CN116794328A - 一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，涉及医学检验技术领域，其技术要点为：采用双抗体夹心ELISA法，即其中吸附在固相上的抗体用以捕获待测靶蛋白，然后用交联着生物活性酶的抗体，对靶蛋白结合，然后加入酶的底物，通过底物的显色或发光程度，起到检测作用；本发明的方法采用针对包括T181在内的其它升高更强或丰度更高的磷酸化位点(如T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404)的抗体，以提高磷酸化Tau蛋白检测的灵敏度。本发明的多位点联合检测方法，比T181单位点检测方法，可将灵敏度提高到10倍左右，本发明比现有方法有着明显的优越性。

Description

一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。随着人口老龄化，阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)作为老年性痴呆的主要病因，日渐成为社会的主要问题，而目前尚缺乏有效的治疗方法。从根本上控制这一棘手的问题，就是在神经元出现不可再生的死亡前及时发现并予以及时干预，而这有赖于简便有效的大规模筛查，特别是血清检测。

血清磷酸化Tau蛋白检测是目前临床上重要的AD辅助诊断方法之一(1)，目前临床所用的检测方法是基于T181磷酸化位点的检测(国家药品监督管理局，皖械注准20212400388、闽械注准20212400119、粤械注准20212400237、粤械注准20152400855、闽械注准20212400264、湘械注准20212400825)，即Tau蛋白上第181个氨基酸(Threonine，苏氨酸，简称T)(2-4)。该方法仅针对T181这个单一位点进行检测，但实际上Tau蛋白在AD脑组织上被超度磷酸化，有几十个位点都被磷酸化。因此，这种单位点的检测，势必在灵敏度上存在不足的问题。

本申请发明人通过已开展的546例患者(均具有痴呆主诉或已有临床症状)检测结果的回顾性分析，在6例已明确诊断为AD的患者中仅有1例为阳性(阳性率仅为16.7％)，在诊断为认知功能减退(149例)与痴呆(14例)的患者中，阳性率也仅有12.1％与23.7％(预实验结果1)，所以该方法在诊断灵敏性上存在很大的局限性。实际上，AD在所有老年性痴呆的病因中占70％左右，因此临床现行血清T181磷酸化Tau蛋白检测的阳性率与此相去甚远。虽然在血液磷酸化Tau蛋白的检测方法上有很多超灵敏方法的尝试，但都尚未进入临床应用，而且也会因方法特殊、价格昂贵，难以被广泛应用。

虽然AD中Tau蛋白含有较多的磷酸化位点这一事实已被公认，但过去无法知道哪些位点磷酸化程度较强、含量比较丰富。本申请发明人通过质谱技术，在前期工作汇总对近200例人脑组织的超深度蛋白磷酸化分析，不仅发现Tau共有54个位点被磷酸化，还可以定量地分析出各位点的磷酸化强度及丰度，发现目前临床检测所用的T181位点既不是磷酸化程度较高，也不是含量较丰富的位点，而其它位点(如T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404等)才更为突出(如图1)，具有更强的临床应用价值。本申请的发明人的质谱定量分析还发现这些位点并不是同时分布在每个Tau蛋白分子，因此同时利用这些位点进行联合检测，可极大提高磷酸化Tau蛋白的检测灵敏度，使AD通过筛查得以发现成为可能。

为此，本发明提供一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，以解决目前现有技术中磷酸化Tau蛋白检测灵敏度不足的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，包括以下步骤：

S1、阳性参照品配制：

将老年人脑皮层组织按1g/mL裂解于RIPA缓冲液中，得脑组织裂解液；对脑组织裂解液中的Tau蛋白与Aβ进行Western blot与ELISA进行检测，并确认其水平升高，将其作为阳性对照的标本；

S2、抗体特异性鉴定：

将步骤S1中的作为阳性对照的标本的脑组织裂解液用碱性磷酸酶处理，以去除Tau蛋白上的各磷酸化位点，作为阴性对照；

利用重组质粒在细胞中表达Tau蛋白，作为阳性对照；

将经过碱性磷酸酶处理前后的脑组织裂解液、表达Tau蛋白的细胞裂解液和未表达Tau蛋白的细胞裂解液作为蛋白样品，利用各磷酸化Tau蛋白抗体进行Western blot，根据结果中的实际印迹条带与预期目标条带进行对比，以判断各抗体的特异性；

S3、抗体包板：

将步骤S2中的各抗体，即针对包括T181位点在内的T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404位点的磷酸化位点的抗体，在包板缓冲液中配制成10ng/ml，加入ELISA板条各孔中(100μl/孔)，4度过夜后，移去抗体上清；并用TBST(0.05％ Tween-20的Tris盐缓冲液)，清洗各孔至少三次；

S4、封闭：

利用5％的脱脂奶粉，200μl/孔，室温下轻轻水平摇晃半小时；然后，TBST洗板至少三次；

S5、加入待测磷酸化Tau蛋白样品：

将步骤S2中含有磷酸化Tau蛋白的阳性参照，用1％BSA首先进行1:100稀释，然后再3倍系列稀释；分别加入ELISA板条各孔，4度过夜后，移去上清；并用TBST清洗各孔至少三次；

S6、加入酶标检测抗体：

采用生物素化的抗体，将1μg/μL生物素化的抗体首先与亲和素化的HRP结合，然后用含1％脱脂牛奶的TBST作1:1000稀释，加入ELISA板条各孔中；室温下轻轻水平摇晃两小时后，TBST洗板至少三次；

S7、加入底物显色：

加入酶标底物缓冲液，100uL/孔，室温下显色并读取吸光度，对结果进行定量分析。

进一步地，步骤S3中包板缓冲液为50mM NaHCO₃，pH为9.5。

进一步地，步骤S6中生物素化的抗体与亲和素化的HRP结合的比例通过不同浓度配比确定。

在本发明的方案中，采用了双抗体夹心ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay,酶联免疫吸附测定)，即其中吸附在固相上的抗体用以捕获待测靶蛋白，然后用交联着生物活性酶的抗体，对靶蛋白结合，然后加入酶的底物，通过底物的显色或发光程度，起到检测作用。

本发明的方法改变了现有技术中采用仅针对T181位点的抗体进行包板的方法，而是采用针对包括T181在内的其它磷酸化升高更明显、丰度更高的磷酸化位点(如T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404)的抗体，以提高磷酸化Tau蛋白检测的灵敏度。

本发明的方案利用针对这些位点的特异性抗体吸附在ELISA板条上，封闭剩余的吸附位点后，加入待测标本。包被抗体捕获待测样本中含有待测磷酸化位点的Tau蛋白后，进行洗板，去除多余的未结合样本及杂蛋白。然后，加入通过生物素-亲和素交联的Tau蛋白(非磷酸化)抗体与HRP(Horseradish Peroxidase,辣根过氧化物酶)复合物，以与被捕获的磷酸化Tau蛋白结合，再通过加入酶反应底物进行显色，从而起到对磷酸化Tau蛋白的定量检测作用。需要指出的是，本发明中，所选择的检测抗体是针对Tau蛋白非磷酸化区域，而不是针对另外的磷酸化位点，因为这些磷酸化位点并不总是同时存在于Tau蛋白分子上；并且，检测抗体所针对Tau蛋白区域，尽量远离捕获抗体所针对的位点区域，以避免空间位阻问题。实际上，为了最大限度地提高灵敏度，本发明中所使用的检测抗体，采用了三种针对Tau蛋白不同区域的抗体，包括6-18,1-100,189-195,210-230氨基酸序列区间。

与现有技术相比，本方案的有益效果：

本发明的方法与现有技术相比，现有技术在T181单位点检测中，可最终检测到1:27稀释的磷酸化Tau蛋白样品，而本发明的方法为多位点检测方法，可检测到低至1:243稀释的磷酸化Tau蛋白样品；因此，本发明的多位点联合检测方法，比T181单位点检测方法，可将灵敏度提高到10倍左右；本发明的检测方法，无论在原理上，还是在实际效果上，都比现有方法有着明显的优越性。

附图说明

图1是本发明实施例中AD脑组织磷酸蛋白组学分析中检测到的Tau蛋白磷酸化位点及变化程度；

图2是本发明实施例中多位点与T181单位点ELISA法检测磷酸化Tau蛋白的结果比较；

图3是本发明实施例的方法与国际认可的Wako公司的T181单位点检测结果比较。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

实施例：

本实施例发明提供的方案为：一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，双抗体夹心ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,酶联免疫吸附测定)，即其中吸附在固相上的抗体用以捕获待测靶蛋白，然后用交联着生物活性酶的抗体，对靶蛋白结合，然后加入酶的底物，通过底物的显色或发光程度，起到检测作用。该方法采用针对包括T181在内的其它磷酸化升高更明显、丰度更高的磷酸化位点(如T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404)的抗体，以提高磷酸化Tau蛋白检测的灵敏度。利用针对这些位点的特异性抗体吸附在ELISA板条上，封闭剩余的吸附位点后，加入待测标本。包被抗体捕获待测样本中含有待测磷酸化位点的Tau蛋白后，进行洗板，去除多余的未结合样本及杂蛋白。然后，加入通过生物素-亲和素交联的Tau蛋白(非磷酸化)抗体与HRP(HorseradishPeroxidase,辣根过氧化物酶)复合物，以与被捕获的磷酸化Tau蛋白结合，再通过加入酶反应底物进行显色，从而起到对磷酸化Tau蛋白的定量检测作用。具体实施步骤为：

步骤一：阳性参照品配制。由于本发明的该方法是针对Tau蛋白上的多个磷酸化位点进行联合检测，如果直接使用先用临床检测试剂盒中的仅有T181位点被磷酸化的阳性参照，或者自行合成T181被磷酸化的肽段或蛋白作为阳性参照的话，那无法体现本发明基于多位点检测的优越性。因此，本发明实施例通过收集冰冻死亡后遗体捐献的老年人脑皮层组织，将其按1g/mL裂解在RIPA缓冲液(Radioimmunoprecipitation Assay Buffer,25mMTris-HCl,pH 7.6,150mM NaCl,1％ NP-40,0.5％sodium deoxycholate,0.1％ SDS)中。对组织裂解液中的Tau蛋白与Aβ进行Western blot与ELISA进行检测，并确认它们水平升高，以作为阳性对照的标本。

步骤二：抗体特异性鉴定。为了确认本发明实施例所使用的抗体针对Tau蛋白及相应的磷酸化位点，而对未磷酸化的该位点不识别，以保证抗体的特异性。一方面，将上述阳性脑组织裂解液，用碱性磷酸酶处理，以去除Tau蛋白上的各磷酸化位点，作为阴性对照。另一方面，利用重组质粒在细胞中表达Tau蛋白，作为阳性对照。将经过碱性磷酸酶处理前后的脑组织裂解液，及表达Tau蛋白的细胞裂解液与未表达Tau蛋白的细胞裂解液作为蛋白样品，利用各磷酸化Tau蛋白抗体进行Western blot，根据结果中的实际印迹条带与预期目标条带进行对比，以判断各抗体的特异性。

步骤三：抗体包板。将步骤二中的这些抗体，在包板缓冲液(50mM NaHCO3,pH 9.5)中配制成10ng/ml，加入ELISA板条各孔中(100μl/孔)，4度过夜后，移去抗体上清。并用TBST(0.05％ Tween-20的Tris盐缓冲液)，清洗各孔至少三次。合适包板抗体浓度可根据作不同浓度稀释作最后确定。

步骤四：封闭。利用5％的脱脂奶粉(TBST配制)，200μl/孔，室温下轻轻水平摇晃半小时。然后，TBST洗板至少三次。

步骤五：加入待测磷酸化Tau蛋白样品。将前述含有磷酸化Tau蛋白的阳性参照，用1％BSA首先进行1:100稀释(因原始浓度过高)，然后再3倍系列稀释。分别加入ELISA板条各孔(100u/孔)，4度过夜后，移去上清。并用TBST(0.05％ Tween-20的Tris盐缓冲液)，清洗各孔至少三次。

步骤六：加入酶标检测抗体。本实施例中采用生物素化的抗体。为避免反映体系中的非特异性生物素的干扰，1μg/μL生物素化的抗体首先与亲和素化的HRP结合(合适的结合比例通过不同浓度配比确定)，然后用含1％脱脂牛奶的TBST作1:1000稀释，加入ELISA板条各孔中(100uL/孔)。室温下轻轻水平摇晃两小时后，TBST洗板至少三次。

步骤七：加入底物显色。加入常用酶标底物缓冲液，100uL/孔，室温下显色并读取吸光度，对结果进行定量分析。

在本实施例中，如背景技术中所述，本申请发明人通过质谱技术，在前期工作汇总对近200例人脑组织的超深度蛋白磷酸化分析，不仅发现Tau共有54个位点被磷酸化，还可以定量地分析出各位点的磷酸化强度及丰度，发现目前临床检测所用的T181位点既不是磷酸化程度较高，也不是含量较丰富的位点，而其它位点(如T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404等)才更为突出(如图1)，具有更强的临床应用价值。本申请的发明人的质谱定量分析还发现这些位点并不是同时分布在每个Tau蛋白分子，因此同时利用这些位点进行联合检测，可极大提高磷酸化Tau蛋白的检测灵敏度，使AD通过筛查得以发现成为可能。

在本实施例中，图1为AD脑组织磷酸蛋白组学分析中检测到的Tau蛋白磷酸化位点及变化程度，以脑组织内Tau蛋白的主要转录体(Tau441，即含含441个氨基酸)为载体，显示质谱定量检测到的各磷酸化位点与相对水平，以及被检测到的次数。其中T181是目前已应用于临床实验室检测的位点，但其它灰色标记的位点在AD中磷酸化程度更高、含量更丰富，比T181具有更强的床价值。Log2(AD/Ctl)：各位点在AD与对照(Ctl，control)组中磷酸化程度比值的对数值，提示各位点在AD中磷酸化变化程度。PSM:peptide-sequence match，指磷酸化位点所在的肽段被测序到的次数，提示含量。

图2为本发明的多位点与T181单位点ELISA法检测磷酸化Tau蛋白的结果比较。结果显示本发明的多位点检测比单位点检测灵敏10倍左右。本实验中所用的位点及捕获抗体：T181(ab254409)、S202/T205(ab210703)、T231(ab151559)、S235(ab133253)、T263(ab92627)、S324(ab109401)、S396(ab32057)、S404(ab92676)，均为Abcam公司；检测抗体：Tau 6-18(806505),Tau-100(816611)，Tau-210(806407)，均为购自Biolegend公司的生物素化抗体。

图3为本发明方法与国际认可的Wako公司的T181单位点检测结果比较。结果提示本发明方法的灵敏度要高10倍以上。Wako试剂盒(298-81701)为化学发光底物，不是可见光。因此将自建ELISA中的没反应底物同样换成发光底物，同时显像仪拍摄成图。

本实施发明的方法解决了目前背景技术中磷酸化Tau蛋白检测灵敏度不足的问题。本发明将改变背景技术中T181单位点检测方法，而采用联合检测其它变化更强、含量更丰富的磷酸化位点(T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404)(如图1所示)，以大幅度磷酸化Tau蛋白检测的灵敏度。

通过本发明的上述实施例，与现有技术相比，现有技术的发那个发针对T181单位点检测中，可最终检测到1:27稀释的磷酸化Tau蛋白样品，而本发明实施例的多位点检测方法，可检测到低至1:243稀释的磷酸化Tau蛋白样品(如图2所示)。因此，本发明的多位点联合检测方法，比T181单位点检测方法，可将灵敏度提高到10倍左右。另外，与国际比较认可的Wako公司的T181磷酸化Tau蛋白检测结果相比，本发明的检测灵敏度也至少要高10倍以上(如图3所示)。因此，本发明的检测方法，无论在原理上，还是在实际效果上，都比现有方法有着明显的优越性。

以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (3)

1.一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，其特征是：包括以下步骤：

S1、阳性参照品配制：

将老年人脑皮层组织按1g/mL裂解于RIPA缓冲液中，得脑组织裂解液；对脑组织裂解液中的Tau蛋白与Aβ进行Western blot与ELISA进行检测，并确认其水平升高，将其作为阳性对照的标本；

S2、抗体特异性鉴定：

将步骤S1中的作为阳性对照的标本的脑组织裂解液用碱性磷酸酶处理，以去除Tau蛋白上的各磷酸化位点，作为阴性对照；

利用重组质粒在细胞中表达Tau蛋白，作为阳性对照；

将经过碱性磷酸酶处理前后的脑组织裂解液、表达Tau蛋白的细胞裂解液和未表达Tau蛋白的细胞裂解液作为蛋白样品，利用各磷酸化Tau蛋白抗体进行Western blot，根据结果中的实际印迹条带与预期目标条带进行对比，以判断各抗体的特异性；

S3、抗体包板：

将步骤S2中的各抗体，即针对包括T181位点在内的T220、T231、S235、S238、S305、S396、S400、T403及S404位点的磷酸化位点的抗体，在包板缓冲液中配制成10ng/ml，加入ELISA板条各孔中(100μl/孔)，4度过夜后，移去抗体上清；并用TBST(0.05％Tween-20的Tris盐缓冲液)，清洗各孔至少三次；

S4、封闭：

利用5％的脱脂奶粉，200μl/孔，室温下轻轻水平摇晃半小时；然后，TBST洗板至少三次；

S5、加入待测磷酸化Tau蛋白样品：

将步骤S2中含有磷酸化Tau蛋白的阳性参照，用1％BSA首先进行1:100稀释，然后再3倍系列稀释；分别加入ELISA板条各孔，4度过夜后，移去上清；并用TBST清洗各孔至少三次；

S6、加入酶标检测抗体：

采用生物素化的抗体，将1μg/μL生物素化的抗体首先与亲和素化的HRP结合，然后用含1％脱脂牛奶的TBST作1:1000稀释，加入ELISA板条各孔中；室温下轻轻水平摇晃两小时后，TBST洗板至少三次；

S7、加入底物显色：

加入酶标底物缓冲液，100uL/孔，室温下显色并读取吸光度，对结果进行定量分析。

2.如权利要求1所述的一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，其特征是：步骤S3中包板缓冲液为50mM NaHCO₃，pH为9.5。

3.如权利要求1所述的一种基于多位点的高灵敏磷酸化Tau蛋白检测方法，其特征是：步骤S6中生物素化的抗体与亲和素化的HRP结合的比例通过不同浓度配比确定。