CN116804170A - 一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其制备方法，涉及烟草黑胫病防治技术领域，解决了现有技术中采用化学农药防控烟草黑胫病，存在农药残留及环境污染的技术问题。该制备方法包括如下步骤：以假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116为菌种，将菌种进行活化；将假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116菌种进行培养，得假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116一级种子液；将假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116一级种子液进行培养，得假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116二级种子液；将假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116二级种子液进行培养，得假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116发酵液，假浅灰链霉菌YWF‑21‑2116发酵液即为防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂。本发明的菌剂菌剂，不仅可对烟草土传病害黑胫病进行有效防控，避免农业生产中因药剂选择错误而延误前期防控的黄金时期。
Description
本发明为原申请号为202211163574.1、原申请日为2022年09月23日、原发明名称为“一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及烟草黑胫病防治技术领域，尤其涉及一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其制备方法。
背景技术
放线菌是一类极其丰富的微生物资源，能有效控制植物病害的放线菌主要是链霉菌属，放线菌的孢子具有极强的抗逆性，可产生多种抗生素。放线菌一般通过两种途径对致病菌发挥生防作用，一方面，放线菌能够在寄主植物组织内诱发抑菌物质的产生或者产生抗性影响病原菌的生长、繁殖，最后导致致病菌死亡，同时放线菌的某些代谢物质还可促进植物生长，从而有效的错开了致病菌对寄主植物的最适侵染时期而达到防病效果。另一方面，放线菌可以通过抗生作用、竞争作用降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种菌体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降，从而达到防治的效果。
烟草病害的综合防治一直是烟叶生产中的重要环节，长期以来化学防治在烟草病害防治策略中占据非常重要的地位。烟草生产上化学农药的大量和长期连续使用以及使用技术的不合理，使得烟草根黑腐病菌产生抗药性，加重使用农药对环境的污染，生态系统的破坏，同时也直接影响烟叶品质。在克服植物病害的抗药性、減少化学杀菌剂对环境的污染、生态的破坏及农副产品中化学农药的残留方面，生防微生物具有独特的优势，利用放线菌制备的生物农药，具有无污染、无残留、不易使有害生物产生抗药性、与环境相容性高、对人畜安全等特点，已成为无公害绿色农药的主体和未来农药的发展方向。因此，大力开展生防微生物的生物防治研究是农业可持续发展的重要途径，具有重要的生产实际意义。
发明内容
本发明的目的是提出一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其应用，解决了现有技术中采用化学农药防控烟草黑胫病，存在农药残留及环境污染的技术问题。本发明优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。
为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂，是以假浅灰链霉菌为菌种，并经种子活化和至少三级培养后制得的假浅灰链霉菌发酵液。
本发明的假浅灰链霉菌(Streptomyces pseudogriseolus)YWF-21-2116，保藏登记号为CCTCC NO：M 20221096，保藏日期2022年07月12日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉。
根据一个优选实施方式，发酵液中假浅灰链霉菌的有效活菌数不小于8×109cfu/ml。
本发明所述的防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂在烟草种植中的应用。
根据一个优选实施方式，所述菌剂通过蘸根、灌根、浇施、穴施中的一种或多种方法向烟草施用。
根据一个优选实施方式，在烟草移栽期后7天和旺长期后7天施加所述菌剂。
根据一个优选实施方式，所述菌剂与育苗基质配伍制成功能育苗基质进行使用。
根据一个优选实施方式，所述菌剂与育苗基质按照重量比为5～8∶1000的比例进行混配，混合均匀后用于烟草的育苗。
根据一个优选实施方式，所述菌剂与肥料配伍制成生物肥料进行使用。
根据一个优选实施方式，所述菌剂与有机肥料按照重量比为4～7∶1000的比例进行混配，混合均匀后作为基肥，在烟草移栽时进行使用。本发明防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其应用至少具有如下有益技术效果：
本发明防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂，是以假浅灰链霉菌为菌种，并经种子活化和至少三级培养后制得的假浅灰链霉菌发酵液，将其用于烟草种植中，可在育苗期就实现黑胫病的有效防控、土壤养分的活化和作物根系的促生，在有效防控病害后增强作物的营养吸收，进一步减少作物因病害导致的产量损失；另一方面，由于本发明防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂可对烟草土传病害黑胫病进行有效防控，能够在很大程度上减少化学农药的施用量，减少环境污染，提高作物安全性，保持土壤微生物群落的平衡，即本发明防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其应用，解决了现有技术中采用化学农药防控烟草黑胫病，存在农药残留及环境污染的技术问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例1中筛选出的菌株对烟草黑胫病病原菌的抑菌活性测试结果图；
图2是假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液对烟草黑胫病抑菌结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法包括如下步骤：
步骤1：以假浅灰链霉菌YWF-21-2116为菌种，将菌种进行活化。具体的，从﹣80℃条件下取出采用甘油保存的假浅灰链霉菌，按照3～5‰的接种量接种在液体高氏一号培养基中，于28～30℃培养24～70h，得活化的假浅灰链霉菌YWF-21-2116种子液。更具体的，液体高氏一号培养基包括以下质量分数计的组分：可溶性淀粉20‰，硝酸钾1.0‰，氯化钠0.5‰，磷酸氢二钾0.5‰，硫酸镁0.5‰，硫酸亚铁0.01‰，余量为水，pH为7.5～8.0。
步骤2：将假浅灰链霉菌YWF-21-2116菌种进行培养，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116一级种子液。具体的，将活化的种子液按5～10％接种量接种到一级种子培养基，在培养温度28～30℃、转速180rpm/min条件下，摇床培养24～70h，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116一级种子液。更具体的，一级种子培养基为液体高氏一号培养基，一级种子培养基包括以下质量分数计的组分：可溶性淀粉20‰，硝酸钾1.0‰，氯化钠0.5‰，磷酸氢二钾0.5‰，硫酸镁0.5‰，硫酸亚铁0.01‰，余量为水，pH为7.5～8.0。
步骤3：将假浅灰链霉菌YWF-21-2116一级种子液进行培养，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116二级种子液。具体的，按照5～10％接种量将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～30℃，转速180rpm/min，通气量为1500L/h，罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养24～70h，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116二级种子液。更具体的，二级种子培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉20～30‰，甘露醇30～35‰，氢氧化钠2～4‰，消泡剂1～2‰，余量为水，pH为7.5～8.0。
步骤4：将假浅灰链霉菌YWF-21-2116二级种子液进行培养，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液，假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液即为防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂。具体的，将二级种子液按5～10％接种量接种到发酵罐内的发酵培养基，在25℃～30℃，转速180rpm/min，通气量为13m3/h、罐压保持在0.06MPa条件下培养70～78h，培养后的发酵液中假浅灰链霉菌YWF-21-2116的有效活菌数不小于8×109cfu/ml时停止发酵，所得发酵液即为假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液；发酵液进行菌剂包装形成产品，即为防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂。更具体的，发酵培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉25～30‰，甘露醇30～40‰，氢氧化钠2～4‰，消泡剂1～2‰，余量为水，pH为7.5～8.0。
下面结合说明书附图1和2以及实施例1～4对本发明防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂及其应用进行详细说明。
实施例1
本实施例对本发明的假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂的室内活性测定说明。
假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂的制备方法参照前述防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法。
采用平板对峙法获得拮抗菌株。用直径5mm的打孔器取烟草黑胫病病原菌菌丝块接种于PDA培养皿中央，采用十字交叉法，在距平板中心3cm处用接种针蘸取菌株。以只接烟草黑胫病病原菌的处理作为对照，将平板放置在28℃恒温培养箱中培养7d，直至对照平板上的病原菌菌丝长到培养基边缘为止，每处理重复3次，选取抑菌圈明显的菌株进行抑菌活性测定。测试结果如图1所示。
室内发酵液拮抗活性检测：采用牛津杯法：将黑胫病原菌接种于PDA培养皿中央，同时在距中心3cm处用0.5cm打孔器进行打孔去除培养基，用移液枪吸取YWF-21-2116的发酵液80μL置于空穴内，以只接病原菌为对照组。将平板置于28℃恒温箱培养7d后观察菌株发酵液是否对烟草黑胫病病原菌有抑制作用，并计算抑菌率，每个处理重复3次。试验结果如图2所示。通过拮抗活性试验发现，假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂对烟草黑胫病病原菌的生长有强烈抑制作用。
实施例2
本实施例提供了一种假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂及其作为菌剂直接施用的方法。
假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂的制备方法参照前述防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法。
2021年在曲靖麒麟区进行小区试验，试验选择在2020年黑胫病发病重的地块进行，烟草品种为K326，分别在移栽期后7天、旺长期后7天进行2次施药，每次间隔一周，处理分别为假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂稀释800倍、93％嘧菌酯稀释800倍为药剂对照，以清水为空白对照，每个处理3次重复，小区随机排列，管理同一般大田。
处理前分别在处理区和对照区以随机10点取样，调查田间病株率。发病高峰期对发病植株进行病情调查，计算发病率药前、药后的病情指数及防治效果。按照GB-T23222-2008烟草病虫害分级及调查方法进行。
病情分级标准如下：
0级：全株无病斑；
1级：病斑面积占整叶面积1％以下；
3级：病斑面积占整叶面积2％-5％；
5级：病斑面积占整叶面积6％-10％；
7级：病斑面积占整叶面积11％-20％；
9级：病斑面积占整叶面积21％以上。
统计结果如下表1和表2所示：
表1植株发病率统计结果表
表2不同处理对黑胫病的防治效果统计结果表
从表1和表2可以看出，小区试验中，假浅灰链霉菌YWF-21-2116制剂稀释800倍使用可降低烟草黑胫病的发病率，与常用的嘧菌酯稀释800倍后的防治效果相当，优于清水对照组，考虑农药残留问题，本申请相比于嘧菌酯具有更好的应用前景。
实施例3
本实施例提供了一种链霉菌菌剂及其与基质进行配伍制成功能育苗基质的使用方法。
本实施例链霉菌菌剂采用假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵后制作而成，其有效活菌数不小于8×109cfu/ml的发酵液。链霉菌菌剂的具体制备方法参照前述防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法。
本实施例链霉菌菌剂可与基质进行配伍制成功能育苗基质进行使用，在育苗阶段进行病害的防控，可以有效减少作物移栽后病害的爆发。
具体使用方法如下：将链霉菌菌剂与育苗基质按照重量比为5～8∶1000的比例进行混配，混合均匀后用于作物的育苗，按照常规育苗方式进行育苗即可。使用本方法得到的作物小苗，在移栽时根系基质土和植株内已具有抗病菌种，移栽后可对烟草黑胫病形成有效防控。移栽后可使用链霉菌菌剂再进行1～2次灌根或者浇施，结合表2和表3可知，将链霉菌菌剂与育苗基质按照重量比为6∶1000的比例进行混配后用于作物的育苗，移栽7天后灌根一次，能够提高防控效果10％左右。
表3不同处理对黑胫病的防治效果统计结果表
实施例4
本实施例提供了一种链霉菌菌剂及其与有机肥料进行配伍制成功能生物有机肥的使用方法。
本实施例链霉菌菌剂采用假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵后制作而成，其有效活菌数不小于8×109cfu/ml的发酵液。链霉菌菌剂的具体制备方法参照前述防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法
本实施例链霉菌菌剂可与有机肥料进行配伍制成功能生物有机肥进行使用，在施用基肥时进入土壤，在作物移栽阶段进行病害的防控，可以有效减少作物移栽后病害的爆发。
具体使用方法如下：将链霉菌菌剂与有机肥料按照重量比为4～7∶1000的比例进行混配，混合均匀后作为基肥，在作物移栽时进行使用。
具体方法为：根据作物需肥特性，在作物移栽时使用本实施例中的生物有机肥作为基肥进行使用，施用量为50～200kg/亩，可采用穴施，条施，沟施等常规基肥施用方法，施用后及时移栽浇水，促使生物有机肥中的芽孢和孢子在潮湿的环境中快速萌发，形成生物防控，其他措施按照常规农事操作即可。按照本方法进行作物种植，在移栽时根系周围土壤中就可以形成抗病菌种的定殖，移栽后可对烟草黑胫病形成有效防控。移栽后可使用链霉菌菌剂再进行1～2次灌根或者浇施，能提高防控效果10％以上。若移栽的作物幼苗为实施例3中的育苗基质培育而成的，可对作物形成全程病害防控。
表4不同处理对黑胫病的防治效果统计结果表
从表2和表4可以看出，链霉菌菌剂与有机肥料按照重量比为6∶1000的比例进行混配作为基肥，在作物移栽7天后灌根一次，防治效果提高20％左右。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
以假浅灰链霉菌YWF-21-2116为菌种，将菌种进行活化；
将假浅灰链霉菌YWF-21-2116菌种进行培养，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116一级种子液；
将假浅灰链霉菌YWF-21-2116一级种子液进行培养，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116二级种子液；
将假浅灰链霉菌YWF-21-2116二级种子液进行培养，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液，假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液即为防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂。
2.根据权利要求1所述的防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，以假浅灰链霉菌YWF-21-2116为菌种，将菌种进行活化包括如下步骤：从﹣80℃条件下取出采用甘油保存的假浅灰链霉菌，按照3～5‰的接种量接种在液体高氏一号培养基中，于28～30℃培养24～70h，得活化的假浅灰链霉菌YWF-21-2116种子液；
将活化的种子液按5～10％接种量接种到一级种子培养基，在培养温度28～30℃、转速180rpm/min条件下，摇床培养24～70h；再按照5～10％接种量将一级种子液转接到种子罐内的二级种子培养基，在28～30℃，转速180rpm/min，通气量为1500L/h，罐压保持在0.04～0.06MPa条件下培养24～70h，得假浅灰链霉菌YWF-21-2116二级种子液；
将二级种子液按5～10％接种量接种到发酵罐内的发酵培养基，在25℃～30℃，转速180rpm/min，通气量为13m3/h、罐压保持在0.06MPa条件下培养70～78h，培养后的发酵液中假浅灰链霉菌YWF-21-2116的有效活菌数不小于8×109cfu/ml时停止发酵，所得发酵液即为假浅灰链霉菌YWF-21-2116发酵液；发酵液进行菌剂包装形成产品。
3.根据权利要求2所述的防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述一级种子培养基为液体高氏一号培养基，所述一级种子培养基包括以下质量分数计的组分：可溶性淀粉20‰，硝酸钾1.0‰，氯化钠0.5‰，磷酸氢二钾0.5‰，硫酸镁0.5‰，硫酸亚铁0.01‰，余量为水，pH为7.5～8.0；
二级种子培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉20～30‰，甘露醇30～35‰，氢氧化钠2～4‰，消泡剂1～2‰，余量为水，pH为7.5～8.0；
发酵培养基包括以下质量分数计的组分：黄豆粉25～30‰，甘露醇30～40‰，氢氧化钠2～4‰，消泡剂1～2‰，余量为水，pH为7.5～8.0。
4.一种防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂，其特征在于，是采用权利要求1至3中任一项所述的防治烟草黑胫病的假浅灰链霉菌菌剂的制备方法制得的。
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