CN116790805A - 与玉米雄花颖壳闭合突变性状连锁的分子标记及应用 - Google Patents
与玉米雄花颖壳闭合突变性状连锁的分子标记及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了与玉米雄花颖壳闭合突变性状连锁的分子标记及应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提供了一种与ctg1突变性状紧密连锁的分子标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了一种用于扩增该分子标记的引物对，该引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2‑3所示。本发明提供的突变体ctg1和分子标记为玉米两系杂交制种技术提供了材料基础，并加快了玉米杂交制种技术的创新。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，特别是涉及与玉米雄花颖壳闭合突变性状连锁的分子标记及应用。
背景技术
玉米作为雌雄同株异花作物，使得杂种优势在玉米生产中的应用非常成功。目前，世界玉米生产绝大部分都采用杂交种。在杂交制种过程中，需要防止母本株自交，让母本系只接受父本系花粉进行杂交。长久以来，我国玉米杂交制种主要采用人工去雄，耗时费力且价格昂贵，同时还存在去雄不及时、不彻底导致种子混杂，影响制种质量的问题。另外，去雄还会影响母本生长发育，导致单株产量降低，影响制种产量。随着城镇化进程加快，农村劳动力不断流向城镇和非农产业，人工去雄的问题将长期存在且越发严峻。利用雄性不育进行不育化制种可有效解决人工去雄存在的问题。植物雄性不育可分为细胞质雄性不育和细胞核雄性不育。水稻是成功应用细胞质雄性不育制种的典型，但由于玉米不同胞质类型具有不同的应用瓶颈，限制了细胞质雄性不育在生产中的应用。玉米细胞核雄性不育则可有效避免细胞质雄性不育在制种中的瓶颈问题，但是由于纯合细胞核雄性不育系无法有效保持的问题限制了该类型不育系在生产中的应用。
随着生物技术的发展，2016年美国先锋公司开发的SPT种子生产技术才实现了不育系杂交制种体系中核不育系育性的高效保持(Wu等，2016，Development ofa novelrecessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maizeand other cross-pollinating crops.Plant Biotechnol J.14(3):1046-54)，推动了玉米细胞核雄性不育在杂交制种中的应用。SPT技术的核心是将串联的三个功能模块(雄性可育基因表达盒、花粉致死基因表达盒以及种子荧光标记基因表达盒)通过转基因手段导入细胞核雄性不育突变体，通过对籽粒进行荧光筛选完成不育系和保持系的高效繁殖。尽管基于SPT技术体系在玉米杂交制种中具有诸多优点，比如无需去雄、不受种质限制、更高的种子纯度、更高的制种产量，但仍然存在转基因漂移(Zhang等，2018，Construction of amulticontrol sterility system for a maize male-sterile line and hybrid seedproduction based on the ZmMs7 gene encoding a PHD-finger transcriptionfactor.Plant Biotechnol J.16(2):459-471)。目前，对于我国玉米种子生产企业来说，SPT技术的应用存在诸多方面的限制因素，例如：一是生物技术投入大，应用难；知识产权的限制；二是SPT依赖于转基因技术，存在基因漂移风险，管理政策限制。
因此，开发不依赖于转基因技术或对制种企业具有更好普适性的可适用于不育化制种的核不育育性保持技术，是创新和改革玉米杂交制种技术的关键。生态型核雄性不育其育性转换主要受温度或光照长度等生态条件控制，在特定生态条件下可作为不育系，在另外的生态条件下又可以作为保持系自交繁殖不育系，实现不育系的保持，通过一系两用配合恢复系即可实现两系杂交制种。目前，两系法制种技术在水稻杂交制种中有一定面积的成功应用，主要归功于在水稻中发现了一系列生态核雄性不育材料，特别是温敏核不育材料的发现和利用。而玉米两系制种技术目前仅处于探索阶段，其限制因素在于发现的玉米生态型核雄性不育材料少，育性转换不彻底、不稳定。因此，搜集、创制、筛选新的适用于玉米两系制种技术的新材料或新位点可加快玉米杂交制种技术创新。
发明内容
本发明的目的是提供与玉米雄花颖壳闭合突变性状连锁的分子标记及应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的突变体ctg1以及与该突变体紧密连锁的显性分子标记ctgMarker，为玉米两系杂交制种技术提供了材料基础，并加快了玉米杂交制种技术的创新。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
技术方案一：一种与ctg1突变性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
技术方案二：一种用于扩增所述分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。
技术方案三：一种所述的引物对在扩增所述的分子标记中的应用。
进一步地，所述扩增的体系为：7.5μL的2×PCRMix、浓度为10μM的上下游引物各0.3μL、浓度为50-200ng/μL的DNA溶液1.5μL和ddH2O 5.4μL。
进一步地，所述扩增的程序为：第一步：94℃预变性5min；第二步：94℃变性30s，第三步：58℃退火30s，第四步：72℃延伸30s；重复第二步到第四步，共计35个循环；最后72℃孵育2min，结束程序。
技术方案四：一种所述的分子标记或所述的引物对在玉米遗传改良中的应用。
技术方案五：一种所述的分子标记或所述的引物对在玉米两系杂交制种中的应用。
技术方案六：一种所述的分子标记或所述的引物对在雄性不育制种中的应用。
技术方案七：一种所述的分子标记或所述的引物对在辅助选择玉米雄花颖壳闭合性状中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明通过遗传分析，明确玉米雄花颖壳闭合突变体ctg1的性状受单个核基因控制，表现为隐性遗传。结果显示：突变体ctg1在整个开花期雄穗小花颖壳完全闭合，无花药外露，不散粉，而突变基因ctg1对其他农艺性状没有影响，可做不育系用于雄性不育制种。且外施农用生长调节剂赤霉酸可促进突变体雄花颖壳正常开裂、花药正常散粉、自交正常结实，可实现ctg1突变体繁殖。本发明所提供的玉米雄花颖壳闭合突变体ctg1可为玉米两系杂交制种技术提供材料基础。
(2)本发明通过多态性分子标记定位技术，将突变体ctg1定位于玉米9号染色体多态性分子标记M25和M21之间，区间为80,198,015-81,858,013(参考基因组为B73RefGen_v4)。进一步通过多态性分子标记开发，获得一个与该突变性状紧密连锁的显性分子标记ctgMarker，该显性分子标记ctgMarke可用于在其他自交系中快速转育ctg1突变性状，进一步克隆ctg1突变基因后，则可利用基因定点编辑技术快速完成其他材料中突变性状的形成，进而促进ctg1突变性状在玉米两系杂交制种中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为玉米突变体ctg1与野生型RP125的表型鉴定结果，其中，A为RP125吐丝散粉期植株照片；B为RP125雄花小穗开花散粉局部图；C为RP125散粉时花粉I2-KI染色图片；D为突变体ctg1吐丝散粉期植株照片；E为突变体ctg1雄花小穗颖片不张开突变表型；F为ctg1吐丝期花粉I2-KI染色图片；
图2为喷施赤霉酸对ctg1小穗开花散粉的促进作用，其中，A为突变体ctg1喷施水后第二天雄穗表现；B-G分别为突变体ctg1喷施500mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L和10mg/L赤霉酸后第二天雄穗表现；H为野生型RP125雄花散粉照片；I为野生型RP125雄花5个小时的散粉量；J为野生型RP125自交果穗；K为突变体ctg1喷施50mg/L赤霉酸后雄花散粉照片；L为突变体ctg1喷施50mg/L赤霉酸后雄花5个小时的散粉量；M为突变体ctg1喷施50mg/L赤霉酸后自交果穗；
图3为F2分离群体雄花表现，其中，A为突变体ctg1与B73组配的F2群体中雄花颖壳正常开裂单株表现；B为突变体ctg1与B73组配的F2群体中雄花颖壳不开裂单株表现；C为突变体ctg1与Mo17组配的F2群体中雄花颖壳正常开裂单株表现；D为突变体ctg1与Mo17组配的F2群体中雄花颖壳不开裂单株表现；
图4为突变位点分子标记定位及紧密连锁标记开发，其中，A为利用3647个来源于[ctg1×Mo17]F2群体的颖壳不开裂单株进行的多态性分子标记定位，B为定位区间内开发的显性标记电泳图，其中M为DNA片段大小Marker，从上到下分别为2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp；泳道L1-L12材料均含有ctg1突变等位基因，分别为ctg1突变体、ctg1×SCML0849、ctg1×ZNC442、ctg1×Y9614、ctg1×PH6WC、ctg1×京92、ctg1×京724、ctg1×昌7-2、ctg1×郑58、ctg1×PHBIM、ctg1×PH6WC、ctg1×B73；泳道L13-L24材料均不含有ctg1突变等位基因，分别RP125野生型、RP125×SCML0849、RP125×ZNC442、RP125×Y9614、RP125×PH6WC、RP125×京92、RP125×京724、RP125×昌7-2、RP125×郑58、RP125×PHBIM、RP125×PH6WC、RP125×B73；
图5为利用显性标记ctgMarker进行ctg1突变性状的分子标记辅助选择，其中，A为分子标记辅助选择路线图，B为显性标记ctgMarker在各回交世代的检测效果，C为通过显性标记ctgMarker进行分子标记辅助选择实现了自交系Mo17和B73回交转育ctg1突变性状。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
1、玉米雄花颖壳闭合突变体表型鉴定
2015年7月，发明人在玉米自交系RP125的太空诱变后代鉴定到一份雄花小穗颖壳不开裂突变体ctg1(closed tasselglume 1)。对玉米突变体ctg1与野生型RP125的表型鉴定结果显示，与RP125(图1中A，B和C)相比，突变体ctg1(图1中D，E和F)，植株整体农艺性状无明显差异(图1中A和D)；在吐丝散粉期，RP125雄花小穗颖壳开裂正常，花药正常外露散粉(图1中B)，花粉粒可被I2-KI染色，花粉活力正常(图1中C)；突变体ctg1雄花小穗颖壳一直闭合不张开，花药不外露不散粉(图1中E)，花粉粒可被I2-KI染色，花粉活力正常(图1中F)。
现有技术如在水稻杂交制种中，外源喷施赤霉酸可促进水稻颖壳张开，提高杂交制种结实率。因此本发明在花粉粒成熟期，对突变体ctg1外源喷施农业生产上常用的植物生长调节剂赤霉酸(有效成分含量75％，生产厂家为上海同瑞生物科技有限公司)，与仅喷水处理的对照(图2中A)相比，分别喷施500mg/L(图2中B)、200mg/L(图2中C)、100mg/L(图2中D)、50mg/L(图2中E)、25mg/L(图2中F)和10mg/L(图2中G)的赤霉酸都能促进ctg1雄穗开花散粉，高效经济的喷施浓度可以选择25～50mg/L，与生产上水稻制种建议施用量一致。与未喷施处理的野生型RP125雄穗相比(图2中H)，喷施50mg/L浓度的赤霉酸后第二天，突变体ctg1的雄穗可有效开花散粉(图2中K)；与未喷施处理的RP125雄穗散粉量(图2中I)相比，由于突变体ctg1雄穗开花更集中，散粉量更大(图2中L)；与RP125自交结实果穗(图2中J)相比，突变体ctg1在喷施50mg/L浓度的赤霉酸后，自交结实正常(图2中M)。
上述这些结果表明，突变体ctg1在正常条件下雄花颖壳不开裂、花药不散粉，可作为雄性不育系应用；而外源喷施赤霉酸可促进突变体颖壳张开，花药正常散粉，自交正常结实，又可在外施赤霉酸后作为保持系应用，具有玉米两系杂交制种中一系两用的特点。
2、闭颖突变体ctg1的精细定位和紧密连锁分子标记开发
本发明将突变体ctg1作为母本，分别与自交系B73、Mo17和黄早四杂交，结果表明所有杂交F1植株都表现为雄花正常开花散粉，说明该性状受细胞核控制。与B73和Mo17组配的F1自交获得F2群体，F2群体在开花散粉期表现出颖壳正常开裂散粉和完全闭合两种表型(图3)。本发明分别统计F2分离群体中雄花颖壳开裂和不开裂单株数进行遗传分析，结果表明该突变性状符合孟德尔遗传，受单一隐性核基因控制。
本发明通过多态性分子标记定位技术，以3647个[ctg1×Mo17]F2群体中的颖壳不开裂单株对突变位点进行分子标记定位，将目标位点定位在9号染色体多态性标记M25和M21之间，区间为80,198,015-81,858,013(参考基因组为B73_RefGen_v4)，物理距离约1.7Mb(图4A)，并在该区间筛选到一个与ctg1突变位点紧密连锁的显性标记，命名为ctgMarker，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(SEQ ID NO:1的核苷酸序列为GCGTGAGTCGGTAGCAGACCGGTGAAAAGAACGAAGCCAAGGACACCGGTGAGTTGGATTTCGATTTCTGTTTTTCTATCCCCTCTCAATCAACCAGTTACAGTATTTATAGATCTGAAATCCAACTAACAGAACGACTAATGACTTGGCTAATCACTTATTACAGCCCAAAGAAGAATAATACGGCCCTATTATGGCCCAAACCCTAATACTCAAAAGACCCACTAATACTCCATACCTGTGCCTAAACACCGCCACCTTGGGTCATCACAAAGAAACACCTCAACGCGCCCCCAGGTCAGTCACCCGACATGATCCCGCGCTCTCAATCTAATGCGGAACCTGTCGTTCTGATCCTTTATTTAGCCCGGATCCTTGCGTCGGTAGAAACTGTTTATTTCTTACTACGTTGTTCCAGACTTCCAGTTAGTTTGGTGGTGTGACCGTGAGGAGCACTCTTTAGTTTGTTGTGAGGACTGACCGTGTAAGCGAATTTCGTGTGGTTAAAAGATCCCTTCCACGCCAAAGCGTAAAGATTCGGTTCCGGTCGTGAT)，用核苷酸序列(SEQ ID NO:2)为GCGTGAGTCGGTAGCAGACC的引物ctgMarker-F和核苷酸序列(SEQ ID N0:3)为ATCACGACCGGAACCGAATC的ctgMarker-R引物，共同对该标记进行扩增，
扩增的体系和程序分别如下所示：
扩增的体系为：7.5μL的2×PCRMix、浓度为10μM的上下游引物各0.3μL、浓度为50-200ng/μL的DNA溶液1.5μL和ddH2O 5.4μL。
扩增的程序为：第一步：94℃预变性5min；第二步：94℃变性30s，第三步：58℃退火30s，第四步：72℃延伸30s；重复第二步到第四步，共计35个循环；最后72℃孵育2min，结束程序。
扩增片段大小约为520bp，图4结果显示，含有ctg1突变位点的材料能扩增出目的条带，而不含ctg1突变位点的材料则不能扩增出目的条带(图4B)。
本发明进一步通过图5中A所示的实验技术路线对该标记ctgMarker在辅助选择ctg1突变位点的有效性进行验证：以自交系Mo17的回交转育为例，在BC1F1至BC6F1的回交F1代，各随机提取12株叶片DNA，用标记ctgMarker进行PCR反应，能扩出目的条带的数目为6-8株(图5中B)，并在每个世代随机挑选2-3株标记检测为显性的进行自交，自交后代均出现了雄花颖壳不开裂突变单株，且喷施赤霉酸后突变单株雄花颖壳可正常开花散粉，结果表明利用该标记辅助选择ctg1突变位点是有效的，利用该分子标记快速完成了自交系Mo17和B73对该突变性状的回交转育(图5中C)。
对ctg1突变基因的精细定位可开发该突变性状的紧密连锁分子标记，用于在其他自交系中快速转育ctg1突变性状，进一步克隆ctg1突变基因后，则可利用基因定点编辑技术快速完成其他材料中突变性状的形成，促进ctg1突变性状在玉米两系杂交制种中的应用。本发明提供的突变体ctg1以及与突变性状紧密连锁的显性分子标记ctgMarker为玉米两系杂交制种技术提供了材料基础，并加快了玉米杂交制种技术的创新。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种与ctg1突变性状紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO：2-3所示。
3.一种如权利要求2所述的引物对在扩增权利要求1所述的分子标记中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述扩增的体系为：7.5μL的2×PCR Mix、浓度为10μM的上下游引物各0.3μL、浓度为50-200ng/μL的DNA溶液1.5μL和ddH2O5.4μL。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述扩增的程序为：第一步：94℃预变性5min；第二步：94℃变性30s，第三步：58℃退火30s，第四步：72℃延伸30s；重复第二步到第四步，共计35个循环；最后72℃孵育2min，结束程序。
6.一种如权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对在玉米遗传改良中的应用。
7.一种如权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对在玉米两系杂交制种中的应用。
8.一种如权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对在雄性不育制种中的应用。
9.一种如权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物对在辅助选择玉米雄花颖壳闭合性状中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
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| 佚名: "Accession No. XR_004856394.1", GENBANK * |
| 夏远燕: "玉米闭颖突变体基因定位及苗期叶色突变体关键候选基因功能分析", 中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑, vol. 2023, no. 01, pages 047 - 29 * |
| 汪静等: "玉米太空诱变新材料选育的理论与实践", 玉米科学, vol. 30, no. 4, pages 1 - 7 * |
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