CN116789751A - 预防和/或治疗纤维化疾病的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供预防和/或治疗纤维化疾病的多肽或其药学上可接受的盐及其应用，所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。本发明的多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。由此，利用本发明的多肽制得的抑制剂、组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于药物、细胞培养物和试剂盒等产品的开发。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种预防和/或治疗纤维化疾病的多肽及其应用。
背景技术
纤维化是一种成纤维细胞过度增殖，并伴有细胞外基质沉积聚集的病理过程，是一种慢性疾病。纤维化可发生于身体多个部位，包括肺、心脏、肝脏、肾脏等重要器官。持续的纤维化进程会导致器官结构破坏、功能衰竭，严重威胁人类的健康和生命。目前，已有治疗纤维化疾病的手段主要包括药物治疗和器官移植。器官移植作为纤维化疾病患者的最终治疗手段，其临床应用范围严重受限于器官供体缺乏、手术风险高、费用昂贵等因素。而现有治疗纤维化疾病的药物有限，无法完全满足临床需求。因此，亟待开发新的抗纤维化药物。
多肽由2-50个氨基酸组成，在人体生理生化反应过程中扮演着重要角色。多肽类药物在治疗纤维化疾病方面具有一定的优势。与传统化学药物相比，多肽类药物结构简单、选择性灵敏、毒副作用低、患者耐受性强。因此，研发抗纤维化多肽药物，为纤维化疾病的治疗提供新的治疗策略是临床亟需的。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供抗纤维化的多肽或其药学上可接受的盐、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂、组合物及其应用。本发明的多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。由此，利用本发明的多肽制得的抑制剂、组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于药物、细胞培养物和试剂盒等产品的开发。
本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
发明人在长期的生物活性多肽研究中，意外得到了一条氨基酸序列为MMWTPR的六肽。进一步地实验结果表明，该多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。
因此，在本发明的第一个方面，本发明提出了一种多肽或其药学上可接受的盐。根据本发明的实施例，所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。
需要说明的是，本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
需要说明的是，在本文中，“多肽”有时也被称为“六肽”或“生物活性肽”或“生物活性多肽”。
根据本发明实施例的多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。由此，利用该多肽及其药学上可接受的盐制得的抑制剂、组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于开发抑制成纤维细胞增殖的产品。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种缀合物。根据本发明的实施例，所述缀合物包括多肽和缀合部分，所述缀合部分与所述多肽相偶联；所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。
为了获得预期的多肽性能，例如便于给药、降低多肽对正常组织的毒性、延长在体内血液循环系统中停留时长、提高靶向性等，可以将多肽与适宜的偶联部分相连。由此，得到包含本发明实施例多肽的缀合物。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的多肽。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码的前述多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。由此，利用所述核酸分子编码多肽的抗纤维化活性，制得的抑制剂、组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于药物、试剂盒等产品的开发。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括前述的核酸分子。由此，利用构建得到的构建体，比如载体或转化子，可有效表达上述的多肽。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种细胞。根据本发明的实施例，所述细胞携带前述核酸分子或前述构建体；或表达前述的多肽。根据本发明的实施例，所述细胞在合适条件下可高效表达上述的多肽，进一步地，获得的多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种抑制剂。根据本发明的实施例，所述抑制剂包括：前述的多肽或其药学上可接受的盐或前述的缀合物。根据本发明的实施例，所述抑制剂能抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于开发抑制宫颈癌细胞增殖的产品。
在本发明的第七方面，本发明提出了试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物或者前述的抑制剂。根据本发明的实施例，所述试剂盒可用于抑制成纤维细胞增殖。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物或前述的细胞抑制剂。根据本发明实施例的组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于药物、细胞培养物和试剂盒等产品的开发。
在本发明的第九方面，本发明提出了前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物、前述的抑制剂或前述的组合物在制备产品中的用途，所述产品用于抑制成纤维细胞增殖或者预防和/或治疗纤维化疾病。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对多肽或其药学上可接受的盐、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂或组合物所描述的特征和优点，同样适用于该制备产品的用途，在此不再赘述。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种体外抑制成纤维细胞增殖的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述成纤维细胞与前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物、前述的抑制剂或前述的组合物进行接触。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对多肽或其药学上可接受的盐、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂或组合物所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
有益效果：
本发明提供了氨基酸序列为MMWTPR（Met-Met-Trp-Thr-Pro-Arg）的六肽，实验证明其对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，是理想的成纤维细胞靶向治疗生物活性肽。本发明的多肽能显著抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗成纤维细胞疾病，或用于制备体外抑制成纤维细胞增殖的试剂盒。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明具体实施方式的六肽MMWTPR的高效液相色谱结果图；
图2为根据本发明具体实施方式的六肽MMWTPR的一级质谱图结果图；
图3为根据本发明具体实施方式的六肽对不同肿瘤细胞生长增殖的影响结果图，不同字母表示平均值具有显著性差异（P<0.05）；
图4为根据本发明具体实施方式的不同浓度的六肽对L929细胞生长增殖的影响结果图，不同字母表示平均值具有显著性差异（P<0.05）。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
术语及定义
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本发明提出了一种多肽或其药学上可接受的盐、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂、组合物及其应用，下面将分别对其进行详细描述。
多肽或其药学上可接受的盐
本发明提出了一种多肽或其药学上可接受的盐。根据本发明的实施例，所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。根据本发明实施例的多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。由此，利用该多肽及其药学上可接受的盐制得的抑制剂、组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于开发抑制成纤维细胞增殖的产品。需要说明的是，本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
需要说明的是，在本文中，“多肽”有时也被称为“六肽”或“生物活性肽”。
根据本发明的实施例，所述多肽具有如MMWTPR所示的保守修饰形式的氨基酸序列。
需要说明的是，在不实质性影响本发明多肽的生物活性（保留至少90%的活性）的前提下，本发明多肽的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且其可用本文中说明的功能测定方法对经改变的多肽的保留功能进行测试。优选地，保守修饰在数目上不超过1个或2个。
本文中，术语“保守修饰形式的氨基酸序列如”指这样的氨基酸修饰，所述修饰不显著影响或改变包含该氨基酸的氨基酸序列的多肽的结合特性，该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等标准技术引入本发明的多肽中。保守氨基酸置换系其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸），具有酸性侧链的氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸），具有不带电的极性侧链的氨基酸（如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸），具有非极性侧链的氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸），具有β-支化侧链的氨基酸（如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、和具有芳香侧链的氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。
缀合物
本发明提出了一种缀合物。根据本发明的实施例，所述缀合物包括多肽和缀合部分，所述缀合部分与所述多肽相偶联；所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。
根据本发明的实施例，所述多肽具有如MMWTPR所示的保守修饰形式的氨基酸序列。
在本文中，术语“缀合物”有时也被称为“偶合物”或“偶联物”，是指使用任何共价或非共价生物缀合策略与偶联部分比如载体物质、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物、治疗剂和化疗剂等缀合的蛋白质或多肽片段。
为了获得预期的多肽性能，例如便于给药、降低多肽对正常组织的毒性、延长在体内血液循环系统中停留时长、提高靶向性等，可以将多肽与适宜的偶联部分相连。由此，得到包含本发明实施例多肽的缀合物。
根据本发明的实施例，所述偶联部分包括载体、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物、治疗剂和化疗剂中的至少之一。
核酸分子
本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码上述的多肽。根据本发明的实施例，上述述核酸分子编码的前述多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。由此，利用上述核酸分子编码多肽的抗纤维化活性，制得的抑制剂、组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于药物、试剂盒等产品的开发。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本文中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本发明中的分子序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
构建体
本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括前述的核酸分子。由此，利用构建得到的构建体，比如载体或转化子，可有效表达上述的多肽。
根据本发明的实施例，所述构建体，可以是载体或转化子。
在本文中，术语“载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
根据本发明的实施例，所述构建体（比如载体或转化子）可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。由此构建得到的构建体（比如载体或转化子），可有效表达上述多肽。
在将上述核酸分子连接到所述构建体（比如载体或转化子）上，比如表达载体上时，可以将所述核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。
在本发明的一些实施例中，所述载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将所述核酸与商购的载体（如质粒或病毒载体）可操作地连接而获得。本发明中的载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在本文中，术语“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述的核酸分子的表达，进而实现所述核酸分子编码的多肽的体外大量获得。
在本发明的一些实施例中，所述载体为真核载体或原核载体。
细胞
本发明提出了一种细胞。根据本发明的实施例，所述细胞携带前述核酸分子或前述构建体；或表达氨基酸序列如MMWTPR所示的多肽。根据本发明的实施例，上述细胞在合适条件下可高效表达上述的多肽，进一步地，获得的多肽对成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能抑制成纤维细胞增殖，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。
在本发明的一些实施例中，所述细胞为原核细胞、真核细胞或噬菌体。
在本发明的一些实施例中，所述原核细胞为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌。
在本发明的一些实施例中，所述真核细胞为真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
在本发明的一些实施例中，所述真菌为巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母或木霉。
在本发明的一些实施例中，所述昆虫细胞为草地粘虫细胞；根据本发明的实施例，所述植物细胞是烟草植物细胞；根据本发明的实施例，所述哺乳动物细胞为BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞或人胚肾293细胞；且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
在本发明的一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。
在本发明的一些实施例中，所述细胞是BHK细胞、CHO细胞、COS细胞或NSO细胞。
要说明的是，本发明说明书中所述的“适合条件”，是指适合本发明的多肽表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合多肽的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化形成最适的所述多肽表达的条件。
抑制剂
本发明提出了一种抑制剂。根据本发明的实施例，所述抑制剂包括：氨基酸序列如MMWTPR所示的多肽或其药学上可接受的盐或前述的缀合物。根据本发明的实施例，上述抑制剂能抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于开发抑制宫颈癌细胞增殖的产品。
试剂盒
本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：氨基酸序列如MMWTPR所示的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物或者前述的抑制剂。根据本发明的实施例，上述试剂盒可用于抑制成纤维细胞增殖。
组合物
本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：氨基酸序列如MMWTPR所示的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物或前述的细胞抑制剂。根据本发明实施例的组合物能够抑制成纤维细胞增殖，可进一步用于药物、细胞培养物和试剂盒等产品的开发。
根据本发明的实施例，所述组合物是药物组合物。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、固体载体或这两者相结合，制备组合物。
根据本发明的实施例，进一步包括药学上可接受的辅料。由此，得到可用于制备药物的组合物。
在本文中，术语“药学上可接受的成分”是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其它液体赋形剂等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的多肽不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其它组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
根据本发明的实施例，所述组合物为药物注射剂。由此，得到可用于制备药物的注射剂。
用途
本发明提出了前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物、前述的抑制剂或前述的组合物在制备产品中的用途，所述产品用于抑制成纤维细胞增殖或者预防和/或治疗纤维化疾病。
根据本发明的实施例，所述产品选自药物、细胞培养物或试剂盒；
当所述产品为药物时，所述产品用于预防和/或治疗纤维化疾病；
当所述产品为细胞培养物或试剂盒时，所述产品用于抑制成纤维细胞的增殖。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对多肽或其药学上可接受的盐、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂或组合物所描述的特征和优点，同样适用于该制备产品的用途，在此不再赘述。
方法
本发明提出了一种体外抑制成纤维细胞增殖的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述成纤维细胞与前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述的缀合物、前述的抑制剂或前述的组合物进行接触。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对多肽或其药学上可接受的盐、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂或组合物所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。
疾病治疗方法
本发明提出了一种预防和/或治疗纤维化疾病。的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向受试者施用药学上可接受量的前述的多肽或其药学上可接受的盐、前述缀合物、前述的抑制剂或前述组合物。
需要说明的是，术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指被评估用于治疗和/或被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物为人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫性疾病的个体、患有病原体感染的个体等。受试者可以是人，但也包括其它哺乳动物，特别是可用作人疾病的实验室模型的哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
在本文中，术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的多肽、缀合物、核酸分子、构建体、细胞、抑制剂或药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。优选地，本发明的组合物采用静脉注射或皮下注射方式被给药。
在本文中，术语“治疗”是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：（a）在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；（b）抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或（c）缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
本发明所述的多肽、缀合物、抑制剂或组合物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：多肽的固相化学合成及分离鉴定
多肽（Met-Met-Trp-Thr-Pro-Arg）的化学合成采用多肽Fmoc固相合成技术，从多肽序列的C端到N端进行反向合成。
首先将第一个氨基酸的羧基共价连接到载体树脂上，再以这个氨基酸的氨基为反应起点，与相邻氨基酸的羧基发生酰化反应形成肽键。重复这一过程，直到目标多肽合成完毕，去掉Fmoc保护基并抽干树脂。用6倍树脂体积的切割液（97.50%TFA+2.50%H2O）进行切割，无水乙醚洗涤沉淀物3次，得到多肽粗品。
通过高效液相色谱分离纯化得到95%以上纯度的多肽。结果如图1所示。
利用质谱技术确认多肽的分子量。结果如图2所示。
上述实验结果显示，本发明的多肽（氨基酸序列为MMWTPR（SEQ ID NO：1））可通过化学合成的方式获得。
进一步地，用PBS溶液将多肽配制成10mg/mL的多肽母液，以考察其对不同肿瘤细胞生长增殖的影响。
实施例2：多肽对不同肿瘤细胞生长增殖的影响
贴壁细胞、试剂准备：取对数生长期的四种细胞（MC3T3E1成骨细胞、HepG2细胞、EC9706食管癌细胞、L929成纤维细胞），细胞计数后，按照1×104个细胞/孔接种到96孔板，37℃恒温培养箱中培养至细胞贴壁。将10mg/mL的多肽母液用含血清的培养基稀释至200μg/mL，得到多肽稀释液。
多肽干预：取出96孔板，吸弃旧培养基，分别加入100μL多肽稀释液进行孵育（多肽干预组，每种细胞设3个复孔），每种细胞的对照孔添加100μL含血清的培养基进行孵育（对照组，设3个复孔）。24h后吸出上清液，用PBS清洗数次，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL、含血清的培养基180μL，于培养箱中继续培养4h。
细胞活力检测：弃去含有MTT的培养液，每孔加入150μL的DMSO于震荡器上震荡10min后，测定490nm波长下的吸光度。
每种细胞对照组的细胞活力以100%计，多肽干预组的细胞活力以干预组细胞数量与对照组细胞数量的百分比计。
结果如图3所示。
（1）本发明多肽干预对MC3T3E1成骨细胞、HepG2肝癌细胞、EC9706食管癌细胞的生长增殖没有影响（P<0.05）。
（2）出乎发明人预料，本发明多肽干预L929成纤维细胞，观察到L929细胞的生长增殖被显著抑制（P<0.05）。
上述实验结果显示，本发明多肽对L929成纤维细胞具有高特异性和靶向性，能显著抑制L929细胞增殖。本发明多肽对MC3T3E1成骨细胞增殖无影响，提示本发明多肽细胞毒性低。
由此，本发明多肽或包含其的药物组合物对具有抑制成纤维细胞增殖的生物活性，可用于预防和/或治疗纤维化疾病。
实施例3：不同浓度的多肽对L929细胞生长增殖的影响
贴壁细胞、试剂准备：取对数生长期的L929细胞，细胞计数后，按照1×104/孔接种到96孔板，37℃恒温培养箱中培养至细胞贴壁。将10mg/mL的多肽母液用含血清的培养基梯度稀释至浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL的多肽稀释液。
多肽干预：取出96孔板，吸弃旧培养基，分别加入100μL不同浓度的多肽稀释液进行孵育（不同浓度多肽干预组，每个多肽稀释液浓度设3个复孔），对照孔添加100μL含血清的培养基进行孵育（对照组，设3个复孔）。24h后吸出上清液，用PBS清洗数次，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL和含血清的培养基180μL，于培养箱中继续培养4h。
细胞活力检测：弃去含有MTT的培养液，每孔加入150μL的DMSO于震荡器上震荡10min后，测定490nm波长下的吸光度。
L929细胞对照组的细胞活力以100%计，不同浓度多肽干预组的细胞活力以干预组细胞数量与对照组细胞数量的百分比计。
实验结果如图4所示。
（1）随着多肽浓度的增加，L929细胞的细胞活力显著降低（P<0.05）。
（2）当多肽的作用浓度达到1000μg/mL时，细胞活力低至89.11%。
上述实验结果表明，本发明多肽对L929细胞具有较强的生长抑制作用，且该抑制作用具有浓度依赖性。
由此，本发明的多肽可用于纤维化疾病的预防和/或治疗。针对人和/或动物受试者的不同，本领域技术人员可进一步确定对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的本发明多肽的量。
由此，本发明的多肽还可用于体外抑制成纤维细胞的增殖。针对不同的实验条件及实验目的，本领域技术人员可进一步确定对体外培养的成纤维细胞产生功能或活性的本发明多肽的量。
为了获得预期的多肽性能，例如便于给药、降低多肽对正常组织的毒性、延长在体内血液循环系统中停留时长、提高靶向性等，可以将本发明的多肽与适宜的偶联部分相连。由此，得到包含本发明实施例多肽的缀合物。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (14)
1.一种多肽或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。
2.一种缀合物，其特征在于，包括多肽和缀合部分，所述缀合部分与所述多肽相偶联；
所述多肽的氨基酸序列为MMWTPR。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其特征在于，所述偶联部分包括载体、药物、毒素、细胞因子、蛋白标签、修饰物、治疗剂和化疗剂中的至少之一。
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的多肽。
5.一种构建体，其特征在于，包括权利要求4所述的核酸分子。
6.一种细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的构建体；或表达权利要求1所述的多肽。
7.一种抑制剂，其特征在于，包括：
权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的缀合物。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐、权利要求2所述的缀合物或者权利要求7所述的抑制剂。
9.一种组合物，其特征在于，包含：权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐或权利要求2所述的缀合物或者权利要求7所述的抑制剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，进一步包括药学上可接受的辅料。
11.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物为注射剂。
12.权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐、权利要求2～3任一项所述的缀合物、权利要求7所述的抑制剂或权利要求9～11任一项所述的组合物在制备产品中的用途，所述产品用于抑制成纤维细胞增殖或者预防和/或治疗纤维化疾病。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述产品选自药物、细胞培养物或试剂盒；
当所述产品为药物时，所述产品用于预防和/或治疗纤维化疾病；
当所述产品为细胞培养物或试剂盒时，所述产品用于抑制成纤维细胞的增殖。
14.一种体外抑制成纤维细胞增殖的方法，其特征在于，包括：
将所述成纤维细胞与权利要求1所述的多肽或其药学上可接受的盐、权利要求2～3任一项所述的缀合物、权利要求7所述的抑制剂或权利要求9～11任一项所述的组合物进行接触。
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