CN116790698A - 基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法及其应用 - Google Patents
基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法及其应用，属于基于化学酶法的生物偶联技术领域。本发明合成方法是利用氧化脱羧酶将底物C末端的半胱氨酸转化为烯硫醇结构，再用缓冲液调pH，实现硫醛结构的合成，得到C末端含硫醛结构的产物。所述合成方法得到的硫醛结构可进一步用于肟键类耦联产物、有机膦亲核加成耦联产物或烷氧基胺耦联环肽的合成。本发明解决了醛基引入策略中C末端修饰策略的缺失问题，同时具有较为广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基于化学酶法的生物偶联技术领域，尤其涉及基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法及其应用。
背景技术
生物分子中醛基的选择性引入多采用高碘试剂氧化的方式，该策略的缺点在于只能在生物分子的N端操作，并且高碘试剂的加入可能会引起生物分子性质的改变。
为解决这些问题，近些年又发展出了一系列酶化学催化翻译后修饰的策略。例如，利用甲酰甘氨酸合成酶(FGE)将CxPxR序列中的半胱氨酸(Cys)转化为醛基，再如RadicalSAM酶可以将C/SxA/PxR序列中的半胱氨酸/丝氨酸(Cys/Ser)转化为醛基，以上方案均可以在多肽或蛋白质中原位引入醛基。目前，基于甲酰甘氨酸合成酶(FGE)的SMARTag技术已经在抗体偶联药物领域崭露头角。在该技术中，醛基由甲酰甘氨酸酶引入，随后再将有效载荷通过hydrozino-pictet-spengler(HIPS)反应与醛形成稳定的耦联物，该方法可用于抗体偶联药物的高效合成。虽然该方案有着极大的应用前景，但也存在着明显不足：首先，该方法只能在多肽或蛋白序列内部引入CxPxR序列，Cys的修饰效率可能受到N端氨基酸种类的影响，因此对插入位置的选择有一定要求，其次，修饰后形成的甲酰甘氨酸(FGly)也位于氨基酸序列内部，受氨基酸环境的影响，同样会一定程度上影响下游醛基化学的反应效率。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法及其应用。本发明采用酶化学的方式在多肽/蛋白中原位引入硫醛结构，具体是利用氧化脱羧酶LanD将多肽或蛋白质的C末端Cys(半胱氨酸)转化为硫醛，再基于硫醛/醛基化学，评估了其在生物耦联、探针标记及环肽库构建中的应用前景。本发明所述方法展示了一种在多肽或蛋白C末端引入硫醛的策略，该策略解决了以往醛基引入策略中C末端修饰策略的缺失问题，一定程度上解决了在SMARTag等类似技术中，由于修饰位点在氨基酸序列内部导致的序列插入位点难选择，修饰效率低和耦联效率低等问题。
本发明的技术方案如下：
本发明首先保护一种基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法，即通过氧化脱羧酶将底物C末端的半胱氨酸转化为硫醛结构得到C末端含硫醛结构的产物，具体合成方法为：利用氧化脱羧酶将底物C末端的半胱氨酸转化为烯硫醇结构，再用缓冲液调pH至6.0-8.0实现硫醛结构的合成，得到C末端含硫醛结构的产物。
进一步地，所述具体合成方法为：将底物、氧化脱羧酶混合后，加缓冲溶液调pH至6.0-8.0，置于室温反应30-60min，得到C末端含硫醛结构的产物。
进一步地，所述底物为多肽或以多肽为C端标签的融合蛋白。所述多肽为天然产物生物合成基因簇中，氧化脱羧酶能识别并修饰的前体肽MicA、MicA截短体、MicA突变体或SpaA2-13；所述氧化脱羧酶包括氧化脱羧酶MicD和氧化脱羧酶SpaF。
进一步地，所述以多肽为C端标签的融合蛋白包括但不限于融合蛋白GFP-MicA。
进一步地，所述底物的浓度为10μmol/L-5mmol/L；所述氧化脱羧酶的浓度为20-200μmol/L；所述缓冲溶液为50mmol/L，pH 7.5的HEPES缓冲溶液；所述底物与氧化脱羧酶的物质的量比为5-1200：1。
进一步地，所述氧化脱羧酶包括核糖体肽类天然产物microvionin生物合成中涉及的氧化脱羧酶MicD和核糖体肽类天然产物thiosparsoamide生物合成中涉及的氧化脱羧酶SpaF，也可为其他商业化的氧化脱羧酶。
进一步地，所述氧化脱羧酶可将多肽底物末端的Cys转化为高活性亲电物种，即硫醛。
进一步地，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1-NO.11任一项所示；所述融合蛋白GFP-MicA的序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明还保护一种所述合成方法合成的C末端含硫醛结构的产物。
本发明另外保护一种所述合成方法或所述合成方法得到的C末端含硫醛结构的产物进一步用于肟键类耦联产物、有机膦亲核加成耦联产物或烷氧基胺耦联环肽的合成。
进一步地，所述肟键类耦联产物的合成方法为：将底物、氧化脱羧酶、10eq的烷氧基胺混合后，加缓冲溶液调pH至6.0-8.0，置于室温反应30-60min；反应中，先生成C末端含硫醛结构的产物，再与烷氧基胺反应生成肟键类耦联产物。
进一步地，所述烷氧基胺包括羟胺和O-苄基羟胺。
进一步地，所述有机膦亲核加成耦联产物的合成方法为：将底物、氧化脱羧酶、10eq的有机磷，置于室温反应30-60min；所述有机磷包括三羧乙基磷；反应中，先生成C末端含硫醛结构的产物，再与有机磷反应生成肟键类耦联产物。
进一步地，所述烷氧基胺耦联环肽的合成方法为：将底物、氧化脱羧酶、10eq的NaCNBH3，置于室温反应30-60min；反应中，先生成C末端含硫醛结构的产物，再与NaCNBH3反应生成肟键类耦联产物。
本发明还保护基于上述合成方法合成的硫醛和烷氧基胺的肟化反应在蛋白质或多肽的荧光探针标记制备中的应用。
本发明也保护基于上述合成方法合成的硫醛与亲核试剂三羧乙基磷亲核反应在蛋白质或多肽的荧光探针标记制备中的应用。
本发明还保护基于氰基硼氢化钠还原并稳定氨基与硫醛反应形成的亚胺中间体在构建环肽中的应用。
本发明所用氧化脱羧酶LanD是核糖体肽类天然产物生物合成中一类重要的翻译后修饰酶，其作用于多肽C末端的半胱氨酸。首先(如下反应式所示)，氧化脱羧酶LanD在氧化还原辅因子FAD/FMN(纯化后自带)的作用下对半胱氨酸侧链的巯基进行氧化，随后发生自发的脱羧及电子转移，形成C末端的烯硫醇结构。由于烯醇互变的存在，烯硫醇在中性或酸性条件下很不稳定，极易转化为硫醛，在少数实例中，部分硫醛会进一步水解形成醛基末端。在此声明，本发明主要关注其中的硫醛物种的合成及其下游的修饰策略，醛基的生成及其反应性在本发明中不加以赘述。硫醛相较于醛基，虽然二者结构相似，但硫醛有着更高的可极化性，故而有着更高的反应活性。
本发明基于硫醛的高反应性开发了一系列基于硫醛化学的下游修饰策略：
1)基于硫醛和烷氧基胺的肟化反应，开发了一种蛋白质或多肽的荧光探针标记策略；2)基于硫醛的高亲电性，与亲核试剂三羧乙基磷亲核反应形成较稳定的磷叶立德结构，同样应用于蛋白质或多肽的荧光探针标记；3)基于还原胺化反应，利用氰基硼氢化钠还原并稳定氨基与硫醛反应形成的亚胺中间体，开发构建环肽的策略。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明开发了一种新的化学酶法在蛋白质和多肽中引入硫醛/醛基，相较于以往基于甲酰甘氨酸合成酶和Radical SAM酶的引入方法，该方法可以补充以往化学酶法中不能在C端引入醛基的策略缺失；同时本发明通过氧化脱羧酶高效原位地将多肽/蛋白末端的Cys转化为生物正交反应基团——硫醛/醛基，克服了化学方法引入醛基过程中，产率低，对生物样品的结构功能影响大等不足。
(2)进一步地，本发明利用烷氧基胺与硫醛/醛之间的肟化反应，将含有罗丹明B荧光基团的烷氧基胺通过肟键连接到了模型蛋白上，实现了模型蛋白的荧光标记，证明了氧化脱羧产生的硫醛/醛可用于荧光标记等应用场景。同时，本发明还利用有机磷对硫醛的亲核加成反应，将含有罗丹明B荧光基团的三级膦通过C-P键共价连接到了模型蛋白上，实现了模型蛋白的荧光标记，证明了氧化脱羧产生的硫醛/醛可用于荧光标记等应用场景。此外，本发明还利用氨基与硫醛/醛基的还原胺化反应，以氰基硼氢化钠为还原剂，构建了一系列N端氨基和C端硫醛/醛基形成烷基胺linker的首尾环化环肽，该策略可用于不同大小环肽的构建以及不同序列组成的环肽构建，在生物活性肽库的构建和筛选中有着重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明氧化脱羧酶MicD催化底物多肽MicA末端Cys氧化脱羧生成硫醛产物MicA-a的图。
图中：A、为反应示意图及氧化脱羧前后底物原料和生成产物的一级质谱图；B、为产物MicA-a的二级质谱图。
图2为本发明氧化脱羧酶SpaF的氧化脱羧过程反应示意图及氧化脱羧前后底物原料和生成产物的高分辨LC-MS质谱图。
图3为本发明三羧乙基磷亲核加成硫醛及N-乙基马来酰亚胺衍生加成产物中的巯基的反应示意图及产物的高分辨LC-MS质谱图。
图4为本发明烷氧基胺试剂(羟胺和O-苄基羟胺)与硫醛反应的反应示意图及产物的高分辨LC-MS质谱图。
图5为本发明基于还原胺化反应构建环肽的示意图及环肽鉴定的数据图。
图中：A、为基于还原胺化反应构建稳定的环肽的示意图；B、为加入氰基硼氢化钠前后的MALDI-TOF图；C、为AspN蛋白酶酶切前后质谱图；D、为酸水解衍生后烷基胺linker的一级质谱图。
图6为本发明融合蛋白GFP-MicA被MicD氧化脱羧后生成醛基的示意图及醛基末端的高分辨蛋白质谱数据。
图中：A、为C末端引入多肽标签MicA的融合蛋白GFP-MicA的高分辨蛋白质谱；B、为GFP-MicA被MicD修饰后高分辨质谱图。
图7为本发明两类罗丹明B探针Probe 1和Probe 2的合成路线图。
图中：A、为探针Probe 1的合成路线图；B、为探针Probe 2的合成路线图。
图8为本发明基于三羧乙基磷亲核加成和烷氧基胺肟化反应的荧光探针标记目标蛋白的示意图及SDS-PAGE结果图。
图中：A、为荧光探针标记模型蛋白GFP-MicA的反应示意图；B、为标记结果的SDS-PAGE及荧光成像图。
图9为本发明以截断多肽MicATrunc.-11为底物，应用还原胺化策略构建环肽的示意图及MALDI-TOF数据结果。
图10为本发明以随机多肽Pep-1为底物，应用还原胺化策略构建环肽的示意图及MALDI-TOF数据结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
本发明主要是对目前醛基引入的酶化学策略的补充，相较于N端引入的化学策略和内部(CxPxR)插入策略，基于氧化脱羧酶LanD的C端引入策略只需在C末端插入短肽序列，可操作性更强，更有利于保持蛋白质或多肽的原有性质；除此之外，由于生成的硫醛或进一步水解形成的醛基位于C末端，不易受多肽或蛋白质本身三级结构和空间位阻的影响，更有利于下游基于硫醛/醛基化学的应用的实施。
本发明基于上述硫醛的高反应性开发了一系列基于硫醛化学的下游修饰策略，包括利用硫醛和烷氧基胺的肟化反应，得到肟键类耦联产物，并开发了一种蛋白质或多肽的荧光探针标记策略；基于硫醛的高亲电性，与亲核试剂三羧乙基磷亲核反应形成较稳定的磷叶立德结构，同样应用于蛋白质或多肽的荧光探针标记；以及基于还原胺化反应，利用氰基硼氢化钠还原并稳定氨基与硫醛反应形成的亚胺中间体，开发构建环肽的策略。
本发明的合成路线如下：
其中：AA1至AAn代表氨基酸缩合形成的肽键，且所述肽链的AAn代表肽链C端，n代表肽链的长度，6≤n≤26；
下面通过具体实施例等对本发明作进一步说明，实施例中未特别说明的试剂均为本领域常规试剂。同时实施例中，所用氧化脱羧酶MicD、SpaF可通过大肠杆菌异源表达制备，具体制备方法为：
首先制备含有目标基因的质粒pET-28a-MicD、pET-28a-SpaF：即，将MicD或SpaF的基因插入pET-28a(够自Novagen公司)的载体中。具体如下：为适合大肠杆菌的翻译表达，对NCBI中氧化脱羧酶MicD(GenBank：AVH76813.1)和SpaF(GenBank：WP_065960370.1)的基因序列进行密码子优化，优化后的基因片段分别为SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16，随后由金斯瑞生物科技有限公司分别合成优化后的基因片段并在pET28a载体的酶切位点NdeI和XhoI间插入基因，分别得到含有目标基因的质粒pET-28a-MicD、pET-28a-SpaF。
其中SEQ ID NO.15如下：
ATGGTGCGTGTTACCATGATTGCGACCGGTGCTGTGAGCGCGGCGCACCTGCCGATGTACCTGAGCTGGCTGCGTCGTCGTGATGCGCATGGTCTGGAGCGTATTGTGATGACCCGTAGCGCGGCGCAGTTTGTTAGCCCGCTGAGCCTGCGTAGCATTGCGGGTGTGCCGGTTATTCAAGACGATTGGAACAGCTTTAGCACCGCGGACCTGCACCATGTTGAGCTGGGTGAAACCAGCGATGTGATCCTGGTTTACCCGGCGACCGTGAACTATCTGATGCGTGTTAGCCTGCTGGCGTTTGATACCCCGAGCGTGGCGGCGATTGCGACCGGTGCGTGCACCACCGTTCTGTGCCCGAGCCTGCCGCCGCGTATCATTGAACACCCGCTGTACCTGGCGGCGCGTGATCGTATCCAGGCGGTGCCGCAATATCGTATGGTTGAGCCGGTGGTTGGTGAAAGCCTGGCGAGCGCGGCGCCGGGTAGCGTGCCGCCGCCGCTGTGGGAGCTGTGGCCGGATCTGGAAGGCATGGTTACCCAGCCGTAA。
SEQ ID NO.16如下：
ATGAGCGAACGCGCCGACGGCGCCCAGCGGGCGCTCGCCCAGGTCCGGCTGTTGTGGGGGGTGTGCGGCTCGTTCTCGGCGGTCGCGGTCCCCCATGTGAACGCGTGGCTGCGCGGCACCGTCGGGGTCCAGGAGATCCGCACCGTCATGACCGCGCAGGCCCGCGCCCTCATGGGCCCGCGCATGATCGAGGCCGTCACCGGCCACGCCCCGGTCACCGACTGGGAGGACCACAAGGGCGGAGGCGCCGCCCATGTCGCCCTCGGCGCCTGGGCGGATGTGCTGGTGATCCTGCCGGCCACGGCCAACTTCCTGGCCAAGGCGGCCCACGGCATCGCGGACGACGTCCTGACGGCCACCGTGCTCGCGGCCGAGTGCCCCACCGTCATCGCCCCCGTCATGAACGCGGCCATGTGGTCGAAACCCGCCGTACAGCGCAATGTCGACCAGCTGCGCGAGGACGGCTACCGGATCGTCGAGCCGAAGGAGGGGATCTCCCTCACCGAGGGCCGCCGGGAGCCCGGTTCGCTCGGTGACTTCCAGTCGGCGATCTCCACCGCCCTGATCCAGGCGGCCGCCCGCCGCACCGACCCTCGAGGACAGTGA。
然后，将含有目标基因的质粒pET-28a-MicD和pET-28a-SpaF分别转入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(购自Novagen公司)，在LB平板上进行卡那霉素抗性筛选，获得阳性克隆，挑取单克隆菌落至卡那霉素抗性的LB培养基(加入了50ng/μL的卡那霉素)中，在37℃下，220rpm的摇床中进行培养，等到OD600至0.6-0.8后，将温度降低至18℃，随后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM，在18℃下表达18h。随后使用6000rpm，4℃离心10min，离心获得菌体沉淀，超声破菌，再离心取上清，使用Ni柱纯化，获得氧化脱羧酶MicD或SpaF。氧化脱羧酶的产量均为每升LB培养基可得到5mg蛋白，酶可在-20℃保存1年，在室温下保存一星期以上，活性没有明显降低。
氧化脱羧酶MicD的氨基酸序列SEQ ID NO.13如下：
MGVRVTMIATGAVSAAHLPMYLSWLRRRDAHGLERIVMTRSAAQFVSPLSLRSIAGVPVIQDDWNSFSTADLHHVELGETSDVILVYPATVNYLMRVSLLAFDTPSVAAIATGACTTVLCPSLPPRIIEHPLYLAARDRIQAVPQYRMVEPVVGESLASAAPGSVPPPLWELWPDLEGMVTQPLEHHHHHH；
氧化脱羧酶SpaF的氨基酸序列SEQ ID NO.14如下：
MGSSHHHHHHSQDPMSERADGAQRALAQVRLLWGVCGSFSAVAVPHVNAWLRGTVGVQEIRTVMTAQARALMGPRMIEAVTGHAPVTDWEDHKGGGAAHVALGAWADVLVILPATANFLAKAAHGIADDVLTATVLAAECPTVIAPVMNAAMWSKPAVQRNVDQLREDGYRIVEPKEGISLTEGRREPGSLGDFQSAISTALIQAAARRTDPRGQ。
本发明实施例涉及的氧化脱羧酶MicD的多肽底物为天然产物生物合成基因簇中，MicD可识别并修饰的前体肽MicA、MicA截短体或MicA突变体，MicA氨基酸序列SEQ ID NO.1为：MSLEQLEALDASSEAAEMAASLGSQSC。本发明涉及的氧化脱羧酶SpaF的多肽底物为天然产物生物合成基因簇中，氧化脱羧酶SpaF可识别并修饰的前体肽SpaA的截短体，截短体SpaA2-13的氨基酸序列SEQ ID NO.11为：VMAAAATVAFHC。
所涉及的融合蛋白GFP-MicA同样可以通过大肠杆菌异源表达得到，具体为：首先制备含有目标基因的质粒pET-28a-GFP-MicA：为适合大肠杆菌的翻译表达，对NCBI中绿色荧光蛋白GFP(GenBank：ANC98519.1)和MicA(GenBank：AVH76810.1)的基因序列进行密码子优化，随后将二者拼接形成优化后的基因片段GFP-MicA，MicA位于GFP的C端，优化后的基因片段GFP-MicA为SEQ ID NO.17，随后由金斯瑞生物科技有限公司合成优化后的基因片段并在pET28a载体的酶切位点NdeI和XhoI间插入基因(购自Novagen公司)得到含有目标基因的质粒pET-28a-GFP-MicA。其中，SEQ ID NO.17如下：
ATGAGCGAACGCGCCGACGGCGCCCAGCGGGCGCTCGCCCAGGTCCGGCTGTTGTGGGGGGTGTGCGGCTCGTTCTCGGCGGTCGCGGTCCCCCATGTGAACGCGTGGCTGCGCGGCACCGTCGGGGTCCAGGAGATCCGCACCGTCATGACCGCGCAGGCCCGCGCCCTCATGGGCCCGCGCATGATCGAGGCCGTCACCGGCCACGCCCCGGTCACCGACTGGGAGGACCACAAGGGCGGAGGCGCCGCCCATGTCGCCCTCGGCGCCTGGGCGGATGTGCTGGTGATCCTGCCGGCCACGGCCAACTTCCTGGCCAAGGCGGCCCACGGCATCGCGGACGACGTCCTGACGGCCACCGTGCTCGCGGCCGAGTGCCCCACCGTCATCGCCCCCGTCATGAACGCGGCCATGTGGTCGAAACCCGCCGTACAGCGCAATGTCGACCAGCTGCGCGAGGACGGCTACCGGATCGTCGAGCCGAAGGAGGGGATCTCCCTCACCGAGGGCCGCCGGGAGCCCGGTTCGCTCGGTGACTTCCAGTCGGCGATCTCCACCGCCCTGATCCAGGCGGCCGCCCGCCGCACCGACCCTCGAGGACAGTGA。
然后根据氧化脱羧酶MicD同样的制备方法及条件，将含有目标基因的质粒pET28a-GFP-MicA转入大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，在LB平板上进行卡那霉素抗性筛选，获得阳性克隆，挑取单克隆菌落至卡那霉素抗性的LB培养基(加入了50ng/μL的卡那霉素)中，在37℃下，220rpm的摇床中进行培养，等到OD600至0.6-0.8后，将温度降低至18℃，随后加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM，在18℃下表达18h。随后使用6000rpm，4℃离心10min，离心获得菌体沉淀，超声破菌，再离心取上清，使用Ni柱纯化，获得融合蛋白GFP-MicA。
融合蛋白GFP-MicA的氨基酸序列SEQ ID NO.12如下：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKKHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKANFKVRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKMSLEQLEALDASSEAAEMAASLGSQSC。
实施例1
氧化脱羧酶MicD修饰底物MicA合成硫醛产物MicA-a(合成路线如图1)，结构为：
其合成方法如下：
以多肽底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM多肽底物MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)混合，在室温，pH 7.5条件下反应30min，得到硫醛产物MicA-a，使用高分辨LC-MS检测产物，结果如图1所示，由图1中A图可知，酶修饰后，底物MicA的信号完全消失，只检测到了硫醛产物MicA-a的生成。如图1中B图所示，二级质谱检测到了含硫醛碎片离子y2+-y10+，说明氧化脱羧酶MicD可以催化多肽底物末端Cys近当量地转化为硫醛，也证明了该硫醛合成策略的可行性。
实施例2
基于氧化脱羧酶SpaF修饰底物SpaA2-13合成硫醛产物SpaA2-13-a(合成路线如图2所示)，结构为：
其合成方法如下：
以多肽底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM SpaA2-13，20uM氧化脱羧酶SpaF，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，室温，pH7.5反应30min，得到硫醛产物SpaA2-13-a。MALDI-TOF检测结果如图2所示，底物SpaA2-13的信号完全消失，只检测到了硫醛产物SpaA2-13-a的生成，证明了氧化脱羧酶SpaF同样也可以催化多肽底物末端Cys近当量(质谱上几乎完全转化)地转化为硫醛，也证明了氧化脱羧酶催化Cys合成硫醛策略的可行性。
实施例1-2验证了氧化脱羧酶MicD和SpaF的反应活性，证明了这类酶将多肽末端Cys转化为硫醛/醛的可行性以及优良的转化率，同时氧化脱羧酶MicD的适用性更广，且稳定性更好，因此，本发明后续试验均采用氧化脱羧酶MicD进行合成。基于氧化脱羧酶MicD合成的硫醛的进一步应用如实施例3-5所示。
实施例3
基于氧化脱羧酶MicD合成的硫醛用于与三羧乙基磷亲核加成合成MicA-c(合成路线见图3)，结构为：
其合成方法如下：
以多肽底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM多肽底物MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，1mM(10eq)的三羧乙基磷(TCEP)，室温，pH 7.5反应30min得到产物MicA-c。
高分辨LC-MS检测产物MicA-c。如图3所示，反应体系中没有检测到实施例1中的氧化脱羧产物MicA-a，只检测到了TCEP加成产物MicA-c的分子量，证明氧化脱羧后生成的硫醛被TCEP加成。
为验证生成产物的结构，向MicA-c的反应液中加入1mM(10eq)的N-乙基马来酰亚胺(NEM)，室温反应30min得到MicA-d，用高分辨LC-MS检测。如图3的反应式所示，TCEP加成后的产物MicA-c可以被NEM衍生，生成MicA-d，证明巯基裸露，同时证明氧化脱羧后生成的硫醛被TCEP亲核加成，形成了磷叶立德类似结构。
实施例4
基于氧化脱羧酶MicD合成的硫醛用于与羟胺的肟化反应合成MicA-e(合成路线见图4)，结构为：
其合成方法如下：
以多肽底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM多肽底物MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，1mM(10eq)的羟胺，室温，pH 7.5反应30min得到产物MicA-e，用高分辨LC-MS检测。如图4所示，反应体系中没有检测到实施例1中的硫醛产物MicA-a的分子量，只检测到了亚胺产物MicA-e的分子量，证明氧化脱羧后的生成的硫醛与羟胺发生了肟化反应，从质谱上来看，该反应有近当量的转化效率，同时也证明了基于肟化反应的C端耦联策略的可行性。
实施例5
基于氧化脱羧酶MicD合成的硫醛用于与O-苄基羟胺的肟化反应，合成产物MicA-f(合成路线见图4)，结构为：
其合成方法如下：
以多肽底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM多肽底物MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，1mM(10eq)的O-苄基羟胺，室温，pH 7.5反应30min得到产物MicA-f，用高分辨LC-MS检测。如图4所示，反应体系中没有检测到实例1中的硫醛产物MicA-a的分子量，只检测到了亚胺产物MicA-f的分子量，证明氧化脱羧后的生成的硫醛与O-苄基羟胺发生了肟化反应，从质谱上来看，该反应有近当量的转化效率，同时也证明了基于肟化反应的C端耦联策略的可行性。
实施例6
基于氧化脱羧酶MicD合成的硫醛用于与还原胺化反应，合成分子内首尾连接的环肽MicA-g，其合成路线如图5所示，结构为：
其中：AA1至AAn代表氨基酸缩合形成的肽键，且所述肽链的AAn代表肽链C端，n代表肽链的长度，6≤n≤26。
合成方法如下：
以多肽底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，1mM(10eq)的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，室温，pH7.5反应30min，近当量地得到产物环肽MicA-g，用MALDI-TOF检测(图5中B所示)。
随后为了证明环结构的生成及鉴定其结构单元，利用蛋白酶AspN酶切表征和酸水解试验，其实验方法如下：
蛋白酶AspN酶切：100uM MicA-g，1uM AspN蛋白酶，20mM Tris，pH 8.0，室温孵育1h，然后孵育产物用HRMS分析(图5中C所示)。
酸水解及衍生：在玻璃安瓿瓶中加入环肽底物MciA-g，加入0.2mL的6M盐酸溶液，在110℃下真空反应24h，氮气吹干。随后对水解产物的N端氨基和C端羧基进行衍生化：1)N端乙酰化：加入50uL乙酰氯，150uL乙醇，在110℃下加热30分钟，氮气吹干；2)C端三氟乙酸化：加入100uL二氯甲烷和50uL三氟乙酸酐(TFAA)，在110℃下加热10分钟，氮气吹干。得到的残留物在50uL甲醇中溶解，用HRMS检测(图5中D所示)。
上述检测结果如图5所示。图5中，A、为基于还原胺化反应构建稳定的环肽的示意图；B、为加入氰基硼氢化钠前后的MALDI-TOF图；C、为AspN蛋白酶酶切前后质谱图；D、为酸水解衍生后烷基胺linker的一级质谱图。如图5B所示，加入氰基硼氢化钠后，硫醛产物MicA-a完全消失，只检测到了首尾相接的环肽MicA-g对应的分子量，证明了还原胺化反应的发生。如图5中C和D所示，进一步的酸水解和酶切二级实验检测到了首尾环化形成的烷基胺结构单元或其碎片信号，证明了首尾环化的发生，同时也证明了硫醛和N端氨基发生还原胺化反应，构建环肽策略的可行性。
实施例3-6表明了使用实施例1的氧化脱羧后合成的C末端硫醛可以实现亲核加成反应、肟化反应和N端氨基的还原胺化反应。下面进一步基于上述实验进行应用，具体见实施例7-10。
实施例7
本实施例在荧光蛋白GFP末端引入了含Cys的多肽片段得到融合蛋白底物GFP-MicA，该多肽片段可以被氧化脱羧酶MicD识别并修饰。合成路线如图6所示，合成方法为：氧化脱羧酶MicD修饰融合蛋白底物GFP-MicA，合成硫醛产物GFP-MicA-a，其反应历程及结构为(GFP-MicA-b为其水解产物)：
其合成的具体步骤如下：
以底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，100μM融合蛋白底物GFP-MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，室温，pH 7.5反应30min近当量地得到硫醛产物GFP-MicA-a，用高分辨蛋白质谱检测。如图6中B图所示，氧化脱羧酶MicD修饰后，融合蛋白底物GFP-MicA的信号完全消失，只能检测到氧化脱羧再水解生成醛基产物GFP-MicA-b(GFP-MciA-a水解产物)的信号，证明氧化脱羧酶MicD可以高效地对底物进行氧化脱羧，同时证明了该硫醛/醛基引入策略在蛋白质中的可行性。
实施例8
构建荧光探针Probe 1和Probe 2，其结构如下所示，合成路线如图7所示。
具体合成方法为：
以罗丹明B为荧光显色团，三羧乙基磷或羟胺分别作为与硫醛反应的把手，合成罗丹明B荧光探针Probe 1：RB-PEG2-TCEP或Probe 2：RB-PEG2-ONH2，具体方法如下：
(1)制备产物3：
称取罗丹明B(1.0mmol，479.0mg)和(3H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基六氟磷酸盐(PyAOP)(1.2mmol，625.7mg)到50mL圆底烧瓶中，加入10mL DMF搅拌溶解，随后顺次加入DIPEA(2.4mmol，310.2mg)和N-Boc-2,2’-(亚乙二氧基)二乙胺(2mmol，496.6mg)，室温搅拌2h，反应液用半制备型HPLC纯化，冻干机冻干，得到粉色固体3(132.0mg，分离收率18％)。
(2)制备产物4：
将上一步产物3(0.087mmol，62.0mg)用DCM/TFA混合溶液(1：1，10mL)溶解，室温反应1h，脱除Boc保护基，随后用半制备型HPLC纯化冻干，得到粉色固体产物4(40.2mg，回收产率75.6％)。
(3)Probe 1：RB-PEG2-TCEP的合成：
将上一步产物4(0.072mmol，44.0mg)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCI)(0.259mmol，49.7mg)及1-羟基-7-叠氮苯并三唑(HOAt)(0.259mmol，35.0mg)溶解于1.5mL的DMF，置于25mL的圆底烧瓶中，随后向体系中加入DIPEA(0.432mmol，55.8mg)和三羧乙基磷(TCEP)(0.216mmol，61.9mg)(化合物5)，室温搅拌0.5h，随后使用半制备型HPLC分离纯化后冻干，得到粉色产物6，即荧光探针Probe 1：RB-PEG2-TCEP(32.0mg，回收产率52.9％)。产物6的HRMS结果如图7中A所示。
(4)Probe 2：RB-PEG2-ONH2的合成：
将(Boc-氨基酸氧基)乙酸(0.132mmol，25.2mg)(化合物7)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDCI)(0.158mmol，30.4mg)及1-羟基苯并三唑(HOBt)溶解于1.5mL的DMF中，置于25mL圆底烧瓶中搅拌溶解，随后加入产物4(0.066mmol，40.1mg)，室温搅拌0.5h，使用半制备型HPLC纯化后冻干，得到粉色产物8(34mg，回收产物65.9％)。
将产物8(0.048mmol，34mg)用DCM/TFA混合溶液(5：1，10mL)溶解，0℃下反应5h，脱除Boc保护基，随后用半制备型HPLC纯化后冻干，得到粉色固体产物9即荧光探针Probe 2：RB-PEG2-ONH2(27mg，回收产率81.3％)。
实施例9
基于肟化反应的蛋白质荧光标记策略，其合成的具体方法为：
以底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM融合蛋白底物GFP-MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，1mM(10eq)的羟胺罗丹明B探针Probe2(RB-PEG2-ONH2)，室温反应30min得到被探针Probe 2标记的蛋白，进行SDS-PAGE及荧光成像检测。如图8所示，只有同时加入氧化脱羧酶MicD和罗丹明B荧光探针的实验组才能检测到明显的荧光信号，证明了基于肟化反应的蛋白质荧光标记策略的可行性。
实施例10
基于亲核加成反应的蛋白质荧光标记策略，其合成的具体方法为：
以底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM融合蛋白底物GFP-MicA，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)，1mM(10eq)的三羧乙基磷罗丹明B探针Probe 1(RB-PEG2-TCEP)，室温反应30min得到被探针Probe 1标记的蛋白，进行SDS-PAGE及荧光成像检测。如图8所示，只有同时加入氧化脱羧酶MicD和罗丹明B荧光探针的实验组才能检测到明显的荧光信号，证明了基于亲核加成的蛋白质荧光标记策略的可行性。
实施例9-10证明了基于肟化反应和三级膦亲核加成反应的荧光标记策略的可行性，同时也证明了制备的三羧乙基磷和羟胺的罗丹明B荧光探针在蛋白质荧光标记策略中的可行性。
实施例11-19
实施例11-19考察用不同长度多肽及不同多肽构建环肽，具体如表1所示，选取不同N端突变(实施例11-12)、N端截断(实施例13-17)或随机设计(实施例18-19)的MicA多肽序列，阐述还原胺化反应的环肽构建策略的可行性。
以实施例14为例阐述基于还原胺化反应的环肽构建策略，具体方法为：
以底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM MicAtrunc.-11，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM NaHCO3缓冲液(pH 9.5)室温反应30min，MALDI-TOF结果证明，得到了硫醛产物MicAtrunc.-11-a，随后使用50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)调pH至7.5，再加入1mM(10eq)的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，室温反应30min，MALDI-TOF结果证明得到了环化产物MicAtrunc.-11-g。综上证明了还原胺化策略构建首尾相连的环肽的可行性。
以实施例18为例阐述基于还原胺化反应的环肽构建策略，具体方法为：
以底物与氧化脱羧酶物质的量比为5:1，将100μM Pep-1，20μM氧化脱羧酶MicD，50mM NaHCO3缓冲液(pH 9.5)室温反应30min，MALDI-TOF结果证明，得到了硫醛产物Pep-1-a，随后使用50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)调pH至7.5，再加入1mM(10eq)的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)，室温反应30min，MALDI-TOF结果证明，得到了环化产物Pep-1-g。综上，本发明证明了还原胺化策略构建首尾相连的环肽的可行性。
实施例11-13及15-17、19的方法同实施例14，所述实施例11-19所用多肽的序列如SEQ ID NO.2-NO.10，即，MicAM-19W的多肽序列如SEQ ID NO.2；MicAM-19S的多肽序列如SEQID NO.3；MicAtrunc.-16的多肽序列如SEQ ID NO.4；MicAtrunc.-11的多肽序列如SEQ ID NO.5；MicAtrunc.-5的多肽序列如SEQ ID NO.6；MicAtrunc.1的多肽序列如SEQ ID NO.7；MicAtrunc.3的多肽序列如SEQ ID NO.8；Pep-1的多肽序列如SEQ ID NO.9；Pep-2的多肽序列如SEQ IDNO.10。
表1实施例11-19所述环肽构建用底物及序列
| 实施例 | 多肽 | 氨基酸序列 | NaBH3CN | 是否环化 |
| 11 | MicAM-19W | WSLEQLEALDASSEAAEMA-ASLGSQSC | + | √ |
| 12 | MicAM-19S | SSLEQLEALDASSEAAEMA-ASLGSQSC | + | √ |
| 13 | MicAtrunc.-16 | EQLEALDASSEAAEMA-ASLGSQSC | + | √ |
| 14 | MicAtrunc.-11 | LDASSEAAEMA-ASLGSQSC | + | √ |
| 15 | MicAtrunc.-5 | AAEMA-ASLGSQSC | + | √ |
| 16 | MicAtrunc.1 | ASLGSQSC | + | √ |
| 17 | MicAtrunc.3 | LGSQSC | + | √ |
| 18 | Pep-1 | FNSYCC | + | √ |
| 19 | Pep-2 | TWYYGC | + | √ |
本发明实施例11-19测试了还原胺化反应在环肽构建策略中的应用，测试了多条底物多肽的环化效果，其中包含了不同长度的底物和两条随机设计的氨基酸序列(Pep-1和Pep-2)，由表1可知，所有序列均实现了环化效果；同时MALDI-TOF质谱表征证明(图9-10)，在没有NaCNBH3的存在下只能检测到硫醛产物的生成，而加入了NaCNBH3后，硫醛产物近当量的转化为了首尾环化的产物，证明了基于氧化脱羧酶构建环肽的可行性。
本发明利用氧化脱羧酶MicD成功实现了将多肽末端Cys转化为硫醛，并基于醛基化学(肟化反应、亲核加成和还原胺化反应)，实现了蛋白质的荧光探针标记和环肽的构建(5-27肽)，发展了一类新的酶化学方法引入硫醛的策略，丰富了在蛋白/多肽中引入醛基的策略的多样性。
此外，本发明使用的氧化脱羧酶MicD、SpaF和融合蛋白GFP-MicA均通过大肠杆菌发酵表达得到，获取途径简单、产量高，并且所获得的酶稳定性好，可高效原位地将多肽/蛋白末端的Cys转化为生物正交反应基团——硫醛/醛基，克服了化学方法引入醛基过程中产率低，对生物样品的结构功能影响大等不足。同时，本发明对基于氧化脱羧酶的硫醛引入策略进行了生物耦联和环肽构建的应用研究，证明了氧化脱羧酶催化原位生成的硫醛/醛基有着极大的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.基于氧化脱羧酶的硫醛合成方法，其特征在于，所述合成方法是利用氧化脱羧酶将底物C末端的半胱氨酸转化为烯硫醇结构，再用缓冲液调pH至6.0-8.0实现硫醛结构的合成，得到C末端含硫醛结构的产物。
2.根据权利要求1所述的合成方法，具体合成方法为：将底物、氧化脱羧酶混合后，加缓冲溶液调pH至6.0-8.0，置于室温反应30-60min，得到C末端含硫醛结构的产物；所述底物为多肽或以多肽为C端标签的融合蛋白；所述多肽为天然产物生物合成基因簇中，氧化脱羧酶能识别并修饰的前体肽MicA、MicA截短体、MicA突变体或SpaA2-13；所述氧化脱羧酶包括氧化脱羧酶MicD和氧化脱羧酶SpaF。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述底物浓度为10μmol/L-5mmol/L；所述氧化脱羧酶的浓度为20-200μmol/L；所述底物与氧化脱羧酶的物质的量比为5-1200：1。
4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1-NO.11任一项所示。
5.一种权利要求1-4任一项所述合成方法合成的C末端含硫醛结构的产物。
6.一种权利要求1-4任一项所述合成方法的应用，其特征在于，所述合成方法用于肟键类耦联产物、有机膦亲核加成耦联产物或烷氧基胺耦联环肽的合成。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肟键类耦联产物的合成方法为：将底物、氧化脱羧酶、10eq的烷氧基胺混合后，加缓冲溶液调pH至6.0-8.0，置于室温反应30-60min；所述烷氧基胺包括羟胺和O-苄基羟胺。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述有机膦亲核加成耦联产物的合成方法为：将底物、氧化脱羧酶、10eq的有机磷混合后，加缓冲溶液调pH至6.0-8.0，置于室温反应30-60min；所述有机磷包括三羧乙基磷。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述烷氧基胺耦联环肽的合成方法为：将底物、氧化脱羧酶、10eq的NaCNBH3混合后，加缓冲溶液调pH至6.0-8.0，置于室温反应30-60min。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040063115A1 (en) * | 2001-12-04 | 2004-04-01 | Tang Y Tom | Enzymes |
| EP1681303A1 (en) * | 2002-09-11 | 2006-07-19 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
| US20100136595A1 (en) * | 2008-11-17 | 2010-06-03 | Board Of Regents Of The Nevada System Of High Education On | Hydrocarbon-forming oxidative decarbonylase enzyme, hydrocarbons produced thereby, and method of use |
| WO2013096898A2 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Invista North America S.A.R.L. | Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters |
| CN106795534A (zh) * | 2014-06-16 | 2017-05-31 | 英威达技术有限责任公司 | 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞 |
| US20170166931A1 (en) * | 2014-07-03 | 2017-06-15 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for producing 4c-5c compounds with unsaturation and methods related thereto |
| US20180051276A1 (en) * | 2014-12-22 | 2018-02-22 | Lanthiopep B.V. | Novel methods for displaying cyclic peptides on bacteriophage particles |
| US20180118791A1 (en) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | The Texas A&M University System | Modified lantibiotics and methods of making and using the modified lantibiotics |
| US20200292555A1 (en) * | 2015-10-22 | 2020-09-17 | The Scripps Research Institute | Cysteine reactive probes and uses thereof |
| CN113683590A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-23 | 南京大学 | 具有阿扎菲酮结构的偶联试剂及其在制备多肽、蛋白质偶联物中的应用 |
-
2023
- 2023-06-21 CN CN202310749088.6A patent/CN116790698B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040063115A1 (en) * | 2001-12-04 | 2004-04-01 | Tang Y Tom | Enzymes |
| EP1681303A1 (en) * | 2002-09-11 | 2006-07-19 | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | HASylated polypeptides, especially HASylated erythropoietin |
| US20100136595A1 (en) * | 2008-11-17 | 2010-06-03 | Board Of Regents Of The Nevada System Of High Education On | Hydrocarbon-forming oxidative decarbonylase enzyme, hydrocarbons produced thereby, and method of use |
| WO2013096898A2 (en) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Invista North America S.A.R.L. | Bioconversion process for producing nylon-7, nylon-7,7 and polyesters |
| CN106795534A (zh) * | 2014-06-16 | 2017-05-31 | 英威达技术有限责任公司 | 用于生物合成化合物的方法、试剂和细胞 |
| US20170166931A1 (en) * | 2014-07-03 | 2017-06-15 | Genomatica, Inc. | Microorganisms for producing 4c-5c compounds with unsaturation and methods related thereto |
| US20180051276A1 (en) * | 2014-12-22 | 2018-02-22 | Lanthiopep B.V. | Novel methods for displaying cyclic peptides on bacteriophage particles |
| US20200292555A1 (en) * | 2015-10-22 | 2020-09-17 | The Scripps Research Institute | Cysteine reactive probes and uses thereof |
| US20180118791A1 (en) * | 2016-10-28 | 2018-05-03 | The Texas A&M University System | Modified lantibiotics and methods of making and using the modified lantibiotics |
| CN113683590A (zh) * | 2021-08-23 | 2021-11-23 | 南京大学 | 具有阿扎菲酮结构的偶联试剂及其在制备多肽、蛋白质偶联物中的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| CHAMPAK CHATTERJEE等: "Biosynthesis and Mode of Action of Lantibiotics", CHEM. REV., vol. 105, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 633 - 683 * |
| JINGXIA LU等: "The Utilization of Lanthipeptide Synthetases Is a General Strategy for the Biosynthesis of 2-Aminovinyl-Cysteine Motifs in Thioamitides", ANGEW. CHEM. INT. ED., vol. 60, no. 4, 16 October 2020 (2020-10-16), pages 1951 - 1958 * |
| YINZHENG XIA等: "Enzymatic Generation of Thioaldehyde Motifs by Flavin-Dependent Cysteine Decarboxylases for Peptide Bioconjugation and Macrocyclization", ORG. LETT., vol. 25, no. 32, 7 August 2023 (2023-08-07), pages 6035 - 6039 * |
| 王环愿等: "Tyr163 和Tyr223 硝基化修饰参与同型半胱氨酸诱导的胱硫醚β-合酶失活", 中南医学科学杂志, vol. 45, no. 1, 31 January 2017 (2017-01-31), pages 27 - 31 * |
| 许城玉等: "《基础化学速成》", 30 November 2021, 东南大学出版社, pages: 189 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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