CN116789758A - 一种rgd靶向多肽、rgd靶向多肽-核酸纳米复合物及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物化学领域，提供了一种RGD靶向多肽，其结构式如下所示：且具有RGD靶向选择性功能。本发明还提供了一种RGD靶向多肽‑核酸纳米复合物，由上述RGD靶向多肽和核酸分子组成。同时，本发明还提供了一种上述RGD靶向多肽‑核酸纳米复合物制备方法以及其在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。本发明靶向多肽核酸纳米复合物可以作为一种简单、高效、低毒、靶向的的多肽核酸运载体。

Description

一种RGD靶向多肽、RGD靶向多肽-核酸纳米复合物及其制备与 应用
技术领域
本发明涉及生物化学领域，尤其涉及一种RGD靶向多肽、RGD靶向多肽-核酸纳米复合物及其制备与应用。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是一种基因沉默技术，这项技术利用小RNA分子(siRNA或miRNA)介导并靶向性剪切mRNA转录本，从而抑制特定基因的表达。与传统的基因敲除技术相比，RNAi技术具有高效、快速和特异性等优势，被广泛应用于基础研究、药物研发、临床治疗等领域。然而，RNAi技术依赖于小RNA分子的稳定性，由于其易于被核酸酶降解，在体内维持时间较短，影响了其效果。因此，RNAi技术离不开siRNA运载体的帮助。
目前，常用的siRNA运载体主要有脂质体、病毒载体、聚合物、多肽生物载体等。其中，脂质体是常用的siRNA运载体，但脂质体的制备和表征过程相对复杂，限制其在siRNA递送中的应用发展。病毒载体的制备成本高，生产和纯化过程需要复杂的技术设备，同时病毒载体存在基因递送异质性反应和特异性较差等安全问题。聚乙烯亚胺(PEI)是一类使用最广泛的siRNA递送聚合物，但PEI容易与血液或细胞蛋白结合而失去活性，同时其制备过程和表征方法较为复杂。
多肽作为生物体内的内源性分子，具有易于被生物降解的特性，可用作生物兼容性的siRNA递送材料。同时，多肽可通过修饰成荧光染料，用于医学成像，例如检测肿瘤和血管炎症等。多肽还可作为免疫疗法的一种手段，通过激活或抑制特定的免疫反应来调节机体免疫功能，从而达到治疗效果。因此，多肽在基因治疗和癌症治疗等领域作为siRNA的运载体，具有广阔的应用前景和发展潜力。然而，现有的多肽运载体本身并没有做靶向修饰，对递送的siRNA不具备靶向特异性递送。
因此，开发一种简单、高效、低毒、靶向的新型siRNA运载体，成为目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种简单、高效、低毒、靶向的RGD靶向多肽、RGD靶向多肽-核酸纳米复合物及其制备与应用。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
本发明提供了一种RGD靶向多肽，其结构式如下所示：
其中，R为精氨酸、M为甲硫氨酸、E为谷氨酸、H为组氨酸、W为色氨酸。
本发明RGD靶向多肽，其关环策略是位于两个M甲硫氨酸之间。
多肽定量是利用多肽序列中的W色氨酸的吸光值为依据。
多肽整体电性为正电性。
作为本发明的优选方式之一，所述多肽进行了RGD靶向修饰，具有RGD靶向选择性功能，可以与肿瘤细胞过表达的整合受体(αvβ3)特异性结合。
本发明提供了一种RGD靶向多肽的制备方法，
(1)使用“固相合成法”制备含有两个M甲硫氨酸的多肽，所含氨基酸序列为AC-RGD-RRMEHRMEW；
(2)在酸性条件下，多肽的两个甲硫氨酸与双卤代试剂反应，形成关环；所得的关环多肽带有两个带正电荷的锍盐中心，且稳定性增强。
本发明还提供了一种RGD靶向多肽-核酸纳米复合物，由上述RGD靶向多肽和核酸分子组成。
作为本发明的优选方式之一，所述RGD靶向多肽带正电荷，核酸分子带负电荷，二者通过正负电荷静电吸附作用自组装形成纳米复合物。
作为本发明的优选方式之一，所述核酸分子选择带负电荷的单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA、质粒、单核苷酸分子中的一种或者多种混合物。
作为本发明的优选方式之一，所述核酸分子具体选择带负电荷的单链/双链的siRNA。
本发明还提供了一种上述RGD靶向多肽-核酸纳米复合物的制备方法，先将核酸分子分散于组装介质中，室温静置2min；随后取RGD靶向多肽加入所述核酸分子中，并吹打均匀；室温静置10min，即可完成组装，形成稳定的多肽核酸纳米复合物。
作为本发明的优选方式之一，所述核酸分子与RGD靶向多肽的摩尔比为1：300。
作为本发明的优选方式之一，所述组装介质为DEPC水、1640培养基、DMEM培养基、opti-MEM培养基，或者其他细胞培养基中的一种或者几种混合液体。其中，1640培养基、DMEM培养基、opti-MEM培养基均为本领域常规培养基。
本发明还提供了一种上述RGD靶向多肽-核酸纳米复合物在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
本发明相比现有技术的优点在于：所述多
(1)本发明RGD靶向多肽可以与包括siRNA分子在内的核酸分子发生共组装，形成稳定的纳米复合物，并实现对核酸分子的细胞内高效运载；同时，本发明RGD靶向多肽进行了RGD靶向修饰，可以与肿瘤细胞过表达的整合受体特异性结合，将多肽核酸纳米复合物靶向地送到RGD配体过表达的细胞系；此外，该多肽分子合成简便，细胞毒性作用低，适合大量制备，有益于解决现有多肽运载体制备和纯化繁琐、毒性高的问题，为开发简单、高效、低毒、靶向的多肽siRNA运载体提供新的方向；
(2)本发明多肽的关环方法，既增加了多肽的正电性，又增加了多肽的稳定性；其中，增加的正电荷可以与带负电荷的核酸分子通过正负电荷静电吸附作用形成纳米复合物，避免核酸被核酸酶降解；
(3)结合实验可知，本发明制备的“带有RGD靶向的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物”对宫颈癌细胞(整合素受体表达阳性)的抑制增殖和促进凋亡作用显著强于“没有RGD修饰的多肽核酸纳米复合物”，证明本发明制备的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物可以作为一种新型、靶向、低毒、高效的多肽核酸运载体；
(4)本发明可以通过更改不同核酸序列信息递送不同的核酸，还可以通过更改不同的靶向基团去修饰多肽，选择性靶向递送到不同细胞系；通过细胞凋亡实验，细胞毒性实验证实本发明的设计思路可拓展到不同种类靶标疾病模型中，未来有望为由靶向性多肽核酸纳米药物在相关疾病治疗中提供新的设计思路和可行治疗方案。
简单、高效、低毒、靶向、低免疫反应
附图说明
图1是实施例1中RGD靶向多肽的制备路线图；
图2是实施例1中RGD靶向多肽的分离纯化结果(图中，a图为RGD靶向肽的结构信息图；b图为RGD靶向肽的HPLC谱图；c图为RGD靶向肽的LC-MS谱图)；
图3是实验例1中核酸与不同配比多肽制备的靶向多肽核酸纳米复合物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4是实验例2中不同配比条件下靶向多肽核酸纳米复合物的粒径图；
图5是实验例2中靶向多肽核酸纳米复合物的电位图；
图6是实验例2中靶向多肽核酸纳米复合物的形貌表征图(SEM)；
图7是实验例3中靶向多肽核酸纳米复合物给药HeLa细胞之后的细胞增殖图(CCK-8)；
图8是实验例4中靶向多肽核酸纳米复合物给药HeLa细胞之后的细胞凋亡图(图中，a图为靶向多肽核酸纳米复合物给药HeLa细胞之后的细胞凋亡图；b图为细胞凋亡定量统计图，早期凋亡加晚期凋亡)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的所使用的试剂产品(包括培养基)及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
实施例1
本实施例的一种RGD靶向多肽，其结构式和制备路线如图1所示。
具体制备及分离纯化步骤如下：
一、线性多肽的制备纯化步骤
(1)使用固相合成法合成线性多肽：
称取MBHA树脂于接肽管中，随后加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，鼓氮气溶胀20min(2次)。加入20％((v/v))哌啶的脱Fmoc保护溶剂(DMF)，氮气鼓吹5min(2次)，脱去Fmoc保护基团。加入足够的DMF与DCM溶剂重悬树脂，氮气反复鼓吹洗涤6～10次。为了鉴定是否脱保护完全，取少量树脂使用茚三酮(5％茚三酮，取5g茚三酮加入无水乙醇定容到100mL)检测。如果树脂呈暗褐色或深蓝色，则为显色，即表明Fmoc彻底脱去。
将称好的Fmoc-AA-OH(X mmol×5eq(过量，或其他倍数)×氨基酸分子量)，HOBT(1-羟基苯并三唑)(X mmol×5eq(过量，或其他倍数)×HOBT分子量)和DIC(二异丙基碳二亚胺)(m＝X mmol×5eq(过量，或其他倍数)×DIC分子量)加入到固相反应管中，使用DMF溶解，氮气鼓吹1～1.5h。反应结束之后取少量树脂使用茚三酮检测，树脂颜色为无色，则说明反应已完全。接着再次重复加入充分的DMF与DCM溶剂重悬树脂，反复鼓吹氮气洗涤6～10次，再继续加入下一个氨基酸，直到所有氨基酸均完成连接。
其中，树脂的载量X mmol＝负载度×树脂重量＝mmol/g×g(树脂可负载多肽的摩尔质量)；式中，负载度的选择主要由多肽序列的氨基酸数量决定，氨基酸数量越多倾向选择负载度低的树脂。
(2)线性多肽N端乙酰化保护：
按照上述步骤完成多肽氨基酸的连接，将乙酸酐和吡啶按照1:1混合，并加入到已经脱去Fmoc保护的树脂多肽中，氮气鼓吹20min(2～3次)。随后进行茚三酮检测，若无色，则说明多肽乙酰化已完成。加入足够的DMF与DCM溶剂重悬树脂，反复鼓吹氮气洗涤6～10次，得到线性多肽树脂待用。
(3)线性多肽的剪切：
用DCM反复洗涤树脂，然后用甲醇脱水干燥洗涤树脂2次，并使用氮气鼓吹干燥。称取干燥的树脂100mg加入1mL裂解液(此比例进行实验，100mg加1mL)室温旋转裂解2～3h。滤去树脂(此时多肽已经被剪切到剪切液中)，按照剪切液和冰乙醚1：10(v/v)的比例将冰乙醚加入到上述所得剪切液中，使多肽析出。3000rpm离心3min，弃去乙醚。重复此步骤2次，即可得到较纯净的粗肽产品。
其中，所述剪切液配方为三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95％：2.5％：2.5％(v/v/v)。
(4)线性多肽的纯化：用乙腈溶液溶解上述所得粗肽，之后直接用高效液相色谱对多肽进行纯化分离。
二、关环多肽的制备纯化步骤
(1)用含有甲酸：乙腈：水(1：5：4，v/v/v)的混合溶液溶解带有2个M甲硫氨酸的多肽，并加入10eq的邻二溴甲苯，待混合摇匀之后在摇床上过夜反应。
(2)用C18高效液相色谱柱将反应后的样品分离纯化(图2b所示)，冻干获得最终多肽产品，并用LC-MS进行分子量鉴定(图2c所示)，最终获得目标所需的RGD靶向多肽“Ac-RGD-WPC”(结构信息如图2a)。
本实施例RGD靶向多肽“Ac-RGD-WPC”，整体电性为正电性，同时具有RGD靶向选择性功能，可以与肿瘤细胞过表达的整合受体(αvβ3)特异性结合。
实施例2
本实施例的一种RGD靶向多肽-核酸纳米复合物，由实施例1的RGD靶向多肽“Ac-RGD-WPC”以及siRNA分子组成。其中，siRNA选择的是带负电荷的双链siRNA分子，正义链序列为：5‘-UGUGGAUGACUGAGUACCUGAdTdT-3’，反义链序列为：5‘-UCAGGUACUCAGUCAUCCACAdTdT-3’；所述siRNA分子与RGD靶向多肽之间摩尔比1：300。
具体制备方法为：
先将siRNA分子分散于组装介质中，室温静置2min；随后取RGD靶向多肽“Ac-RGD-WPC”快速加入siRNA分子中，并迅速吹打均匀；室温静置10min，即可完成组装，形成稳定的多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”。
其中，组装介质为DEPC水、1640培养基、DMEM培养基、opti-MEM培养基，或者其他细胞培养基中的一种或者几种混合液体。优选为1640培养基的培养液。
本实施例中，RGD靶向多肽带正电荷，siRNA分子带负电荷，二者通过正负电荷静电吸附作用自组装形成纳米复合物。
此外，需要注意的是，本实施例核酸分子为带负电荷的双链siRNA分子，但其同样适用于带负电荷的单链RNA、单链DNA、双链DNA、质粒、单核苷酸等分子。
以下实验例中，如未有特殊说明，涉及到siRNA同实施例2，即为带负电荷的双链siRNA，且序列同上，但实际应用不限于此。
实验例1
本实验例用于验证本发明RGD靶向多肽-核酸纳米复合物中多肽与核酸分子的最佳适配比。
本发明所制备的多肽带有正电荷。本发明利用带正电荷的多肽与带负电荷的核酸通过正负电荷静电吸附作用形成纳米复合物。在形成纳米复合的过程中需要探索核酸与多肽的最佳适配比。
实验方法：以siRNA、Ac-RGD-WPC为例，设置不同核酸-多肽配比(分别为1：100、1：200、1：300和1：400，摩尔比)，并通过琼脂糖凝胶电泳实验观察能组装形成稳定的靶向多肽核酸纳米复合物，从而验证核酸与多肽的最佳配比。
实验结果：通过琼脂糖凝胶电泳发现，当核酸与多肽比例为1：300在室温静置组装10min，即可以形成稳定的靶向多肽核酸纳米复合物(图3)。
实验例2
本实验例用于测试本发明靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”的各项理化性能。
一、水合粒径
实验方法：使用动态光散射粒径仪(DLS)对不同核酸-多肽配比(1：100、1：200、1：300和1：400，摩尔比)的靶向多肽核酸纳米复合物进行水合粒径表征。
实验结果：结果表明本发明特定配比的靶向多肽核酸纳米复合物(核酸-多肽配比1：300)，其粒径处于100～200nm之间，且分散指数也较窄(图4)。
二、表面电荷
实验方法：使用动态光散射粒径仪(DLS)对本发明靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”(核酸-多肽配比1：300)进行了表面电荷测试，同时以单独“siRNA”以及单独“Ac-RGD-WPC”作为对照。
实验结果：结果表明本发明靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”完成组装之后，其表面电荷相比两个对照组(siRNA对照组、Ac-RGD-WPC对照组)发生显著改变，也证明本发明成功完成靶向多肽核酸纳米复合物的组装(图5)。
三、形貌
实验方法：通过扫描电子显微镜(SEM)对本发明靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”(核酸-多肽配比1：300)的形貌进行表征。
实验结果：结果表明本发明靶向多肽核酸纳米复合物成规整、均匀的纳米球型(图6)。
实验例3
本实验例用于验证本发明靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”对靶细胞增殖的抑制作用。
作为一种特异性细胞靶向递送核酸的运载体，对核酸的递送必须具有选择性。为验证本发明多靶向多肽具有癌细胞靶向递送效果，本实验挑选了RGD受体(αvβ3)表达阳性的细胞系宫颈癌细胞系(HeLa)进行验证。
实验方法：首先选择HeLa细胞作为模型细胞，通过细胞毒性(CCK-8)实验进行验证。用本发明核酸-多肽1：300的比例在常温下孵育10min形成稳定均一的靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”后，使用1640培养基梯度稀释。不同浓度的纳米复合物与HeLa细胞孵育72h之后，测试所述纳米复合物对HeLa细胞增殖的影响。同时，以单独“RGD”以及单独“WPC+siRNA”作为对照。
实验结果：结果表明无RGD的多肽(WPC+siRNA对照组)对HeLa细胞增殖几乎没有影响；而本发明的靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”对HeLa细胞的增殖抑制呈浓度梯度依赖性(图7)。
实验例4
本实验例用于验证本发明靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”对细胞凋亡的影响。
实验方法：首先，制备不同组别的核酸纳米复合物，具体如下：
1、ctrl组：只有细胞，没有任何刺激；
2、Negtive组：阴性的siRNA(其他组的siRNA均为阳性siRNA)；
3、Ac-RGD-WPC组：只加多肽刺激；
4、Lipo2000+siRNA组：采用商业用的脂质体转染试剂作为阳性对照；
5、WPC+siRNA组：没有RGD靶向作为对照；
6、Ac-RGD-WPC+siRNA组：本发明制得的完整靶向多肽核酸纳米复合物。
接着，同CCK-8实验一致，使用1640培养基稀释各纳米复合物，并将不同组的纳米复合物与HeLa细胞分别孵育72h之后收取细胞。使用凋亡试剂盒PI/FITC对收取的HeLa细胞进行染色后，使用流式细胞仪进行测试，并分析实验数据。
实验结果：结果发现，有RGD靶向修饰的多肽核酸纳米复合物能够显著诱导HeLa细胞的凋亡(早期凋亡+晚期凋亡)，进而说明本发明RGD靶向肽具有一定的选择性，可以实现靶向、高效的递送核酸至特定的肿瘤细胞，引发细胞RNAi进而诱导细胞凋亡(图8)。
综上，本发明成功制备了靶向多肽核酸纳米复合物“Ac-RGD-WPC+siRNA”，并进一步对所制备的复合物进行了理化性能表征。通过HPLC(高效液相色谱)和LC-MS(液相色谱-质谱联用)验证了按照本发明方法成功合成了RGD靶向多肽；通过琼脂糖凝胶，动态光粒径散射仪(DLS)和扫描隧道显微镜(SEM)验证了所述方法可以成功制备靶向多肽核酸纳米复合物；通过细胞毒性实验(CCK-8)和细胞凋亡实验验证所述制备的带有RGD靶向的靶向多肽核酸纳米复合物，对宫颈癌细胞(整合素受体表达阳性)的抑制增殖和促进凋亡作用显著强于没有RGD修饰的多肽核酸纳米复合物。即证明本发明制备的靶向多肽核酸纳米复合物可以作为一种简单、高效、低毒、靶向的多肽核酸运载体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种RGD靶向多肽，其特征在于，其结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的RGD靶向多肽，其特征在于，所述多肽具有RGD靶向选择性功能。
3.一种RGD靶向多肽-核酸纳米复合物，其特征在于，由权利要求1所述的RGD靶向多肽和核酸分子组成。
4.根据权利要求3所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物，其特征在于，所述RGD靶向多肽带正电荷，核酸分子带负电荷，二者通过正负电荷静电吸附作用自组装形成纳米复合物。
5.根据权利要求3所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物，其特征在于，所述核酸分子选择带负电荷的单链RNA、双链RNA、单链DNA、双链DNA、质粒、单核苷酸分子中的一种或者多种混合物。
6.根据权利要求5所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物，所述核酸分子具体选择siRNA。
7.一种如权利要求3～6任一所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物的制备方法，其特征在于，先将核酸分子分散于组装介质中，室温静置2min；随后取RGD靶向多肽加入所述核酸分子中，并吹打均匀；室温静置10min，即可完成组装，形成稳定的多肽核酸纳米复合物。
8.根据权利要求7所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物的制备方，其特征在于，所述核酸分子与RGD靶向多肽的摩尔比为1：300。
9.根据权利要求7所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物的制备方，其特征在于，所述组装介质为DEPC水、1640培养基、DMEM培养基、opti-MEM培养基中的一种或者几种混合液体。
10.一种如权利要求3～6任一所述的RGD靶向多肽-核酸纳米复合物在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
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