比将磨碎的土壤样品置于无菌水中，充分震荡摇匀，并吸取适量的土壤悬浮液加入牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基平板，均匀涂布，细菌37℃培养，真菌和放线菌28℃培养，细菌1d后，真菌、放线菌3～4后观察并挑取不同菌落进一步分离培养，待分离纯化培养完成后，分别测定阳面和阴面不同高度土壤中细菌、真菌和放线菌的数量；
iii、微生物的测定：将细菌进行16SrDNA序列的测定，真菌进行ITS序列的测定，然后在NCBI上将测定的菌株序列信息输入到DNA序列数据库GenBank中，进行BLAST同源性对比分析，与其中已知的菌株序列进行对比，分析其亲缘和进化关系，并用绘制菌株的系统进化树。
在本实施例中，需要说明的是，牛肉膏蛋白胨培养基：3.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0gNaCl、15～25g琼脂、1000ml水，ph＝7.4～7.6；高氏1号培养基培：20g可溶性淀粉、1gKNO3、0.5gK2HPO4、0,5gMgSO4·7H2O、0.5gNaCl、0.01gFeSO4·7H2O、20g琼脂，pH＝7.4～7.6；马丁氏培养基：1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、5g蛋白胨、10g葡萄糖15～20g琼脂、1000ml水。牛肉膏蛋白胨培养基是一种广泛应用于培养细菌的培养基，其中的牛肉膏为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供细菌生长所需的无机盐成分，高氏一号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基，其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。土壤微生物对于植物激素具有响应，研究土壤微生物可以从侧面反映出植物生长的状况。由于土壤微生物在维持烟草生产力、养分循环和土壤CO2排放方面发挥着至关重要的作用，因此测定土壤微生物群落对于烟草植被生长具有重要意义。
III、对土壤样品进行理化性质测定；
所述理化性质包括以下内容：
土壤吸水的测定；
土壤pH值的测定；
土壤有效磷的测定。
其中，土壤pH值的测定的过程如下：
取适量的土壤样品，将其风干后，按0.4g/mL的固液比将土壤样品溶于蒸馏水中；
再于转速为200～300r/min的条件下搅拌混合4～5min后，静止30min，用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值。
土壤有效磷的测定的过程如下：
a、取适量的土壤样品，将其风干后，按0.05g/mL的固液比将土壤样品充分溶解在碳酸氢钠溶液中，得到试样溶液，再不加入土壤样品，制备得到空白溶液备用；
b、分别取含磷0.00mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.40mg/L、0.60mg/L、0.80mg/L、1.00mg/L、1.20mg/L的磷标准系列溶液，于30℃条件下静置40min后，用1cm光径比色皿在波长880nm处，以标准溶液的零点凋零后进行比色测定，绘制标准缺陷；
c、吸取试样溶液，按2:1的体积比加入钼锑抗显色剂，缓慢摇动后将与试样溶液等体积的去离子水倒入，摇匀后，于30℃的室温环境中放置40min，然后用1cm光径比色皿在波长880nm处，以标准溶液零点凋零后进行比色测定，同时进行空白溶液的测定，并计算土壤中有效磷含量。
进一步的，计算土壤中有效磷含量的公式为：P有效磷＝[(α-α1)×V×D/(m×1000)]×1000，式中，α为以标准曲线为基础，计算出的显色液内磷的浓度，α1为以标准曲线为基础，计算出的空白试样内磷的浓度(mg/L)，V为显色液体积(mL)，D为分取倍数，试样溶液与分取体积之比，m为土壤样品质量(g)。
在本实施例中，需要说明的是，土壤水吸力是反映土壤水分能态的指标，它是在水分随一定土壤吸力状况下的水分能量状态，以土壤对水的吸力来表示。植物从土壤中吸水，必须以更大的吸力来克服土壤对水的吸力，因此土壤水吸力可以直接反映土壤的供水能力以及土壤水分的运动，测定土壤水吸力是控制土壤水分状况，调节植物吸收水分和养分的一种重要手段；土壤ph值是指土壤中氢离子浓度的大小，它对植物的生长和发育有重要的影响，不同的植物对土壤ph值的要求也不同，因此了解土壤ph值的情况对于合理种植植物、提高产量是非常重要的；植烟土壤当中磷元素含量通常由土壤有效磷测定含量代表，土壤有效磷的含量参数属于土壤肥力参数，是研制测土配方施肥方案的重要组成参数要素。本发明能够对植烟土壤当中磷元素含量测定，具有效率高、测定准确性高的特点。
本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法，不仅能够对土壤微生物进行全面评测，而且还能够对土壤各项生化指标进行测定，便于土壤的状况。由此表明本发明所提供的植烟土壤微生态环境测定方法具有更广阔的市场前景，更适宜推广。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (8)
1.一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
Ⅰ、对待测定的植烟土壤进行取样；
II、对土壤样品进行微生物分离和测定；
所述微生物分离和测定包括以下步骤：
ⅰ、微生物培养基的选择：牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌，高氏1号培养基培养放线菌，马丁氏培养基培养真菌；
ⅱ、微生物的分离：将采集的土壤样品按取样点和采集深度进行分类，然后按0.1～0.2g/mL的固液比将磨碎的土壤样品置于无菌水中，充分震荡摇匀，并吸取适量的土壤悬浮液加入牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基、马丁氏培养基平板，均匀涂布，细菌37℃培养，真菌和放线菌28℃培养，细菌1d后，真菌、放线菌3～4后观察并挑取不同菌落进一步分离培养，待分离纯化培养完成后，分别测定阳面和阴面不同高度土壤中细菌、真菌和放线菌的数量；
iii、微生物的测定：将细菌进行16SrDNA序列的测定，真菌进行ITS序列的测定，然后在NCBI上将测定的菌株序列信息输入到DNA序列数据库GenBank中，进行BLAST同源性对比分析，与其中已知的菌株序列进行对比，分析其亲缘和进化关系，并用绘制菌株的系统进化树；
III、对土壤样品进行理化性质测定；
所述理化性质包括以下内容：
土壤吸水的测定；
土壤pH值的测定；
土壤有效磷的测定。
2.根据权利要求1中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：在所述步骤Ⅰ中取样的过程如下：
在取样区域以棋盘格式划定取样点；
在各取样点分别取四次土壤样品，每次的取样土壤样品重量在1～2kg；
对土壤样品进行信息登记。
3.根据权利要求2中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：所述四次土壤样品的取样深度分别为0～10cm、10～20cm、20～40cm以及40～60cm。
4.根据权利要求1中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：所述步骤III中的土壤吸水的测定的过程如下：
A、取适量的土壤样品，将其风干后，过2毫米筛，然后置于已知重量的容器中，用天平称取重量；
B、再将容器盖套置在容器上，放进烘箱，于102～110℃温度下烘6h，取出后，冷却至室温，再称重；
C、重复步骤B，至重量不在变化为止，计算土壤吸水。
5.根据权利要求4中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：所述步骤C中的计算土壤吸水的公式为：式中，h1为风干土壤样品和容器的重量之和(g)，h2为烘干土壤样品和容器的重量之和(g)，H为容器的重量(g)。
6.根据权利要求1中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：所述步骤III中的土壤pH值的测定的过程如下：
取适量的土壤样品，将其风干后，按0.4g/mL的固液比将土壤样品溶于蒸馏水中；
再于转速为200～300r/min的条件下搅拌混合4～5min后，静止30min，用PHS-3C型精密酸度计直接测定土壤水溶液pH值。
7.根据权利要求1中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：所述步骤III中的土壤有效磷的测定的过程如下：
a、取适量的土壤样品，将其风干后，按0.05g/mL的固液比将土壤样品充分溶解在碳酸氢钠溶液中，得到试样溶液，再不加入土壤样品，制备得到空白溶液备用；
b、分别取含磷0.00mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.40mg/L、0.60mg/L、0.80mg/L、1.00mg/L、1.20mg/L的磷标准系列溶液，于30℃条件下静置40min后，用1cm光径比色皿在波长880nm处，以标准溶液的零点凋零后进行比色测定，绘制标准缺陷；
c、吸取试样溶液，按2:1的体积比加入钼锑抗显色剂，缓慢摇动后将与试样溶液等体积的去离子水倒入，摇匀后，于30℃的室温环境中放置40min，然后用1cm光径比色皿在波长880nm处，以标准溶液零点凋零后进行比色测定，同时进行空白溶液的测定，并计算土壤中有效磷含量。
8.根据权利要求7中所述的一种植烟土壤微生态环境测定方法，其特征在于：在所述步骤c中的计算土壤中有效磷含量的公式为：P有效磷＝[(α-α1)×V×D/(m×1000)]×1000，式中，α为以标准曲线为基础，计算出的显色液内磷的浓度，α1为以标准曲线为基础，计算出的空白试样内磷的浓度(mg/L)，V为显色液体积(mL)，D为分取倍数，试样溶液与分取体积之比，m为土壤样品质量(g)。
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