CN116813738A - GmNAC120基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种GmNAC120基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，属于基因调控技术领域。本发明发现GmNAC120基因可作为一个负调控因子参与大豆根对盐胁迫的响应，通过耐盐性检测发现，其有效降低了大豆根对盐胁迫的耐受性；通过生理数据进一步发现，GmNAC120基因在提高大豆耐盐性时，表现为降低盐胁迫后大豆的丙二醛含量但提高超氧化物歧化酶含量，提高盐胁迫下大豆的存活率，增加盐胁迫下大豆的根长。该发现的获得对于研究大豆根盐胁迫应答分子机理，通过RNAi方法培育耐盐大豆新品种拓展了有效解决途径。
Description
技术领域
本发明属于基因调控技术领域，尤其涉及到一种GmNAC120基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用。
背景技术
当前，国内的大豆供求关系非常紧张，产量不足的问题非常明显，而且对进口的需求很大。为此，利用盐碱地，提高耕地的使用效益、缓解大豆供应紧张等问题具有重要的意义。将传统的育种手段与现代的基因工程技术有机地融合在一起，培育抗逆大豆品种，以提高大豆的抗盐能力，是当前我国大豆生产中亟待解决的问题。
转录因子也称反式作用因子，是一类与靶基因启动子特定区域结合进而调控下游基因转录翻译的蛋白质。随着转录因子在植物的生长发育、体内次生物质的合成、逆境应答等诸多生理活动中的作用逐渐被发现，植物的抗逆机制也得到了进一步的研究。
NAC类转录因子的名称来源于矮牵牛中NAM基因、拟南芥中ATAF1/2及CUC基因。有多种研究表明，NAC转录因子在在植物生长发育中其重要作用，包括植物分生组织的细胞分裂、侧根的生长、开花、衰老等过程中发挥着重要的调控功能，还在植物对低温、盐碱等逆境的响应中发挥着关键的调控作用，但对于大豆而言对其机制的研究还很少。
发明内容
本发明提供了一种GmNAC120基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，抑制GmNAC120基因可提高大豆的耐盐性，表现为降低盐胁迫后大豆的丙二醛含量但提高SOD含量，提高盐胁迫下大豆的存活率，增加盐胁迫下大豆的根长。
为了达到上述目的，本发明提供了一种GmNAC120基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
作为优选，由上述核苷酸编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
作为优选，在负调控大豆盐胁迫应答中，能够增加盐胁迫下大豆的根长和存活率。
本发明提供了一种制备耐盐胁迫大豆的方法，通过对GmNAC120基因的编码区进行基因RNAi抑制，致使GmNAC120基因功能丧失，从而获得耐盐大豆植物，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
本发明提供了一种抑制GmNAC120基因的RNAi载体在制备耐盐大豆中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明发现GmNAC120基因可作为一个负调控因子参与大豆根对盐胁迫的响应，通过耐盐性检测发现，过表达GmNAC120基因有效降低了大豆根对盐胁迫的耐受性；通过生理数据进一步发现，抑制GmNAC120基因在提高大豆耐盐性时，表现为降低盐胁迫后大豆的丙二醛含量但提高SOD含量，提高盐胁迫下大豆的存活率，增加盐胁迫下大豆的根长。该发现的获得对于研究大豆根盐胁迫应答分子机理，通过RNAi方法培育耐盐大豆新品种拓展了有效解决途径。
附图说明
图1为本发明实施例提供的GmNAC120基因克隆，其中：M：DL2000marker；1.GmNAC120基因；
图2为本发明实施例提供的GmNAC120-pEGAD、GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301转农杆菌k599 PCR鉴定，其中：M：DL2000maker；a：GmNAC120-pEGAD转K599农杆菌PCR鉴定，1-6GmNAC120-pEGAD-K599；b：GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301转K599农杆菌PCR鉴定，1-6GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301-K599；
图3为本发明实施例提供的qPCR检测转基因复合体大豆中GmNAC120的转录水平；“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01；
图4为本发明实施例提供的转基因复合体大豆盐胁迫后表型鉴定，其中：白色纸条代表2厘米标尺；a：转基因复合体大豆盐胁迫后水培表型鉴定；b：转基因复合体大豆盐胁迫后土培表型鉴定；c：转基因复合体大豆盐胁迫后根长增长量；d：转基因复合体大豆存活率测定；“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01；
图5为本发明实施例提供的GmNAC120转基因大豆毛状根中丙二醛
(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量测定，其中：a：盐胁迫后大豆毛状根MDA含量测定；b：盐胁迫后大豆毛状根SOD含量测定；“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 GmNAC120基因克隆
大豆盆栽(营养土：蛭石＝1：1)长出子叶后转移至水培，长出三出复叶后取根于液氮中研磨，使用TRIzol试剂盒提取大豆根的RNA，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA，使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA。
通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得GmNAC120(Glyma.16G016600.1)基因全长序列，用DNAMan软件设计特异性引物GmNAC120-F：5'-ATGGATGATATTGTAGGATACGG-3'和GmNAC120-R：5'-CTACATGCGATACTGCATTGTT-3'。
以合成的cDNA为模板，采用RT-PCR方法扩增GmNAC120基因的开放阅读框(ORF)。PCR反应体系：cDNA 1μL，Primer-F 2μL，Primer-R 2μL，dNTPs 5μL，TransStart Taq DNApolymerase 0.5μL，10×PCR buffer 5μL，无酶水34.5μL。
PCR扩增程序:94℃、5min；94℃、30s，58℃、30s，72℃、80s(35个循环)；72℃、10min。使用DNA纯化回收试剂盒回收扩增产物，使用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用紫外凝胶成像仪(Bio-Rad)成像。将GmNAC120基因扩增产物连接至pMD19-T载体上并转化大肠杆菌DH5α感受态，以菌液为模板进行PCR鉴定后送上海生工生物工程股份有限公司测序，从测序正确的菌液中提取质粒并置于-20℃保存。
经电泳检测，使用特异性引物GmNAC120-F与GmNAC120-R从大豆cDNA中扩增出1296bp核苷酸序列(图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，由其编码的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。测序和序列比对结果显示，该序列为GmNAC120基因序列，说明成功克隆出GmNAC120基因。
实施例2 GmNAC120植物表达载体构建
1、GmNAC120过表达载体构建
分析pEGAD载体序列与GmNAC120的酶切位点，选用正向Sma I、反向Bam HI酶切位点，选用增加相应酶切位点的方法扩增序列，GmNAC120引物(均在上海生工生物工程股份有限公司合成)为：
nGmNAC120-256F:5'-TATCCCGGGATGGATGATATTGTAGGATACGG-3'；
nGmNAC120-256R:5'-AAAGGATCCCTACATGCGATACTGCATTGTT-3'。
PCR反应体系：GmNAC120-pMD19-T质粒0.2μL，Primer-F 2μL，Primer-R 2μL，dNTPs5μL，TransStart Taq DNA polymerase 0.5μL，10×PCR buffer 5μL，无酶水35.3μL。
PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃80s，35个循环，72℃10min。
PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后使用天根DNA产物回收试剂盒进行纯化回收，与pEGAD质粒同时双酶切，酶切体系：
GmNAC120 PCR产物或pEGAD质粒10μL，Sma I 2μL，Bam HI 2μL，10×buffer 5μL，无酶水31μL，酶切反应条件：37℃酶切2.5h。
酶切结束后，将上述酶切产物使用天根DNA产物回收试剂盒进行纯化回收，用T4连接酶进行连接。
连接体系：GmNAC120双酶切产物10μL，pEGAD质粒双酶切产物5μL，T4 DNA ligase1μL，T4 ligation buffer 2μL，无酶水2μL。反应条件：22℃连接3-4h。
将10μL连接产物与100μL DH5α大肠杆菌感受态在紫外超净工作台中轻轻混匀，放置冰上静置30min后放入42℃水浴锅90s，迅速置于冰中静置3min，加入600μL无抗生素的液体LB中，放入37℃、220rpm/min培养箱中小摇45min，随后放入离心机中4000rpm/min离心2min，吸取500μL上清液弃去，剩余液体涂布在含有Amp抗生素的固体培养基中，放入37℃培养箱中过夜培养。
挑取单克隆菌斑加入800μL含有卡那霉素抗生素的液体培养基放入37℃、220rpm/min培养箱中小摇6-7h，吸取1μL菌液当模板，引物为载体通用引物，反应体系及反应程序如前述。通过菌液PCR鉴定无误后，将阳性克隆送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。
将测序结果与基因序列进行比对，比对正确后通过质粒小提试剂盒提取质粒，步骤参考试剂盒说明书。质粒提取成功后放入-20℃保存。
测序结果表明：GmNAC120-pEGAD过表达的植物表达载体构建完成。
2、GmNAC120抑制表达载体构建
从GmNAC120基因开放阅读框序列中挑选长度为22bp的片段作为RNAi片段。分析GmNAC120-RNAi片段和pCAMBIA3301载体的酶切位点，选用正向Nco I、反向Bgl II酶切位点，选用增加相应酶切位点的方法人工合成序列。
GmNAC120-RNAiF：
5'-CATGCCACTCGGAGGAGATGGATAAATTCAAGAGATTTATCCATCTCCTCCGAGTGG-3'；
GmNAC120-RNAiR：
5'-GATCCCACTCGGAGGAGATGGATAAATCTCTTGAATTTATCCATCTCCTCCGAGTGG-3'。
通过寡核苷酸退火合成基因，反应体系：10×PCR buffer 5μL，GmNAC120-RNAi-F10μL，GmNAC120-RNAi-R 10μL，无酶水25μL。
反应程序：95℃5min，75℃10min，65℃10min，55℃10min。
将寡核苷酸退火产物PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳，鉴定正确后使用天根DNA产物回收试剂盒进行纯化回收。pCAMBIA3301质粒进行双酶切，连接，转化，菌液PCR检测。测序结果表明GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301抑制载体构建完成。
实施例2 GmNAC120转化大豆毛状根
1、重组质粒转化发根农杆菌K599
将GmNAC120-pEGAD过表达载体及GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301抑制表达载体的重组质粒转化发根农杆菌K599。
发根农杆菌感受态制备：
1)从K599农杆菌的划线平板中挑一个单克隆放入到带链霉素抗性的1mL液体LB培养基中，在28℃、220rpm/min的培养箱中过夜培养；
2)用移液枪吸取200μL过夜培养的菌液加入到20mL LB液体培养基中，另外加入20μL的链霉素，在28℃、220rpm/min的培养箱中培养至OD600值为0.6-0.8，立即冰浴30min；
3)使用低温冷冻离心机离心菌液，4℃、4000rpm/min离心5min，弃去上层清液；
4)加入2mL 20mM的30％甘油氯化钙(CaCl2)重悬菌体在冰上缓慢吹打混匀；
5)将混合菌液用移液枪分装到1.5mL离心管中，每支离心管分装200μL感受态细胞，转移至液氮速冻，置于-80℃保存备用。
重组质粒转化发根农杆菌K599：
1)向200μL冰浴解冻后的装有K599感受态细胞的离心管中加入10μL的重组质粒，轻轻用移液枪转动，使质粒与感受态细胞充分接触，冰浴30min，上面过程均需在紫外灭菌过后的超净工作台中进行。
2)液氮速冻离心管8min，迅速将离心管转移到37℃的水浴锅中孵育5min。
3)继续冰浴5min后，加入600μL的LB液体培养基，放入28℃、220rpm/min的培养箱培养3-4h。
4)放入离心机中4000rpm/min离心2min后，弃去部分上清液，接着吹打混匀后吸取250μL菌液涂布于含有Kan和Str抗生素的LB固体培养基平板上，放入28℃培养箱倒置培养2-3d观察菌斑生长情况。挑取单克隆菌斑，用载体的上游引物和下游引物进行PCR鉴定。
2、GmNAC120大豆毛状根转化
1)利用发根农杆菌实验，转化大豆毛状根。选取个头接近且无损坏的大豆种子Williams 82，播种在混合土中(营养土：蛭石＝1：1，1-2cm深)，置于24-26℃的生长室生长6-7d，至其苗高4-5cm。
2)截取大豆双子叶以下4cm处，用蒸馏水洗去上面的泥土。再用小枪头在大豆子叶节处及每隔1.5cm处扎孔，刮取提前划好线的农杆菌反复填充扎孔处，为提高转化效率可在次日再次填充菌落。
3)将侵染过的大豆幼苗置于保湿系统中培养，待毛状根长到5-6cm左右即可转移到水培盆或者土培盆中继续生长7-14d后，观察生长情况。
3、GmNAC120大豆复合体植株鉴定
1)基因组水平鉴定：使用植物基因组DNA提取试剂盒，提取GmNAC120-pEGAD、GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301和K599转基因大豆毛状根的DNA，具体步骤参考试剂盒说明书。DNA提取成功后用pEGAD、pCAMBIA3301通用引物进行转基因毛状根的PCR鉴定，反应体系及反应程序如前所述。
将构建成功的GmNAC120-pEGAD、GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301重组质粒转入发根农杆菌K599感受态中，并通过菌液PCR鉴定，鉴定结果表明GmNAC120-pEGAD和GmNAC120-RNAi重组质粒成功转入发根农杆菌K599中。
利用发根农杆菌实验，转化大豆毛状根。将侵染过的大豆幼苗置于保湿系统中培养，待毛状根长到5-6cm左右将其转移到水培盆中继续生长7-14d后，观察生长情况。待根长长至8-10cm后，提取转基因毛状根DNA，用载体通用引物进行PCR鉴定(图2a-b所示)。
2)转录水平鉴定：从GmNAC120-pEGAD、GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301、K599空载体转基因大豆毛状根中用TRIzol试剂提取RNA，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测RNA，随后使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒反转录成cDNA，步骤参照试剂盒说明书，稀释cDNA浓度后，通过在线软件设计qPCR定量引物，GmNAC120荧光定量引物为qGm120-F和qGm120-R，其引物序列如下：
qGm120-F：5'-CCCCAACACAACAGTTTCAAAT-3'
qGm120-R：5'-CGCATCTTCCTCCTTAGTTTCAAAT-3'
以CYP2为内参基因，使用qPCR试剂盒进行完成qPCR检测，反应体系及程序如下，并设置三个生物学重复进行统计学分析。
qPCR反应体系：cDNA 2μL，Primer-F 0.4μL，Primer-R 0.4μL，2×TransStart TipGreen qPCR SuperMix 10μL，Passive Reference Dye(50×)
0.4μL，无酶水6.8μL
qPCR反应程序：95℃30s，95℃5s 40-45循环，60℃30s。
结果表明，过表达GmNAC120复合大豆毛状根中的相对表达量显著高于对照植株，而抑制表达GmNAC120复合大豆毛状根中的相对表达量低于对照植株。综上结果说明，GmNAC120-pEGAD、GmNAC120-RNAi-3301植物表达载体已成功转入大豆毛状根中并能够在大豆毛状根中实现过表达和抑制GmNAC120(如图3所示)。
实施例3 GmNAC120转基因复合体大豆盐胁迫表型鉴定
将鉴定正确的GmNAC120-pEGAD、GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301转基因的大豆复合体植株及K599空载体大豆复合体植株分别取10株大小形态相近的植株放入含有250mMNaCl的胁迫液中，进行盐胁迫48h，期间观察表型变化，并统计存活率。在胁迫前和胁迫48h拍摄照片记录，每个单株在胁迫前和胁迫后的3-4d通过根系扫描仪测定根长。盐胁迫实验需进行三次以上的生物学重复，并进行数据分析。
将GmNAC120-pEGAD转基因复合体大豆、GmNAC120-RNAi-pCAMBIA3301转基因复合体大豆与对照K599复合体大豆分别进行250mM NaCl水胁迫和土培胁迫，期间观察表型变化。水培胁迫在胁迫前以及胁迫48h拍摄记录(图4a)，土培胁迫在胁迫前以及胁迫7d拍摄记录(图4b)。每个单株在胁迫前和胁迫后的3-4d通过根系扫描仪测定根长并进行数据分析(图4c)，统计存活率(图4d)。
通过表型可以看出，过表达GmNAC120的复合体大豆比对照组K599复合体大豆的叶片卷曲程度高，且复叶萎蔫程度和叶片水分散失程度高。而抑制GmNAC120的复合体大豆对比对照组K599复合体大豆的叶片只有少部分叶片卷曲，且复叶萎蔫程度和叶片水分散失程度低。过表达GmNAC120复合体大豆比对照组K599复合体大豆的根系褐化严重，而抑制GmNAC120的复合体大豆对比对照组K599复合体大豆的根系褐化程度较低。通过在盐胁迫下的根长增长量发现，过表达GmNAC120的复合体大豆比对照组K599复合体大豆根平均增长率低6.06％，而抑制GmNAC120的复合体大豆对比对照组K599复合体大豆平均根增长率高3.71％。统计胁迫后大豆存活率，过表达GmNAC120的复合体大豆存活率为34.4％，对照组K599复合体大豆存活率为47.7％，抑制GmNAC120的复合体大豆存活率为64.4％。
实施例4 GmNAC120转基因大豆毛状根中丙二醛和超氧化物歧化酶含量测定
将GmNAC120转基因大豆毛状根与对照组K599大豆毛状根进行250mM NaCl胁迫24h后，取大豆毛状根组织，每株各取0.1g大豆毛状根组织。使用南京建成生物提供的试剂盒进行丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量检测，步骤参照试剂盒说明书，设置三个生物学重复。结果表明，过表达GmNAC120的大豆毛状根中MDA含量在胁迫后显著高于对照植株K599，抑制GmNAC120表达的大豆毛状根中MDA含量在胁迫后显著低于对照植株K599。过表达GmNAC120的大豆毛状根中SOD含量在胁迫后显著低于对照植株K599，抑制GmNAC120表达的大豆毛状根中SOD含量在胁迫后显著高于对照植株K599。这表明抑制GmNAC120表达能够在盐胁迫下减少MDA含量并提高SOD含量，进而增加大豆的耐盐性(如图5所示)。
Claims (5)
1.GmNAC120基因在负调控大豆盐胁迫应答中的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，由上述核苷酸编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在负调控大豆盐胁迫应答中，能够增加盐胁迫下大豆的根长和存活率。
4.一种制备耐盐胁迫大豆的方法，其特征在于，通过对GmNAC120基因的编码区进行基因RNAi抑制，致使GmNAC120基因功能丧失，从而获得耐盐大豆植物，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。
5.抑制GmNAC120基因的RNAi载体在制备耐盐大豆中的应用，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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