CN116789828A - 一种抗cd132的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗cd132的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗CD132的单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体特异性结合人CD132，其包含分别如SEQ ID NO:39‑41所示的氨基酸序列的轻链可变区LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及分别如SEQ ID NO:34‑36所示的氨基酸序列的重链可变区HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明得到的抗CD32的单克隆抗体，其特异性高、亲和力强，可以选择性抑制IL7、IL15、IL21和/或IL9，可在制备用于预防、中和或治疗与IL‑7、IL‑15、IL‑21和/或IL‑9细胞因子受体相关的自身免疫性疾病治疗药物的应用中。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗CD132的单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD132，是，因此也被称为γc(共同细胞因子受体γ链)。γc参与这些细胞因子受体的信号转导以及配体结合。每个γc细胞因子诱导其细胞因子特异性受体链的细胞质结构域与γc并联，以激活JAK1和JAK3，随后磷酸化STAT蛋白。IL-2、IL-7、IL-9和IL-15主要激活STAT5A和STAT5B，IL-4主要激活STAT6，IL-21主要激活STAT3。
γc家族细胞因子共同调控淋巴细胞生长、发育、分化和存活等多个方面，这些细胞因子在临床上具有重要意义，与过敏和自身免疫疾病、癌症以及免疫缺陷有关。γc基因(IL2RG)位于染色体Xq13上，在患有X连锁重症联合免疫缺陷(X-linked severe combinedimmunodeficiency，X-SCID)的患者中存在IL2RG突变。X-SCID是一种以无功能B细胞和T细胞以及NK细胞缺失为特征的疾病，患者表现出严重的免疫缺陷。
近些年，阻断IL-21信号通路已被用于SLE，类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，RA)，I型糖尿病(Type 1diabetes T1D)和银屑病小鼠模型的治疗方案研究。此外IL-9、IL-15和IL-7也与其他多种自身免疫性疾病有关，包括多发性硬化(Mμltiplesclerosis，MS)、RA、SLE、干燥综合征(Sjogren's syndrome，SS)等。IL-4和IL-9信号通路的阻断可显著改善哮喘、特应性皮炎等过敏性疾病的症状。系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus，SLE)患者体内存在异常功能状态的IL-2、IL-21、IL-15、IL-7、IL-9和IL-21，且在狼疮小鼠模型中，封闭γc受体可以显著改善小鼠尿蛋白、肌酐水平，并且降低抗双链DNA，提高小鼠生存率。
综上所述，以CD132为靶点是自身免疫性疾病，尤其是系统性红斑狼疮患者治疗的新方向，本发明目的在于提供特异性高、亲和力强的抗CD32的单克隆抗体，有助于抗CD132治疗的进一步发展，并提供更多临床和科研的检测选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种特异性高、亲和力强的抗CD132的单克隆抗体及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种抗CD132的单克隆抗体43G4，所述的单克隆抗体特异性结合人CD132，该抗体由轻链和重链组成，其中，所述轻链的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如为SEQ ID NO:39-41所示；所述重链的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:34-36所示。
其中，所述的人CD132，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
其中，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。
进一步的，所述的单克隆抗体为IgG4亚型，κ轻链。
进一步的，所述得单克隆抗体的轻链恒定区和所述的单克隆抗体的重链恒定区为人源。
进一步的，所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；所述的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。
本发明的第二方面提供了一种编码上述单克隆抗体的核苷酸分子，所述核苷酸分子包括编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核苷酸序列。
本发明的第三方面提供了一种表达上述核苷酸分子的重组DNA表达载体。
其中，所述的重组DNA表达载体的DNA序列中包含编码抗CD132抗体的上述重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。
其中，所述的表达载体为pHCT1s载体，购于Addgene。
本发明的第四方面提供了含有上述核酸分子或重组DNA表达载体的宿主细胞。
其中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选哺乳动物细胞中的CHO细胞。
上述单克隆抗体在制备用于预防、中和或治疗自身免疫性疾病治疗药物中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的自身免疫性疾病为与IL-7、IL-15、IL-21和/或IL-9细胞因子受体相关的免疫性疾病。
具体的，在本发明的一些实施例中，嵌合体抗CD132抗体43G4可以抑制IL-15和IL-21刺激NK92细胞释放IFN-γ；可以抑制IL7和IL15刺激人外周血CD4+细胞下游STAT5磷酸化以及IL21刺激人外周血CD4+细胞下游STAT3磷酸化；可以抑制IL9刺激M07E细胞增殖。
有益效果：本发明通过杂交瘤筛选的方式，获得了一种可以靶向CD132的单克隆嵌合体，该抗体亲和力强，可以选择性抑制IL7、IL15、IL21和/或IL9，因此有助于制备用于预防、中和或治疗与IL-7、IL-15、IL-21和/或IL-9细胞因子受体相关的自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、狼疮肾炎等)治疗药物中，并提供更多临床和科研的检测选择，具有一定的应用价值。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1HEK293细胞重组表达的人CD132胞外区蛋白抗原
图2杂交瘤上清在恒定IL15刺激下对报告细胞信号强度的抑制
图3纯化鼠源化抗CD132抗体在恒定IL15刺激下对报告细胞信号强度的抑制
图4-1嵌合体抗CD132抗体43G4在恒定IL15刺激下对NK92细胞分泌IFN-γ的抑制
图4-2嵌合体抗CD132抗体43G4在恒定IL21刺激下对NK92细胞分泌IFN-γ的抑制
图5-1嵌合体抗CD132抗体43G4在恒定IL7刺激下对人CD3+T细胞STAT磷酸化的抑制
图5-2嵌合体抗CD132抗体43G4在恒定IL15刺激下对人CD3+T细胞STAT磷酸化的抑制
图5-3嵌合体抗CD132抗体43G4在恒定IL21刺激下对人CD3+T细胞STAT磷酸化的抑制
图6嵌合体抗CD132抗体43G4在恒定IL9刺激下抑制M07E细胞增殖
图7嵌合体抗CD132抗体43G4不能抑制IL-4刺激Ramos细胞表达CD23
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明的实施例中主要涉及的培养基及缓冲液配方如下：DMEM完全培养基(DMEM培养基+10％胎牛血清)，PBS缓冲液，PBST缓冲液(PBS+0.05％Twen-20)，Elisa洗液(0.5％BSA+PBS)，普诺赛NK92细胞生长培养基(MEMα+0.2mM肌醇+12.5％马血清+12.5％胎牛血清+0.1mM 2ME)，RPMI 1640培养基，M07E增殖实验培养基(RPMI 1640培养基+5％FBS)，流式缓冲液(4％小牛血清+PBS)，流式封闭液(流式缓冲液+100μg/ml hIgG)
实施例1：人CD132重组蛋白制备
PCR扩增克隆“人CD132”(Leu23-Ala262)基因序列(购于义翘神州，货号HG10555-M)，在上游引入Bam H I内切酶位点，在下游引入Xho I内切酶位点。PCR反应体系见表1，PCR反应条件见表2。
表1PCR反应体系
| cDNA | 2μl |
| IL21上游引物：5’-atgttgaagccatcattaccattca-3’ | 1μl |
| IL21下游引物：5’-cgtggttatctctgttggctccatggg-3’ | 1μl |
| Taq plus master mix | 10μl |
| 无酶水 | 6μl |
表2PCR反应条件
采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工公司，B518131-0050)，通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的片段条带与其他杂带分开，将含目的片段的琼脂糖凝胶块切下，按照标准DNA吸附柱回收步骤将得到的CD132 cDNA于-20℃保存。选择真核表达质粒pSect-Nhis，通过表3连接加样体系得到pSect-Nhis-CD132重组质粒。
表3连接加样体系
| 加样物 | 体积 |
| 真核表达质粒pSect-Nhis | 12μl |
| CD132cDNA | 4μl |
| T4 Ligase酶 | 2μl |
| 10×Buffer | 2μl |
| 总计 | 20μl |
将目的片段和pSect-Nhis-CD132载体片段的重组质粒送公司测序，测序结果表明重组质粒pSect-Nhis-CD132构建成功。
通过300μl聚乙烯亚胺PEI(购于biohub)携带验证成功的100μl重组质粒(PEI：重组质粒体积比＝3：1)瞬转入3×107个293细胞中(购于ATCC)，在37℃，5％CO2条件下培养4天。培养结束后将发酵液在4℃、4500rpm条件下离心30min，用0.22μm针头滤器过滤上清液。采用镍柱亲和层析纯化发酵液，然后换液到PBS缓冲液中。如图1所示人CD132(cHis)重组蛋白SDS-PAGE结果。从图1中可以看出纯化后CD132重组蛋白纯度达到95％，目的条带位于55kDa左右，符合预期。所述的人CD132重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
LNTTILTPNGNEDTTADFFLTTMPTDSLSVSTLPLPEVQCFVFNVEYMNCTWNSSSEPQPTNLTLHYWYKNSDNDKVQKCSHYLFSEEITSGCQLQKKEIHLYQTFVVQLQDPREPRRQATQMLKLQNLVIPWAPENLTLHKLSESQLELNWNNRFLNHCLEHLVQYRTDWDHSWTEQSVDYRHKFSLPSVDGQKRYTFRVRSRFNPLCGSAQHWSEWSHPIHWGSNTSKENPFLFALEA
实施例2：构建人Ba/F3-hCD132稳转细胞株
将Ba/F3细胞(购于ATCC)于37℃在5％CO2中孵育，在含有10％胎牛血清、50μM2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml青霉素-链霉素和10ng/ml小鼠IL-3的RPMI-1640培养基中培养，备用。将表达人CD132的慢病毒表达载体(广州复能基因有限公司，EX-W0156-Lv105-B)，通过Lenti-PacHIV慢病毒包装试剂盒上的步骤(广州复能基因有限公司)包装慢病毒并转染Ba/F3细胞，然后加入嘌呤霉素(100ug/ml)进行抗性筛选，得到能够稳定表达人CD132的细胞株Ba/F3-hCD132。
实施例3：动物免疫
选择6周龄雌性Balb/C小鼠进行免疫，以人CD132重组蛋白作为抗原，每只小鼠每次免疫50μg抗原，将抗原与弗氏佐剂等体积混合后进行皮下免疫。每两周免疫一次，四次免疫后，尾部取血测血清效价；或者初次免疫后，每隔一周使用基因枪进行加强免疫，以人CD132表达质粒混合金粉，在400psi压力下，对小鼠腹部裸露皮肤进行轰击，共免疫9次。
实施例4：抗体筛选
(1)制备小鼠杂交瘤细胞
用15μg/100μl的人CD132重组蛋白微静脉注射入每一只小鼠体内进行冲击免疫，四天后取小鼠淋巴结及脾脏，在DMEM中研磨后得到B细胞悬浮液，取B细胞悬浮液和SP2/0，按照1:1的比例充分混匀后，用电融合仪(BTX公司)进行细胞融合(110v，30s)。将融合后的细胞置于含有HAT的DMEM完全培养基中，在5％CO2，37℃条件下进行培养，一周左右开始观察杂交瘤细胞的生长情况，待其长至60％以上时取上清进行ELISA检测。
(2)酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选
在96孔酶标板上包被1μg/ml的人CD132重组蛋白，4℃过夜。用PBS洗三次，每孔加入200μL含有2％脱脂牛奶的PBS封闭1小时。然后PBS洗一次后，每孔加入100μL杂交瘤细胞上清，室温孵育60分钟。接着，用PBST(PBS+0.05％Twen-20)和PBS各洗3遍后，每孔加入100μL HRP标记的抗人IgGFc二抗(购于JacksonImmunoResearch公司)，室温孵育60分钟。最后，用PBST和PBS各洗三遍后，每孔加入100μL TMB底物37℃显色10分钟后，以每孔50μL 2M硫酸溶液终止反应，并在450nm波长处读取吸光度。
(3)细胞筛选鼠源化抗CD132抗体
将步骤(2)经ELISA检测到的结合CD132抗体的阳性克隆上清，进一步验证与CD132阳性细胞的结合。将实施例2构建的Ba/f3-hCD132稳转细胞株，分别按5×104/孔细胞数，加入96孔板中，每孔再加入50μL验证成功的杂交瘤上清，4℃孵育60分钟，离心弃上清，用0.5％BSA/PBS洗涤，再加入50μL二抗溶液(抗-mouseIgG-Fc-AF647，购于JacksonImmunoResearch，Cat:115-606-071)，4℃孵育45分钟，之后用0.5％BSA/PBS洗去多余的二抗，加入PBS重悬细胞，上流式细胞仪采用流式细胞荧光分选技术(FACS)检测，发现有130个克隆号与抗原CD132有结合。
实施例5：评估鼠源化抗CD132抗体对细胞因子信号传导的抑制
IL-15通过JAK-STAT通路进行信号传导，CD122(IL-2Rβ)参与CD132受体复合物的信号传递，当IL-15结合CD132后，通过与CD122形成异源二聚体受体复合物，CD122胞内段的JAK1和CD132胞内段的JAK3发生磷酸化，激活下游信号分子，从而向细胞内部传导活化信号。
因此，为了评估鼠源化抗CD132抗体对细胞因子信号传导的抑制，使用含有稳定表达萤光素酶报道子(STAT5-Luc)的HEK293细胞(人胚肾细胞系，ATCC)开发一种生物测定。依次用含有JAKSTAT5b、CD122、CD132的慢病毒转染HEK293细胞，并用硫新霉素、灭瘟素、嘌呤霉素共同选择和维持稳定表达的细胞，最终得到了一株稳转细胞HEK293-JAKSTAT5b-CD122-CD132。随后合成含5个STAT5应答元件(AGTTCTGAGAAAAGT)的核苷酸序列，通过限制性内切酶KpnI、HindIII克隆到pGL4.22-luc2P(Promega，E6761)，同时将hygro抗性基因克隆到载体中并替换Puro抗性基因，得到pGL4.22-luc2pSTAT5RE-hygro重组质粒。将3μg重组质粒与含有5×106个HEK293-JAKSTAT5b-CD122-CD132稳转细胞混合后进行电转染(电转染条件：300v，30ms)。使用潮霉素(浓度200μg/ml)加压筛选一段时间后，稳转细胞形成克隆，所得细胞系称为HEK293-STATluc-JAKSTAT5b-CD122-CD132，以下简称报告细胞。
用DMEM+10％FBS完全培养基在96孔板中每孔平板接种2×104个报告细胞，并于37℃在5％CO2中孵育过夜。第二天，将实施例4中FACS和ELISA反应阳性的杂交瘤细胞上清添加到孵育过夜的细胞中并继续孵育30分钟。孵育后，将IL15配体以110pM的终浓度加到细胞中。在37℃下，5％CO2中孵育6小时之后，用Bio-LiteTM试剂(Vazyme Biotech，DD1201-02)和SpectraMax多标记读板器(Molecμlar Devices)测量萤光素酶活性，测试实施例4筛选出的鼠源化抗CD132抗体对IL-15信号传导的抑制，结果如图2所示，垂直蓝色虚线右侧的7个克隆号显示对IL15刺激报告细胞信号通路下游激活有显著抑制作用。
实施例6：鼠源化抗CD132抗体的纯化
综合实施例5的结果和杂交瘤细胞状态，进一步筛选出4株对报告细胞刺激信号有显著抑制的杂交瘤细胞(42E19、60J22、43G4和44I16)进行扩大培养，分别收集细胞上清，使用Protein G(博格隆生物技术有限公司，AA0144)和Protein A(博格隆生物技术有限公司，AA0275)进行蛋白纯化。各取1.5ml Protein G和Protein A以1:1的体积比混合加入3个亲和层析柱内，离心。用30ml 4℃预冷PBS洗涤并平衡纯化柱。将4℃的稀释样本少量多次加入纯化柱。待样本过柱后，用3ml 4℃预冷PBS洗涤去除未结合和非特异性结合的蛋白。测定流出液在280nm处的OD值。以含50mM甘氨酸的PBS且经盐酸调节pH2.7作为洗脱液。用1ml 4℃预冷的洗脱液洗脱结合的抗体，直到流出液在280nm的OD值减少为基线水平。每个收集管中预先加入1M Tris-HCl 100μl，每管收集1ml洗脱下的抗体立即混匀，得到纯化后的鼠源化抗CD132抗体。
实施例7：使用报告细胞进行纯化鼠源化抗体生物测定
将实施例6中所得纯化鼠源化抗体行定量阻断活性实验。
用DMEM+10％FBS完全培养基在96孔板中每孔平板接种2×104个报告细胞，并于37℃在5％CO2中孵育过夜。第二天，将纯化后的抗CD132抗体在测定缓冲液中从200nM至0.06nM连续稀释，添加到细胞并孵育30分钟。孵育后，将IL-15配体以110pM的终浓度加到细胞中。在37℃下，5％CO2中孵育6小时之后，用Bio-LiteTM试剂(Vazyme Biotech，DD1201-02)和SpectraMax多标记读板器(Molecμlar Devices)测量萤光素酶活性，测试纯化后的鼠源化抗CD132抗体对IL-15信号传导的抑制。用Prism5软件使用非线性回归对结果进行分析，得到IC50值，结果见下表1和图3。
表1使用报告细胞进行的生物测定中5种抗CD132抗体对CD132信号传导的阻断
| IC50(M) | IL15(110pM) |
| 42E19 | WB |
| 44I16 | 0.89E-09 |
| 43G4 | 3.55E-09 |
| 60J22 | NB |
结果表明，表1和图3中展示的4种抗CD132抗体中，只有1种(43G4)显著抑制了CD132的激活，其余3种抗体对IL-15配体的CD132激活无抑制或者抑制不显著。
实施例8：嵌合体抗CD132抗体的基因克隆和表达
选择实施例7中的所有杂交瘤单克隆，采用TRNzol裂解法分别提取细胞总RNA，然后利用逆转录试剂盒(Invitrogen，货号18080051)合成单链cDNA后，以此为模板扩增杂交瘤单克隆细胞中抗体的可变区序列，经测序后，得到的候选阳性克隆重链和轻链可变区序列如表2所示。
表2 CD132鼠源抗体的可变区序列(数字前面省略SEQ ID NO.**)
(1)克隆42E19：
42E19重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.4、5、6所示。
核苷酸序列
GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGACTTCTGGATTCACGATCACTGAATACACCATGCACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGGTACTGATCCTAACACTGGTGGCACTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCTCATTGACTGTCGACAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGAGGATTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAAGAAACTATTACTACGGTAGTAACTTCAACTACTGGGGCCGAGGCACCAgTCTCACAGTCTCCTCA
42E19轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.9、10、11所示。
核苷酸序列
GATGTTTTGATGATCCAATCTCCCCTCTCCCTGCCTGTCAGTCT
TGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGTAGATCTAGTCAGACCATTGTA
CATGGTAATGGAAACACCTATTTAGACTGGTACGCGCAGAAACCA
GGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTT
CTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCCGGGACAGATT
TCACACTCAGGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTT
ATTACTGCTTTCAAGGCTCACATCTTCCATTCACGTTCGGCTCGGG
GACAAAGTTGGAAATAAAA
(2)克隆44I16：
44I16重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.14、15、16所示。
核苷酸序列
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCC
AGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGATTTTCACTGAGCACT
TCTGGTATGGGTGTGAGTTGGATTCGTCAGCCTTCAGGAAAGGGTC
TGGAGTGGCTGGCACACATTTACTGGGATGATGACAAGCGCTATA
ATCCATCCCTGAAGAGCCGGCTCACAATCTCCAAGGATACCTCCAG
CAACCAGGTTTTCCTCAGGATCACCAGTGTGGACCCTGCAGATACT
GCCACATACTACTGTGCTCGGTACTATAGGTTCGATGCTATGGACT
ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
44I16轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.19、20、21所示。
核苷酸序列
GACCTTGTGATGACCCAGTCTCACAAACTCATGTCCACATCAGTAG
GAGACAGGGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGAA
CTGCCGTTGCCTGGTTTCAACAAAAACCAGGGCAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACACTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCACTTTATTATTGTCAGCAACATCATAGCACTCCGTTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
(3)克隆60J22：
60J22重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.23所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.24、25、26所示。
核苷酸序列
GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGTTATACCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATCAGTAGTGGTGGTGATAACACCAACTTTCCAGGCAGTGTGACGGGTCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATGCCAGGAGCTACCTGTACCTTCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCTTGTATTTCTGTGCAAGATCCGGATCCCTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
60J22轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.28所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.29、30、31所示。
核苷酸序列
GGCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCTTATCTGCCTCTCTGGGAGAAAGAGTCAGTCTCACTTGTCGGGCAAGTCAGGACATTGGTAATAGGTTAAACTGGCTTCAGCAGGAACCAGATGGAACTATTAAACGCCTGATCTTTGCCACATCCAGTTTAGATTCTGGTGTCCCCAAGAGGTTCAGTGGCAGTAGGTCTGGGTCAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTTGAGTCTGAAGATTTTTTGATCTATTACTGTCTACAATATGCTGCTTCTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
(4)克隆43G4：
43G4重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.33所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.34、35、36所示。
核苷酸序列
GAGGTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGTAGTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTGATATTAAATTTGACCCGAGGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAACAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTTCTAGATCGGTGGACTACTGGGGTCAGGGGACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
43G4轻链VK的氨基酸序列如SEQ ID NO.37所示，其编码的核苷酸序列如SEQ IDNO.38所示，其CDR1、CDR2和CDR3分别如SEQ ID NO.39、40、41所示。
核苷酸序列
CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATAACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTAACATTCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGCACTTCTCCCAAAATCTGGATTTATAGGACATCCAATCTGGATTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAAAGGAGTAATTACCCGCTCACGTTCGGCGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
将重链可变区分别克隆入含有人IgG4亚型重链恒定区(氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.42-43所示)和调节元件的pHCT1s载体(购于Addgene)，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgG4亚型重链。类似地，将轻链可变区克隆入含有人IgGκ轻链恒定区(氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.44-45)和调节元件的pHCT2载体(购于Addgene)，以在哺乳动物细胞中表达完整的IgGκ轻链。经测序正确后转染入CHO-S哺乳动物细胞(购于ATCC)中，IgG经表达分泌入expiCHO表达培养基(购于gibco公司)中，合并收集上清，过滤后纯化。采用ProteinA层析纯化IgG，将培养上清液加载于大小合适的ProteinA柱子上，用50mM Tris-HCl pH8.0，250mM NaCl洗涤，用0.1MGlycine-HCl pH3.0将结合的IgG洗脱下来。利用浓缩管将蛋白超滤浓缩，检测OD280，通过分光光度法测定IgG的浓度，结果见下表3。
表3瞬转纯化抗体产量结果
| 名称 | 瞬转体积(ml) | A280 | 消光 | 浓度(mg/ml) |
| 42E19 | 100 | 4.78/4.77 | 1.46 | 3.45 |
| 60J22 | 100 | 3.49/3.50 | 1.46 | 2.18 |
| 43G4 | 100 | 5.13/5.12 | 1.46 | 0.99 |
| 44I16 | 100 | 1.92/1.90 | 1.46 | 4.65 |
实施例9：Fortebio抗体亲和力测定
在96孔板选任意一列中加入PBS，100μl/孔，将96孔板放入探针支架盒中，避免探针触碰到支架。用PBS将biotin标记的固化物人CD132稀释至5μg/ml；取新的96孔板，按列加入稀释好的固化物，每孔加入100μl。用PBS将抗体稀释至50μg/ml，然后1:1梯度稀释，分别做50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、0μg/ml共6个浓度梯度，每孔加入100μl，根据具体分析物的结合能力可做适当调整。取新的96孔板，第1列和第2列加入PBS，100μl/孔(基线和解离均为同一种缓冲液)，第3列加入稀释好的固化物，第4列加入梯度稀释的分析物，第11列为10mM HCL pH1.9，第12列均为PBS。SA探针与biotin固化物结合非常牢固，再生时，固化物仍然结合在探针上，因此只需固化一次即可重复使用。然后在Fortebio software软件中建立实验方法，之后运行实验程序检测。抗体亲和力检测结果见下表4。
表4候选克隆亲和力
结合实施例7和实施例9，4个候选克隆号仅43G4亲和力强且对IL-15有显著的抑制活性，故选择43G4进行进一步实验。
实施例10：嵌合体抗CD132抗体43G4抑制NK92细胞分泌IFN-γ
用生长培养基(根据普诺赛的说明书制备，但不含IL-2)在96孔板中接种2×104个NK-92细胞(普诺赛CL-0530)，并在37℃下在5％CO2中孵育饥饿过夜。第二天，将抗CD132抗体43G4在生长培养基(不含IL-2)中从200nM至0.3nm连续稀释，添加到NK-92细胞中并孵育30分钟。孵育后，将终浓度2.5nM IL-15、250pM IL-21分别添加到NK-92细胞中。在37℃下在5％CO2中孵育72h后，ELISA测IFN-γ的分泌。
使用人IFN-γELISA试剂盒(BD货号555142)，在96孔酶标板上以1:250包被捕获抗体，4℃孵育过夜。次日PBS洗涤3次后，用10％FBS室温封闭1小时，PBS接着洗3次，分别加入100μl样品(细胞上清)和标准品，室温孵育2小时，然后用PBS洗5遍，以1:250比例将5AV-HRP加入含0.4％的检测抗体的稀释液中。最后，室温孵育1小时，PBS洗7遍，加入100μl显色液(TMB溶液，Sigma货号T2885)，37℃放置10分钟后加入50μl 2M浓硫酸溶液终止反应，立即放于酶标仪中读取OD450的值。结果如图4-1和4-2所示，该嵌合体抗CD132抗体43G4可以抑制IL-15和IL-21刺激NK92细胞释放IFN-γ。
实施例11：人外周血CD4+T细胞(人PBMC)中STAT磷酸化的流式细胞术分析
蛋白磷酸化流式细胞术允许同时分析细胞内磷酸蛋白(例如STAT蛋白)和细胞表面标志物，以分析离散细胞亚群中的细胞信号传导。该技术可以用于分析人外周血CD4+T细胞中来自γc家族的细胞因子刺激之后的STAT磷酸化。为了评估嵌合体抗CD132抗体43G4的体外特性，通过蛋白磷酸化流式细胞术测定它阻断由IL-7、IL-15和IL-21诱导的人外周血CD4+T细胞活化的能力。
通过密度梯度离心从新鲜全血中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。将全血与PBS以1：1稀释，添加至含有Ficoll-Paque PLUS的离心管中离心以分离PBMC。将含有PBMC的上层转移到新的离心管中，并用PBS洗涤两次。然后将PBMC以浓度约5.0×106个细胞/mL重悬在RPMI 1640培养基中，平板接种在96孔板中(60μL细胞/孔；约30000个细胞/孔)。
随后在RPMI 1640培养基中制备抗体的连续稀释液(确保抗体的工作浓度从最高200nM至最低0.03nM以3倍逐阶稀释)，随后将其添加到上述接种好的细胞中，每孔加30μl抗体。于37℃孵育30分钟。同样的，在RPMI 1640培养基中制备固定的细胞因子浓度(在RPMI1640培养基中制备每种细胞因子的连续稀释液(1：5)，IL-7、IL-21和IL15的最终细胞因子浓度从5nM开始。)，并以每孔30μl将其分别添加到已与抗体孵育完毕的细胞悬液中，使得IL-7的终浓度为0.6nM，IL-21的终浓度为1nM，IL-15的终浓度为1.6nM，每个孔的最终体积为120μL。
在向PBMC细胞添加细胞因子和抗体之后，将它们在37℃下孵育30分钟使得PBMC激活(STAT磷酸化)。然后通过向每个孔添加100μL 37℃的fix bufferⅠ(购于BD)停止刺激，并在37℃下孵育细胞10分钟(固定步骤)。然后用染色缓冲液洗涤细胞两次，每孔加入140μL-20℃的渗透缓冲液Ⅲ来透化细胞，冰上孵育30分钟。然后用染色缓冲液洗涤两次。为了能够分析用于测量STAT磷酸化的人外周血CD4+T细胞群，用抗CD3-PE(BD；1/200)和相关的抗磷酸-STAT-AlexaFluor647(BD)的混合物对细胞染色：其中，-抗磷酸STAT3(1/10)用于被IL-21刺激的细胞；-抗磷酸STAT5(1/20)用于被IL-7和IL-15刺激的细胞。将样品在室温下在暗处保持45分钟。然后对细胞离心，并用染色缓冲液洗涤两次。
使用HTS附件(BD)在LSRFortessaX-20细胞分析仪上获取样品数据。使用FlowJoX软件(TreeStar，OR)进行数据分析。将人外周血CD4+T细胞限定为完整细胞、单线态(singlet)、CD4+；并在该细胞群中分析STAT磷酸(MFI＝平均荧光强度)。结果如图5-1、5-2和5-3所示，从图中可以看出，嵌合体抗CD132抗体43G4可以抑制IL7和IL15刺激人外周血CD4+细胞下游STAT5磷酸化以及IL21刺激人外周血CD4+细胞下游STAT3磷酸化。
实施例12：嵌合体抗CD132抗体43G4抑制IL-9刺激M07E细胞增殖
将M07E细胞系(ATCC)用含5％FBS浓度的RPMI 1640完全培养基(上海培源生物科技)于37℃、5％CO2条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含有8×104-1×105个细胞，将其接种于96孔平底细胞培养板中，每孔100μl。再向每孔中加入50μl从200nM至0.064nm连续稀释的嵌合体抗CD132抗体43G4，与细胞共孵育30分钟后，然后加入50μl终浓度为70pM的IL-9配体，于37℃、5％CO2条件下培养96小时。
取出细胞培养板在室温平衡10分钟，使用96孔黑色平底微孔板(corning货号：3686)，每孔接种100μl培养后的细胞悬液。融解冻存的CellTiter-LumiTM发光法检测试剂(购于诺维赞公司)，平衡至室温。向每孔加入100μl CellTiter-LumiTM发光法检测试剂，室温振荡2分钟，以促进细胞的裂解。室温(约25℃)孵育10分钟，使发光信号趋于稳定。放于酶标仪中进行化学发光检测，结果如图6所示，从图6可以以看出，嵌合体抗CD132抗体43G4可以抑制IL9刺激M07E细胞增殖。
实施例13：嵌合体抗CD132抗体43G4抑制IL-4刺激Ramos细胞表达CD23
将Ramos细胞系(ATCC)用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基于37℃、5％CO2条件下培养，控制细胞浓度为每1ml含有2×105-2×106个细胞，将其接种于96孔平底细胞培养板中，每孔100μl。再向每孔中加入50μl从200nM至0.01nm连续稀释的嵌合体抗CD132抗体43G4，与细胞共孵育30分钟后，然后加入50μl终浓度为2.67nM的IL-4配体，于37℃、5％CO2条件下培养48小时。
转移培养好的细胞至U型96孔细胞培养板中，于4℃、300g离心3分钟，弃上清，用流式缓冲液(含4％小牛血清的PBS)洗涤细胞两次，每孔200μl。取封闭液(含有100ug/ml hIgG的缓冲液)50μl加入细胞中，冰浴封闭10分钟，300g离心3分钟弃上清，加入抗人CD23 FITC抗体稀释液(BD EBVCS-5)每孔50μl，冰浴封闭20分钟；300g离心3分钟弃上清后，流式缓冲液洗涤细胞两次，每孔200μl；取PI染色液加入细胞中，每孔100μl，冰浴避光5分钟，300g离心3分钟弃上清，每孔200μl流式缓冲液洗涤细胞两次后，再每孔100μl PBS重悬细胞，流式细胞仪读取平均荧光强度，记录测定结果。结果如图7所示，从图7可以看出嵌合体抗CD132抗体43G4不能抑制IL4刺激Ramos细胞表达CD23。
综上，本发明公开了一种高亲和力可以靶向结合CD132的单克隆抗体，该单克隆抗体可以选择性抑制IL7、IL15、IL21和/或IL9，但不能抑制IL4。故该抗体可有助于制备用于预防、中和或治疗IL7、IL15、IL21和/或IL9分泌过多而致病的炎症性疾病治疗药物中，比如系统性红斑狼疮、狼疮肾炎等，并提供更多临床和科研的检测选择。
本发明提供了一种抗CD132的单克隆抗体及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种抗CD132的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体特异性结合人CD132，该抗体由轻链和重链组成，其中，所述轻链的轻链可变区中LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:39-41所示；所述重链的重链可变区中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO:34-36所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示；所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体为IgG4亚型，κ轻链。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的轻链恒定区和所述的单克隆抗体的重链恒定区为人源。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；所述的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
6.一种编码权利要求1-5任意一项所述的单克隆抗体的核苷酸分子。
7.一种表达权利要求6所述的核苷酸分子的重组DNA表达载体。
8.一种含有权利要求7所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞中的CHO细胞。
9.权利要求1-5任意一项所述的单克隆抗体在制备用于预防、中和或治疗自身免疫性疾病治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病为与IL-7、IL-15、IL-21或IL-9细胞因子受体相关的免疫性疾病。
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| 陈必成等: "抗CD132抗体介导同种异型抗原激活的T细胞凋亡(英文)", 《JOURNAL OF CHINESE PHARMACEUTICAL SCIENCES》, vol. 2, pages 125 - 130 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116789828B (zh) | 2023-11-17 |
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