CN116790820A - 常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法 - Google Patents

常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116790820A
CN116790820A CN202310930545.1A CN202310930545A CN116790820A CN 116790820 A CN116790820 A CN 116790820A CN 202310930545 A CN202310930545 A CN 202310930545A CN 116790820 A CN116790820 A CN 116790820A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reagent
detection
bovine
primer
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310930545.1A
Other languages
English (en)
Inventor
陈新军
李喜平
何妍萍
罗虹
祁轩杰
张喜霞
石岩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gansu Kangchengli New Biotechnology Development Co ltd
Original Assignee
Gansu Kangchengli New Biotechnology Development Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gansu Kangchengli New Biotechnology Development Co ltd filed Critical Gansu Kangchengli New Biotechnology Development Co ltd
Priority to CN202310930545.1A priority Critical patent/CN116790820A/zh
Publication of CN116790820A publication Critical patent/CN116790820A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针、试剂及方法。本发明可以对牛病毒性腹泻BVDV病毒进行快速、实时、特异性检测，通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染，适合应用于多种荧光检测设备进行检测。

Description

常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针、试剂 及方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针、试剂及方法。
背景技术
牛病毒性腹泻(粘膜病)(Bovine viral diarrhoea/Mucosal disease)，二类传染病，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus简写BVDV属于黄病毒科瘟病毒属)引起的传染病，各种年龄的牛都易感染、以幼龄牛易感性最高。
传染来源主要是病畜。病牛的分泌物、排泄物、血液和脾脏等都含有病毒，以直接接触或间接接触方式传播。
主要在消化道和淋巴组织，口腔(口黏膜、齿龈、舌和硬腭)、咽部、鼻镜出现不规则烂斑、溃疡，以食道黏膜呈虫蚀样烂斑最具特征。流产胎儿的口腔、食道、真胃及气管内有出血斑及溃疡。运动失调的犊牛，严重的可见到小脑发育不全及两侧脑室积水。
目前牛病毒性腹泻BVDV病毒的诊断方法多为血清学方法和病毒分离鉴定，其灵敏度低，无法对早期感染进行确诊；而基于PCR的诊断方法耗时长，技术要求高，设备昂贵，无法普及。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种常温等温快速检测牛病毒性腹泻BVDV病毒的引物、探针试剂及方法，其可以对牛病毒性腹泻BVDV病毒进行快速、实时、特异性检测，适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，本发明提供常温等温扩增牛BVDV病毒的引物对和探针组合物，所述引物对包括核苷酸序列为TAAYRAGGGGGGTAGCARCAGTGGYGAGTTC(SEQ ID No:1)的上游引物和核苷酸序列为TGCCCTCGTCCACGTGGCATCTCGAGRCCT(SEQ IDNo:2)的下游引物；
所述探针的核苷酸序列为TGGATGGCTKAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTNGTCARTGGTTCGACRC(SEQ ID No:3)；
其中，斜体和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有荧光基团，碱基符号N为四氢呋喃，加粗和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有淬灭基团，斜体和下划线标识的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C上修饰有阻断基团。
在可选的实施方式中，所述荧光基团选自FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5；所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
在可选的实施方式中，所述阻断基团选自胺基、磷酸基团、生物素或C3-spacer。
第二方面，本发明提供常温等温扩增牛BVDV病毒的试剂，包括前述实施方式任一项所述的引物对和探针组合物。
在可选的实施方式中，所述试剂还包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及核酸外切酶。
优选地，重组酶质量浓度为520～725ng/μL；单链DNA结合蛋白质量浓度为100～200ng/μL；DNA聚合酶质量浓度为350～450ng/μL；核酸外切酶质量浓度为300～400ng/μL。
在可选的实施方式中，所述试剂还包括聚乙二醇，Tris，乙酸钾，二硫苏糖醇，酸磷酸腺苷，磷酸肌酸二钠盐，磷酸肌酶，脱氧核糖核苷三磷酸，海藻糖和甘露醇。
优选地，聚乙二醇的体积分数占总试剂体积为2％～4％；Tris的摩尔浓度为20～40mM；乙酸钾的摩尔浓度为100～140mM；二硫苏糖醇的摩尔浓度为4～8mM；酸磷酸腺苷的摩尔浓度为2～4mM；磷酸肌酸二钠盐的摩尔浓度为40～60mM；磷酸肌酶的质量浓度为80～120ng/μL；脱氧核糖核苷三磷酸的摩尔浓度为250～300μM；海藻糖的质量体积比为5％～8％；甘露醇的质量浓度为20～40ng/μL。
在可选的实施方式中，部分试剂组分以冻干粉形式储存或运输，所述部分试剂组分包括，重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶、Tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸和海藻糖和甘露醇。
优选地，所述部分试剂组分还包括辅助蛋白。
在可选的实施方式中，所述冻干粉的制备方法包括，将前述实施方式所述部分试剂组分混合得到的反应液在预冻得到预冻试剂，而后再经过梯度升温干燥得到冻干粉。
优选地，所述预冻的温度为-80℃。
优选地，所述预冻的时间为1～1.5h。
优选地，所述梯度升温干燥包括两段干燥。
优选地，所述两段干燥中，第一段干燥温度为-35～-45℃，干燥时长为2～10h。
优选地，所述两段干燥中，第二段干燥温度为10～18℃，干燥时长为1～2h。
第三方面，本发明提供非诊断目的的常温等温扩增牛BVDV病毒的方法，所述方法包括对包括前述实施方式任一项所述试剂和待检样本的混合体系进行恒温孵育，而后通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测。
优选地，所述恒温孵育的温度范围为20℃～42℃。
优选地，所述恒温孵育的孵育时间为15～25min。
在可选的实施方式中，所述待检样本来源于牛的口鼻分泌物、牛肝脏、牛血液、牛的饮用水、饲养环境或上游饲料。
本发明提供的技术方案取得的技术效果为：
(1)常温等温反应：与主要的几种核酸扩增技术相比，常温等温反应大大降低了对仪器加热模块的要求，也减少了对制冷模块的需求，因此使得反应仪器的选择面更加宽广。另外，对于配套检测仪器的设计可以趋于小型化、可携带化和操作简便化发展，而且对于检测操作的要求更加简单、便捷，因此可应用的区域和领域更加广阔。
(2)反应快速：常温等温核酸扩增技术是利用多种工程酶在特定的溶液环境下，最大限度的模拟生物体内的核酸扩增反应，大大缩短了扩增过程所需的时间。相对于荧光定量PCR，扩增反应时间由1.5～2小时缩短至10～25分钟，明显提高了扩增效率。
(3)实时检测：与淬灭基团分离的荧光基团和新合成的子链在数量上是一一对应的，随着扩增反应的推进荧光信号是累积的。由于检测仪器采集荧光信号存在一定的时间间隔，因此随着时间的变化，检测的荧光信号是一个变化的过程，从而实现实时监测的效果。
(4)定性与定量检测：通过采集的荧光信号绘制的扩增曲线可以用于对检测结果的判定。定性检测可以根据扩增曲线的线性快速判断，S型曲线表示阳性样本，平直曲线表示阴性样本；半定量检测可以根据扩增曲线与阈值线相交的时间，初步判断不同待检样本中目标核酸浓度的高低，例如时间值小的样本中目标核酸量高于时间值大的样本中目标核酸量；定性检测可以根据已知浓度的样本绘制标准曲线来实现。
(5)特异性和灵敏度：每对引物和荧光探针只能与目标核酸物进行特异性结合，因此检测准确而且专一。本发明实验证明，在25分钟内，对牛病毒性腹泻BVDV病毒检测的灵敏度都高达1×102拷贝/μL，达到～0.3fg/μL的检测级别。
(6)检测过程简易：主要反应组分配制后分装至反应管中，并冻干成干粉状态。反应前期准备只需要添加待检样本、双蒸水和缓冲液，混匀后即可启动扩增反应，所以对实验技能要求较低，一般实验人员即可完成操作。扩增反应完成后结果的定性判定也较为简单易懂，根据图形的形状可以作出判断，因此新方法也适合于基层检测机构的推广。
(7)应用范围广：具有常温、等温、快速、灵敏、特异、操作简便等特点，新方法适用多种荧光检测设备，例如荧光定量PCR、酶标仪、ESEQuantTube Scanner、Optigene GenieIII等，也可适用于将来的微流控分子检测平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明探针的设计原则；
图2为本发明提供的常温等温反应原理示意图；
图3为本发明实施例1中6组引物对的扩增结果；
图4为本发明实施例2中灵敏度检测结果；
图5为本发明实施例3中特异性检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
术语“常温等温”，是指不依赖精确控温的高端精密仪器完成反应的核酸扩增方式。本发明的方法不需要PCR过程中的反复的温度升降，可以在简易的温控设备上实现扩增反应，例如金属浴、水浴或者恒温箱；反应温度可以设置在20～42℃之间；由于反应温度影响着酶的催化速率而与反应速率成一定的相关性，因此对于脱氧核糖核酸(DNA)，荧光反应的最佳温度在37～39℃之间。
术语“阻断基团”是指用于抑制聚合酶从该位点开始延伸的修饰基团。
术语“具备荧光检测功能的仪器”，指可以同时实时检测多个核酸目标物的荧光信号的设备与平台，具有荧光检测通道，具有加热模块，可以维持反应所需的常温等温条件；还可以具有触屏式或可PC端控制的操作界面，以便实验参数的设置、数据分析以及反应过程的实时观测等一系列操作。
在某次具体实施方式中，第一方面，本发明提供常温等温扩增牛BVDV病毒的引物对和探针组合物，所述引物对包括核苷酸序列为TAAYRAGGGGGGTAGCARCAGTGGYGAGTTC(SEQID No:1)的上游引物和核苷酸序列为TGCCCTCGTCCACGTGGCATCTCGAGRCCT(SEQ IDNo:2)的下游引物；
所述探针的核苷酸序列为TGGATGGCTKAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTNGTCARTGGTTCGACRC(SEQ ID No:3)；
其中，斜体和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有荧光基团，碱基符号N为四氢呋喃，加粗和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有淬灭基团，斜体和下划线标识的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C上修饰有阻断基团。
本发明的特异性引物对，是针对牛病毒性腹泻BVDV病毒设计的寡核苷酸。由两条寡核苷酸组成一对引物，分别特异性识别一个BVDV病毒基因组上下游核苷酸序列；每条引物的长度在30～35核苷酸(nt)之间，序列中无回文序列、连续单碱基重复序列和内部二级结构区。引物Tm值不作为设计时主要考虑因素，其扩增产物为单一条带，无非特异性扩增和明显的引物二聚体。
在可选的实施方式中，所述荧光基团选自FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5；所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
在可选的实施方式中，所述阻断基团选自胺基、磷酸基团、生物素或C3-spacer。
本发明提供的探针的设计原则如图1所示，荧光基团和淬灭基团之间相距2～4nt，且二者之间设有核酸外切酶能够识别的THF位点，用于酶切反应。经外切酶酶切后，淬灭基团从荧光探针上脱落下来，荧光基团发射的荧光信号得以被检测出。本发明的特异性荧光探针，是针对牛病毒性腹泻BVDV病毒设计的寡核苷酸长链。寡核苷酸单链专一性识别牛病毒性腹泻BVDV病毒序列的某一区域，不与特异性引物识别位点重叠，长度为46～52nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。共有四个修饰位点，距离5’端的30～35nt的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶的识别位点；THF位点的上游标记一个荧光基团，下游标记一个淬灭基团，两个基团的间距为2～4nt；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团、生物素、或C3-spacer，用于抑制聚合酶从该位点开始延伸。探针的Tm值不作为设计的主要考虑因素。可选的荧光基团的种类较多，例如FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5等。可选的淬灭基团为BHQ1或BHQ2，以最大限度地降低背景荧光噪音为原则。
第二方面，本发明提供常温等温扩增牛BVDV病毒的试剂，包括前述实施方式任一项所述的引物对和探针组合物。
在可选的实施方式中，所述试剂还包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及核酸外切酶。
优选地，重组酶质量浓度为520～725ng/μL；单链DNA结合蛋白质量浓度为100～200ng/μL；DNA聚合酶质量浓度为350～450ng/μL；核酸外切酶质量浓度为300～400ng/μL。
本发明试剂中的4种工程酶分别为重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及核酸外切酶以及辅助蛋白，是一系列具备特定功能的基因工程酶。它们具有以下特征：(1)每种基因工程酶都来源于自然界常见菌中，具备所需的特定的功能，通过基因工程改造、重组构建、发酵表达、破碎纯化以及活性检测等一系列流程后，变成可工业化生产的高纯度、高活性的酶蛋白；(2)每种酶在扩增反应过程中的作用不同，相互合作在常温恒温的条件下实现核酸的体外快速扩增；(3)重组酶，来源于噬菌体或细菌，例如大肠杆菌(E.coli)重组酶RecA；(4)单链DNA结合蛋白，来源于T4或E.coli的gp32；(5)DNA聚合酶的来源较多，例如Phi-29聚合酶、或枯草芽胞杆菌PolI(Bsu)、Bst聚合酶或者E.coli的DNA聚合酶I Klenow大片段；(6)辅助蛋白，来源于T4噬菌体uvsY蛋白；(7)核酸外切酶，来源于E.coli的核酸外切酶exoIII或exoV；(8)每种酶蛋白在反应体系中的最适浓度范围分别为：重组酶的浓度范围是520～725ng/μL；单链DNA结合蛋白的浓度范围是100～200ng/μL；DNA聚合酶的浓度范围是350～450ng/μL；核酸外切酶的浓度范围是300～400ng/μL。
在可选的实施方式中，所述试剂还包括聚乙二醇，Tris，乙酸钾，二硫苏糖醇，酸磷酸腺苷，磷酸肌酸二钠盐，磷酸肌酶，脱氧核糖核苷三磷酸，海藻糖和甘露醇。
优选地，聚乙二醇的体积分数为2％～4％；Tris的摩尔浓度为20～40mM；乙酸钾的摩尔浓度为100～140mM；二硫苏糖醇的摩尔浓度为4～8mM；酸磷酸腺苷的摩尔浓度为2～4mM；磷酸肌酸二钠盐的摩尔浓度为40～60mM；磷酸肌酶的质量浓度为80～120ng/μL；脱氧核糖核苷三磷酸的摩尔浓度为250～300μM；海藻糖的质量体积比为5％～8％；甘露醇的质量浓度为20～40ng/μL。
上述试剂中的其它组分，是维持酶促反应最适条件的多种化合物的混合物。这些组分为反应提供酶的辅因子、盐离子浓度、酸碱度、反应所需能量、扩增所需原料，冻干处理过程和存储阶段中提供保护剂。
在可选的实施方式中，部分试剂组分以冻干粉形式储存或运输，所述部分试剂组分包括，重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶、Tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸和海藻糖和甘露醇。
优选地，所述部分试剂组分还包括辅助蛋白。
在可选的实施方式中，所述冻干粉的制备方法包括，将前述实施方式所述部分试剂组分混合得到的反应液在预冻得到预冻试剂，而后再经过梯度升温干燥得到冻干粉。
优选地，所述预冻温度为-80℃。
优选地，所述预冻时间为1～1.5h。
优选地，所述梯度升温干燥包括两段干燥。
优选地，所述两段干燥中，第一段干燥温度为-35～-45℃，干燥时长为2～10h。
优选地，所述两段干燥中，第二段干燥温度为10～18℃，干燥时长为1～2h。
冻干燥处理，是一种将反应混合物在超低温条件下进行干燥处理的过程，目的是便于反应混合物的存储和运输，减少在长途运输过程中酶活性降低的几率。将反应混合物分装于反应管中，在-80℃条件下预冻1～1.5h，预冻结束后放入真空冷冻干燥机中进行干燥，其过程分为主干燥(-35～-45℃，2～10小时)和终末干燥(10～18℃，1～2小时)两个阶段，两个阶段的干燥时间取决于冻干样品的数量。冷冻干燥后的成品需为白色干性粉末并依附在反应管壁，加水重悬后可完全溶解，无任何颗粒状残留物。
第三方面，本发明提供非诊断目的的常温等温扩增牛BVDV病毒的方法，所述方法包括对包括前述实施方式任一项所述试剂和待检样本的混合体系进行恒温孵育，而后通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测。
优选地，所述恒温孵育的温度范围为20℃～42℃。
优选地，所述恒温孵育的孵育时间为15～25min。
在可选的实施方式中，所述待检样本来源于牛的口鼻分泌物、牛肝脏、牛血液、牛的饮用水、饲养环境或上游饲料。
本发明检测核酸目标物的方法，是一种在常温等温条件下，通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测的方法，通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，并有效防止气溶胶污染；适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
本发明的检测方法适合应用于多种荧光检测设备，检测方法的结果可以通过不同类型的荧光检测设备进行判读。待检样本的阳性、阴性判定：以前3分钟内每个样本检测的荧光值的均值计算出样本的标准偏差值，该样本的检测阈值线为前3分钟样本检测荧光均值加上三倍该样本的标准偏差值(单位：荧光强度，mV)；当扩增曲线与阈值线相交后，并在随后的1分钟内曲线斜率大于30mV/分钟，则可视为阳性扩增；如果扩增曲线与该阈值线在反应时间内无任何交点，则视为阴性扩增。
本发明的采用闭管检测，一次性加样后，整个检测过程反应管保持密闭，能有效防止气溶胶所引起的假阳性干扰。
本发明检测方法的工作原理如图2所示，其是一种借助酶促反应打开核酸物质的高级结构，从而在常温等温条件下进行快速扩增的反应机理。重组酶与引物形成复合物，该复合物在辅助蛋白质的协助下，特异地结合在DNA链上；在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA双链结构被打开，单链结核蛋白结合在打开的单链DNA上稳定DNA单链结构，进而利于重组酶-引物复合物在DNA链上搜寻同源互补区域，一旦复合物上的引物找到匹配区域通过碱基互补配对原则结合在DNA链上，重组酶从引物上脱落，同时DNA聚合酶结合在该区域DNA链上，沿着引物的3’端进行子链的延伸；因为DNA聚合酶的链置换活性，新合成的子链替代同源母链的位置，与母链形成双链结构；由于上下游引物的限制，重组酶-引物复合物在下一轮扩增起始阶段，大大缩短了扫描匹配区域需要的时间，因而可以更快地合成新的子链；当双链DNA被打开之后，特异性荧光探针碱基互补配对结合在引物结合区域的下游的母链上，因此荧光探针嵌入新生成的子链中；在新生成的DNA双链中，由于荧光探针的嵌入，在荧光探针的THF区域出现未与母链配对的碱基，核酸外切酶可以识别这些未配对的碱基，进行酶切后将该区域的荧光基团和淬灭基团分离，使荧光基团的荧光信号得以释放，同时切除了3’端的修饰基团，DNA聚合酶以此为起点继续延伸子链。新合成的双链DNA链上携带有荧光基团，因此荧光检测设备记录的荧光信号与生成子链的数量呈一一对应关系，所以新方法记录的荧光信号也是积累的荧光。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：引物的筛选
参考NCBI GenBank上已公布的牛病毒性腹泻BVDV病毒(bovine viraldiarrheavirus，BVDV)的核苷酸序列SEQ ID No:15所示：
GTATACGAGAGTTAGATAAAAATACTCGTATACACATTGGGCAATTAAAAGTAATAATTAGGCCTAGGGAACGAATCCTCCTCCGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACTAGCATAGCGAGGGGGGTAGCAACAGTGGTGAGTTCGTTGGATGGCTTAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTCGTCAGTGGTTCGACGCCTTAACATGAAGGTCTCGAGATGCCACGTGGACGAGGGCACGCCCAAAGCACATCTTAGCCCGAGCGGGGGTCGCTCGGACGAAAACAGTTTGATCAACTGCTACGAATACAGCCTGATAGGGTGCTGCAGAGGCCCACTGTATTGCTACTAAAAATCTCTGCTGTACATGGCAC(SEQ ID No:15)。
发明人对BVDV病毒的基因组、蛋白结构与功能等信息进行了深入的研究，经过大量实验表明，不同的引物对恒温扩增的效果和灵敏度具有一定的影响。因此，本发明针对BVDV病毒的核苷酸序列初步设计了6对不同的引物对：命名为BVDV1～6(如表1所示)，这些引物对的核苷酸序列可以和BVDV病毒基因组的相应序列特异性结合。
表1：引物对和探针设计序列
分别应用上述6对引物对按照如下步骤进行实验：
1.1根据上述NCBI GenBank上已经公布的牛病毒性腹泻BVDV病毒的核苷酸序列(SEQ ID No:15)，全基因合成牛病毒性腹泻BVDV病毒。
1.2分别使用上述6对引物对，对步骤1.1得到的BVDV病毒按照表3所示扩增反应体系进行过程，扩增温度为39℃，扩增时间为20min。
表2实施例1中的扩增反应体系
组分 体积(μL)
BVDV-F(10μM) 2μL
BVDV-R(10μM) 2μL
BVDV-Probe(10μM) 0.6μL
PEG 4.5％
BVDV模板 2μL
冻干粉* 1管
醋酸镁(280mM) 2.5μL
用双蒸水补充至 50μL
表中扩增试剂来源于RNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)潍坊安普未来生物科技有限公司，WLRE8205KIT)，表2中的BVDV-Probe来源于该试剂盒。
实验结果如图3所示，可以看出11次循环之后，引物对BVDV1的实验组即可检测到荧光信号，远优于其他引物对，因此，选择引物对BVDV1作为荧光检测实验的引物。根据引物对BVDV1对应的DNA序列，设计了一条荧光探针BVDV-Probe及其相应的修饰探针(探针序列如表3所示)。
表3引物对BVDV1对应的探针
其中，斜体和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有荧光基团，碱基符号N为四氢呋喃，加粗和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有淬灭基团，斜体和下划线标识的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C上修饰有阻断基团。
实施例2荧光检测
本实施例用于说明在荧光仪器上进行的常温恒温荧光反应。
2.1根据NCBI GenBank上已经公布的牛病毒性腹泻BVDV病毒的核酸序列(SEQ IDNo:15)，全基因合成牛病毒性腹泻BVDV病毒。
2.2使用实施例1得到的引物对1和探针-修饰后，对步骤2.1得到的BVDV病毒按照表4所示扩增反应体系进行过程，扩增温度为39℃，扩增时间为20min。
表4实施例2中的扩增反应体系
组分 体积(μL)
BVDV-F1(10μM) 2μL
BVDV-R1(10μM) 2μL
探针-修饰后(10μM) 0.6μL
PEG 4.5％
BVDV模板 2μL
冻干粉* 1管
醋酸镁(280mM) 2.5μL
用双蒸水补充至 50μL
表中扩增试剂来自RNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)(潍坊安普未来生物科技有限公司，WLRE8205KIT)。
用RNase Free dH2O对牛病毒性腹泻BVDV病毒模板进行10倍梯度稀释，用RNA恒温快速扩增试剂盒(荧光型)按照说明书的记载进行荧光实验，结果判断标准为荧光检测进行20min内有荧光信号的增加曲线，判断为阳性。如图4所示，1～6为引物BVDV-1与探针-修饰后在不同的模板浓度下的扩增效果(模板浓度分别为：1为106copies/μL；2为105copies/μL；3为104copies/μL；4为103copies/μL；5为102copies/μL；6为101copies/μL；negative为阴性对照组)。该方法可以检测出102个拷贝/μL的牛病毒性腹泻BVDV病毒的合成阳性质粒模板为阳性。扩增结果中，104个拷贝/μL的阳性质粒模板在4.5min左右就检测出增加的荧光信号，即使是最低的102个拷贝/μL的DNA模板量在9min也可以检测出荧光信号的增加。而且在整个荧光检测过程中，阴性反应一直保持着较低的水平。
实施例3：样本检测
为了检测本方法的特异性，对浓度为103个拷贝/μL的6种病毒模板(病毒质粒)进行验证，病毒种类如表5所示：
表5实施例3中选用的病毒种类及编号
编号 病毒种类
1 BVDV病毒模板
2 牛结核病(Bovine Tuberculosis)病毒模板
3 口蹄疫病(Footand Mouth Disease Virus，FMDV)病毒模板
4 牛恶性卡他热病(Malignant Catarrhal Fever)病毒模板
5 蓝舌病(Bluetongue Virus)病毒模板
6 牛肺疫(contagious bovine pleuropneumonia)病毒模板
其中牛结核病病毒模板制备方法参考文献“周晶,贾浩,徐广贤等.牛结核分枝杆菌PstS3基因克隆与序列分析[J].宁夏大学学报(自然科学版),2010,31(03):273-274+279.”中的制备方法。
口蹄疫病病毒模板制备方法参考文献“索青利,赵明秋,陈金顶等.口蹄疫病毒G-01株基因组编码区的序列分析[J].华南农业大学学报,2007(04):95-99.”中的制备方法。
牛恶性卡他热病病毒模板的制备方法参考专利CN110967483A中的制备方法。
蓝舌病病毒模板的制备方法参考文献“刘小强,武建强,张丽等.蓝舌病病毒内蒙古分离株VP2基因5′端序列分析及探针制备[J].内蒙古大学学报(自然科学版),2004(01):40-43.”中的制备方法。
牛肺疫病毒模板的制备方法参考文献“辛九庆.牛传染性胸膜肺炎诊断技术与分子流行病学研究[D].吉林农业大学,2007.”中的制备方法。
检测结果如图5所示，表明：牛病毒性腹泻BVDV病毒样本出现正常扩增的阳性结果，对照样本和阴性对照均未出现扩增。结果说明，本发明MIRA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出BVDV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。
综上所述，本发明可以对牛病毒性腹泻BVDV病毒进行快速、实时、特异性检测，通过特异性引物、特异性荧光探针、5种工程酶、其它化学组分的共同作用下，在具备荧光检测功能的仪器中实现核酸目标物的快速检测，并通过严格的实验操作步骤保证闭管检测，有效防止气溶胶污染，适合应用于多种荧光检测设备进行检测。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.常温等温扩增牛BVDV病毒的引物对和探针组合物，其特征在于，所述引物对包括核苷酸序列为TAAYRAGGGGGGTAGCARCAGTGGYGAGTTC的上游引物和核苷酸序列为TGCCCTCGTCCACGTGGCATCTCGAGRCCT的下游引物；
所述探针的核苷酸序列为TGGATGGCTKAAGCCCTGAGTACAGGGTAGTNGTCARTGGTTCGACR C；
其中，斜体和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有荧光基团，碱基符号N为四氢呋喃，加粗和下划线标识的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸T上标记有淬灭基团，斜体和下划线标识的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸C上修饰有阻断基团。
2.根据权利要求1所述的引物对和探针组合物，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、Cy3、HEX、Texas Red、JOE、VIC、TAMRA或Cy5；
所述淬灭基团选自BHQ1或BHQ2。
3.根据权利要求1所述的引物对和探针组合物，其特征在于，所述阻断基团选自胺基、磷酸基团、生物素或C3-spacer。
4.常温等温扩增牛BVDV病毒的试剂，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的引物对和探针组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及核酸外切酶；
优选地，重组酶质量浓度为520～725ng/μL；单链DNA结合蛋白质量浓度为100～200ng/μL；DNA聚合酶质量浓度为350～450ng/μL；核酸外切酶质量浓度为300～400ng/μL。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括聚乙二醇，Tris，乙酸钾，二硫苏糖醇，酸磷酸腺苷，磷酸肌酸二钠盐，磷酸肌酶，脱氧核糖核苷三磷酸，海藻糖和甘露醇；
优选地，聚乙二醇的体积分数占总试剂体积为2％～4％；Tris的摩尔浓度为20～40mM；乙酸钾的摩尔浓度为100～140mM；二硫苏糖醇的摩尔浓度为4～8mM；酸磷酸腺苷的摩尔浓度为2～4mM；磷酸肌酸二钠盐的摩尔浓度为40～60mM；磷酸肌酶的质量浓度为80～120ng/μL；脱氧核糖核苷三磷酸的摩尔浓度为250～300μM；海藻糖的质量体积比为5％～8％；甘露醇的质量浓度为20～40ng/μL。
7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，部分试剂组分以冻干粉形式储存或运输，所述部分试剂组分包括，重组酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、核酸外切酶、Tris、乙酸钾、二硫苏糖醇、酸磷酸腺苷、磷酸肌酸二钠盐、磷酸肌酶、脱氧核糖核苷三磷酸和海藻糖和甘露醇；
优选地，所述部分试剂组分还包括辅助蛋白。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述冻干粉的制备方法包括，将权利要求7所述部分试剂组分混合得到的反应液在预冻得到预冻试剂，而后再经过梯度升温干燥得到冻干粉；
优选地，所述预冻的温度为-80℃；
优选地，所述预冻的时间为1～1.5h；
优选地，所述梯度升温干燥包括两段干燥；
优选地，所述两段干燥中，第一段干燥温度为-35～-45℃，干燥时长为2～10h；
优选地，所述两段干燥中，第二段干燥温度为10～18℃，干燥时长为1～2h。
9.非诊断目的的常温等温扩增牛BVDV病毒的方法，其特征在于，所述方法包括对包括权利要求4～7任一项所述试剂和待检样本的混合体系进行恒温孵育，而后通过具备荧光检测功能的仪器进行可视化检测；
优选地，所述恒温孵育的温度范围为20℃～42℃，进一步优选为37～39℃；
优选地，所述恒温孵育的孵育时间为15～25min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待检样本来源于牛的口鼻分泌物、牛肝脏、牛血液、牛的饮用水、饲养环境或上游饲料。
CN202310930545.1A 2023-07-27 2023-07-27 常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法 Pending CN116790820A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310930545.1A CN116790820A (zh) 2023-07-27 2023-07-27 常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310930545.1A CN116790820A (zh) 2023-07-27 2023-07-27 常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116790820A true CN116790820A (zh) 2023-09-22

Family

ID=88039777

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310930545.1A Pending CN116790820A (zh) 2023-07-27 2023-07-27 常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116790820A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021201378B2 (en) Compositions and methods for detecting an RNA virus
CN109468384B (zh) 一种同时检测45个y基因座的复合扩增检测试剂盒
KR102098772B1 (ko) 아데노바이러스(Adenovirus) subtype B와 C 그리고 아데노바이러스 subtype F와 G의 screening이 가능한 검출용 primer 및 PNA probe와 이를 이용한 아데노바이러스 Real-time multiplex PCR 검출 방법
CN111979303A (zh) 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用
US7595163B2 (en) Method for detecting SARS coronavirus
CN111690776A (zh) 常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、试剂、方法及试剂盒
ES2703792T3 (es) Detección de ácidos nucleicos mediante amplificación basada en invasión de hebra
CN111733284A (zh) 常温等温快速检测猫细小病毒的引物、探针、试剂及方法
KR102338861B1 (ko) RT-LAMP를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법
US20140017692A1 (en) Method and kit for detecting target nucleic acid
EP3719142A2 (en) Method for amplifying target nucleic acid and composition for amplifying target nucleic acid
CN109355428A (zh) 常温恒温快速检测伪狂犬病病毒的引物、探针、试剂及试剂盒
CN108220480B (zh) 一种用于特异性检测hpv18的rpa荧光定量引物对、探针及试剂盒
CN112961943A (zh) 用于检测SARS-CoV-2的引物探针组合产品
CN112391498B (zh) 验孕试纸在乙型肝炎病毒耐药突变基因现场即时检测中的应用
CN116042878B (zh) 一种用于检测和区分布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法
CN1865934A (zh) 采用分子信标对核酸信号进行恒温放大与检测的方法
CN116790820A (zh) 常温等温快速检测牛病毒性腹泻bvdv病毒的引物、探针、试剂及方法
CN113789368B (zh) 核酸检测试剂盒、反应体系及方法
CN113151591A (zh) 一种用于检测SARS-CoV-2的核酸组合物和试剂盒
CN113151599A (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物组、试剂、试剂盒及检测方法
CN112501166A (zh) 一种化学修饰的高稳定性rna及试剂盒和方法
CN118086581A (zh) 一种快速检测伪狂犬病病毒prv的引物、探针、试剂及方法
CN117987514B (zh) 一种基于CRISPR/Cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法及其应用
CN115058493B (zh) 一种用于多重核酸检测的dna探针、crispr-反向点杂交核酸检测系统及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination