CN116789668A - 氨基酸修饰的r,r-七环羧酸,其合成,活性和应用 - Google Patents

氨基酸修饰的r,r-七环羧酸,其合成,活性和应用 Download PDF

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CN116789668A CN202310612460.9A CN202310612460A CN116789668A CN 116789668 A CN116789668 A CN 116789668A CN 202310612460 A CN202310612460 A CN 202310612460A CN 116789668 A CN116789668 A CN 116789668A
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Abstract

本发明公开了下式的R,R‑七环羧酸‑AA(AA表示：L‑Ala残基、L‑Phe残基、L‑Ile残基、L‑Leu残基、L‑Trp残基、L‑Asp残基、Gly残基、L‑Lys残基、L‑Pro残基、L‑Gln残基、L‑Ser残基、L‑Thr残基、L‑Val残基、L‑Tyr残基)，公开了它的制备方法,公开了它们的抗动脉血栓活性，公开了它抑制体内P‑选择素表达的活性。因而本发明公开了它在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备P‑选择素拮抗剂中的应用。

Description

氨基酸修饰的R,R-七环羧酸,其合成,活性和应用
技术领域
本发明涉及下式的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基)，涉及它的制备方法，涉及它的抗动脉血栓活性，涉及它抑制体内P-选择素表达的活性。因而本发明涉及它们在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备P-选择素拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
心血管疾病是危害人类健康的严重疾病，一直以来被世界卫生组织列为人类疾31.8％病的最主要的死亡原因之一。根据我国国家统计局统计，2015-2019年我国主要疾病死亡率和死因构成中，恶性肿瘤、心脏病和脑血管病居前三位。心血管疾病死亡率居首位，占居民疾病死亡构成40％以上。心血管疾病中由于血栓形成导致了病理性变化，因此血栓的预防及治疗一直是医药领域所关注的重点。目前的抗栓药物，虽然能够用有效的抑制血栓的形成，但由于其影响止血功能或出血风险，降低了其安全性并限制了临床疗效。β-咔啉类生物碱的多种生物活性包括抑制血小板聚集的活性都已公开。发明人也曾经公开了一系列具有抗动脉血栓活性的β-咔啉-3-甲酰寡肽，它们的静脉给药剂量为5μmol/kg，静脉注射使它们进入血液循环并迅速达到高的血药浓度。但正是由于高浓度，它们迅速到达血浆和组织而增加发生不良反应的风险。这是静脉给药本身的固有缺陷，只能通过发明可口服的化合物才能解决。发明人假设，两个β-咔啉药效团融合，例如2个(R)-1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸经分子间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(简称R,R-七环醛)，将醛氧化成羧酸，R,R-七环羧酸应有强的抗动脉血栓活性，发明人进一步假设，用氨基酸修饰这种新型七环羧酸，应具有更强的抗动脉血栓活性。于是，发明人提出本发明。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下式的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基)。
本发明的第二个内容是提供(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基)的合成方法，该方法包括：
(1)将L-色氨酸苄酯在三氟乙酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合,得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)；
(2)在甲醇溶液中1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下,与H2反应脱去苄酯得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；
(3)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)条件下，1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中进行分子间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(3-R,R)；
(4)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，在冰醋酸、水的条件下，将缩醛转变为醛基得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(4-R,R)；
(5)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在高锰酸钾为氧化剂的条件下，将醛氧化为羧酸得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲酸)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5-R,R)；
(6)在2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)条件下，(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲酸)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，与14种天然氨基酸苄酯进行分子间缩合反应，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AAOBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(6-AA)。AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基；
(7)在甲醇溶液中(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AAOBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物在Pd/C催化下,与H2反应脱去苄酯得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(7-AA)。AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基。
本发明的第三个内容是评价(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮抗动血栓形成的活性。
本发明的第四个内容是评价(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮抑制体内P-选择素表达活性。
附图说明
图1.(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮的合成路线i)1,1,3,3-Tetramethoxypropane,TFA,DCM；ii)H2,Pd/C,MeOH；iii)DCC,HOBt,NMM,,DMF；iv)HAc,H2O；v)KMnO4,DMF；vi)HATU,DIEA,DMF,(6A中的AA为L-Ala残基；6F中的AA为L-Phe残基；6I中的AA为L-Ile残基；6L中的AA为L-Leu残基；6W中的AA为L-Trp残基；6D中的AA为L-Asp残基；6G中的AA为Gly残基；6K中的AA为L-Lys残基；6P中的AA为L-Pro残基；6E中的AA为L-Gln残基；6S中的AA为L-Ser残基；6T中的AA为L-Thr残基；6V中的AA为L-Val残基；6Y中的AA为L-Tyr残基)；vii)H2,Pd/C,MeOH,AA-OBzl；vii)H2,Pd/C,MeOH,(7-A中的AA为L-Ala残基；7-F中的AA为L-Phe残基；7-I中的AA为L-Ile残基；7-L中的AA为L-Leu残基；7-W中的AA为L-Trp残基；7-D中的AA为L-Asp残基；7-G中的AA为Gly残基；7-K中的AA为L-Lys残基；7-P中的AA为L-Pro残基；7-E中的AA为L-Gln残基；7-S中的AA为L-Ser残基；7-T中的AA为L-Thr残基；7-V中的AA为L-Val残基；7-Y中的AA为L-Tyr残基。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)量取25mL二氯甲烷(DCM)，2.9mL 1,1,3,3-四甲氧基丙烷，2.9mL三氟乙酸(TFA)于250mL茄瓶中，冰浴条件下活化40分钟，溶液由无色变为微黄色。用20mL二氯甲烷溶解2854mg色氨酸苄酯加入上述活化后的反应液中，室温下搅拌反应16.5小时，溶液逐渐变至黄色至红棕色，TLC(DCM：MeOH＝20:1)监测反应，原料点消失，有新点产生，反应完全。将反应液移至250mL分液漏斗中，分别用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液萃洗三次，收集二氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥2小时，过滤除去硫酸钠，滤液减压浓缩得到4839mg红棕色油状物，硅胶柱层析纯化(PE/E A体系)得到2721mg红棕色油状物，收率为71.2％，即为标题化合物。ESI-MS(m/e):395[M+H]+,393[M-H]-。
实施例2制备1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)
称取2850mg化合物1于100mL茄瓶中，加入20毫升甲醇溶解，加入570mg钯碳，抽除反应瓶内的空气并充入氢气，室温下加压反应。反应16小时后，TLC(PE：EA＝1:1)监测反应，原料点消失，有新点生成，反应完全，将反应液过滤，将滤液减压浓缩，得到2031mg黄色粉末，收率为92.3％，即为标题化合物,ESI-MS(m/e):305[M+H]+,303[M-H]-。
实施例3制备(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1’,4’-二酮(3-R,R)
称取1802mg化合物2于100毫升茄瓶中，加入25毫升DMF溶解，继续称取2487mgHATU加入反应瓶中搅拌溶解，冰浴条件下用NMM调节反应液PH＝8～9，室温下搅拌反应。反应48小时后，TLC(DCM:MeOH＝20:1)监测反应，原料点消失，且伴有新点生成，反应完全。将反应液移至250mL分液漏斗中，加入120毫升水，再加入40毫升乙酸乙酯，保留酯层，继续用乙酸乙酯萃洗2次，合并酯层，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、5％硫酸氢钾溶液、饱和氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液分别萃洗三次，保留酯层，无水硫酸钠干燥2小时，过滤，滤液旋干得1620mg红棕色油状物，经PE/EA体系硅胶柱层析纯化，得到290mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率为17.1％。1HNMR NOES Y谱鉴定为RR构型，1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝＝11.07(s,2H),7.58(d,J＝7.7Hz,2H),7.38(d,J＝7.9Hz,2H),7.14–6.97(4H),5.46(d,J＝6.2Hz,2H),4.30(dd,J＝11.4,5.3Hz,2H),4.19(d,J＝5.7Hz,2H),3.43(dd,J＝15.8,5.3Hz,2H),3.13(d,J＝13.5Hz,10H),3.07–2.96(2H),2.09(s,4H).ESI-MS(m/e):573[M+H]+。
实施例4(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(4-R,R)
称取化合物3-R,R 483mg于25毫升茄瓶中，加入10毫升HAc溶解，加入1毫升水，室温下搅拌反应24小时，TLC(PE：EA＝1：1)监测反应，原料点消失，反应完全，反应过程中反应液由澄清变浑浊，有物质析出。冰浴条件下加入约50毫升2N NaOH溶液调p H＝7，加入60毫升乙酸乙酯萃洗，萃洗三次，弃水层，合并酯层，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液萃取三次，弃水层，滤液用无水硫酸钠干燥，过滤旋干得300mg黄色粉末，即为标题化合物，收率为74.1％，ESI-MS(m/e):961[2M+H]+。
实施例5(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲酸)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5-R,R)
称取160mg化合物4-R,R于50毫升茄瓶中，加入5毫升DMF溶解，搅拌状态下加入130mg高锰酸钾，室温下搅拌反应9.5小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测反应，原料点消失，反应完全。将反应液倒入表面皿中晾干DMF，用甲醇复溶，过滤除去MnO2,滤液旋干得红棕色粉末164mg。经DCM/MeOH体系硅胶柱层析得到25mg红棕色粉末，即为标题化合物，收率为14.7％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝＝12.34(s,2H),10.91(s,2H),7.58(d,J＝7.7Hz,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,2H),7.11–7.01(5H),5.67(dd,J＝8.1,3.9Hz,2H),4.34(dd,J＝11.4,5.4Hz,2H),3.47(d,J＝5.2Hz,2H),3.04(dd,J＝15.4,11.5Hz,3H),2.90–2.80(2H),2.75–2.64(3H).ESI-MS(m/e):511[M-H]-。
实施例6制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ala OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(6A)
称取145mg的5-R,R、411mg HATU和236mg Tos·Ala-OBz l于50毫升茄瓶中，加入7毫升DMF溶解，冰浴条件下加入DIEA调节pH至8～9,室温下搅拌反应。反应15小时后，TLC(DCM:Me OH＝30:1)监测反应，原料点消失，反应完全，停止反应。将反应液转移至100毫升分液漏斗，加入50毫升水，有大量不溶物析出，加入20毫升乙酸乙酯萃洗3次，弃水层，合并酯层，依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液、5％硫酸氢钾溶液、饱和氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液萃洗3次，酯层用无水硫酸钠干燥2小时，过滤除去硫酸钠，滤液减压浓缩后经DCM/MeOH硅胶柱层析纯化得198mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率70.9％。ES I-MS(m/e):833[M-H]+。
实施例7制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Val-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6V)
采用实例6的方法从210mg的5-R,R、343mg HATU和622mg Val-OBzl中得到233mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率63.8％。ESI-MS(m/e):913[M+Na]+。
实施例8制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Gly-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6G)
采用实例6的方法从520mg的5-R,R、177mg HATU和511mg Gly-OBzl中得到75mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率9.2％。ESI-MS(m/e):841[M+Cl]+。
实施例9制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Tyr-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6Y)
采用实例6的方法从140mg的5-R,R、228mg HATU和185mg HCl·Tyr-OBzl得到187mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率67.2％。ESI-MS(m/e):1019[M+H]+。
实施例10制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-ILe-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6I)
采用实例6的方法从135mg的5-R,R、220mg HATU和518mg Tos·Ile-OBzl得到201mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率83％。ESI-MS(m/e):957[M+K]+。
实施例11制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Le u-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6L)
采用实例6的方法从150mg的5-R,R、245mg HATU和254mg Tos·Leu-OBzl中得到221mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率82.4％。ESI-MS(m/e):941[M+Na]+
实施例12制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Th r-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6T)
采用实例6的方法从150mg的5-R,R、245mg HATU和158mg HCl·Thr-OBzl得到192mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率73.5％。ESI-MS(m/e):895[M+H]+。
实施例13制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-GL u-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6E)
采用实例6的方法从150mg的5-R,R、245mg HATU和234mg HCl·Glu(OBzl)-OBzl得到331mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率76.1％。ESI-MS(m/e):1131[M+H]+。
实施例14制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-As p-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6D)
采用实例6的方法从129mg的5-R,R、209mg HATU和436mg Asp(OBzl)-OBzl得到62mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率22.3％。ESI-MS(m/e):1125[M+Na]+。
实施例15制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Pr o-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6P)
采用实例6的方法从227mg的5-R,R、370mg HATU和529mg HCl·Pro-OBzl得到242mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率61.5％。ESI-MS(m/e):925[M+K]+。
实施例16制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Se r-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6S)
采用实例6的方法从135mg的5-R,R、220mg HATU和305mg HCl·Ser-OBzl得到138mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率60.5％。ESI-MS(m/e):889[M+Na]+。
实施例17制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ly s-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6K)
采用实例6的方法从85mg的5-R,R、139mg HATU和337mg HCl·Lys(Z)-OBzl得到145mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率72.1％。ESI-MS(m/e):1217[M+H]+。
实施例18制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ph e-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6F)
采用实例6的方法从145mg的5-R,R、411mg HATU和236mg HCl·Phe-OBzl得到198mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率70.9％。ESI-MS(m/e):987[M+H]+。
实施例19制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Tr p-OBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6W)
采用实例6的方法从229mg的5-R,R、376mg HATU和327m g HCl·Trp-OBzl得到422mg黄棕色粉末，即为标题化合物，收率70.9％。ESI-MS(m/e):1087[M+Na]+。
实施例20制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ala)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-A)
称取137mg 6A于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应17小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到50.5mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率50.5％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.46(s,2H),10.61(s,2H),7.69(d,J＝9.0Hz,1H),7.55(s,1H),7.32(d,J＝19.8Hz,6H),7.03(d,J＝19.7Hz,2H),5.32–4.86(2H),4.27–4.11(2H),3.52(d,J＝6.3Hz,1H),2.92(4H),2.71(d,J＝12.6Hz,1H),2.29(d,J＝7.9Hz,1H),2.18(t,J＝7.3Hz,1H),1.64(t,J＝7.2Hz,1H),1.44(q,J＝7.0Hz,1H),1.23(s,6H).ESI-MS(m/e):655[M+H]+。
实施例21制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Val)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-V)
称取95mg 6V于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应16小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到60mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率80％。1H NMR(300MH z,DMSO-d6):δ/ppm＝12.71(s,2H),10.60(s,2H),7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.82(d,J＝8.3Hz,1H),7.55(d,J＝7.8Hz,2H),7.37(d,J＝7.2Hz,2H),7.13–6.95(4H),5.72(dd,J＝12.1,9.0Hz,2H),4.36–4.20(2H),4.14(d,J＝7.1Hz,1H),3.17(s,2H),2.97(d,J＝15.5Hz,2H),2.89(s,1H),2.65(t,J＝11.9H z,2H),2.09–2.02(2H),0.88(d,J＝6.8Hz,6H),0.75(t,J＝6.1Hz,6H).ESI-MS(m/e):733[M+Na]+。
实施例22制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Gl y)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-G)
称取75mg化合物6G于50毫升茄瓶中，加入4毫升甲醇，不溶，复加少许二氯甲烷溶解，此时反应液呈澄清黄色液体，称取30mg Pd/C于反应瓶中，抽去瓶内空气，通氢气加压，室温下搅拌反应。反应16小时后，TLC(DCM:PE:EA＝1:1:2)监测，原料点基本消失，但仍有残留，继续通入氢气反应20小时后，TLC监测原料点消失，反应完全，停止反应。过滤，滤液旋干，得到55mg黄色粉末，即为标题化合物，收率94.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.71(s,2H),8.10(t,J＝5.8Hz,2H),7.56(d,J＝7.6Hz,2H),7.38(d,J＝7.8Hz,2H),7.03(dt,J＝19.0,7.2Hz,4H),5.72(dd,J＝9.1,3.8Hz,2H),4.31(dd,J＝11.5,5.3Hz,1H),4.22(t,J＝6.5Hz,1H),3.76(dd,J＝17.5,5.9Hz,2H),3.69–3.58(2H),2.99(dd,J＝15.5,11.6Hz,2H),2.85(dd,J＝14.3,3.8Hz,2H),2.69(s,2H).ESI-MS(m/e):627[M+H]+。
实施例23制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ty r)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-Y)
称取95mg 6Y于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应15小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，经DC M/MeOH体系硅胶柱层析纯化，得到30mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率38.4％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.57(s,2H),7.94(d,J＝7.5Hz,2H),7.56(d,J＝7.4Hz,2H),7.40(d,J＝7.7Hz,2H),7.03(dt,J＝18.7,7.1Hz,4H),6.86(d,J＝7.8Hz,4H),6.56(d,J＝7.8Hz,4H),5.72–5.60(2H),4.38–4.20(4H),3.55–3.41(2H),3.07–2.91(2H),2.86–2.67(8H).E SI-MS(m/e):839[M+H]+。
实施例24制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ile)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-I)
称取125mg 6I于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应16小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到45mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率45.0％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.65–8.30(2H),7.52(s,2H),7.38(d,J＝11.0Hz,4H),7.03(s,2H),5.32–5.03(2H),4.26(d,J＝36.9Hz,2H),3.90(d,J＝10.1Hz,2H),3.56(d,J＝26.9Hz,2H),3.28(s,2H),3.17(s,2H),2.77(d,J＝24.8Hz,2H),1.87(d,J＝30.3Hz,2H),1.48(s,2H),0.89(dt,J＝19.2,6.4Hz,12H).E SI-MS(m/e):1499[2M+Na]+。
实施例25制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Le u)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-L)
称取200mg 6L于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应14小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，经D CM/MeOH体系硅胶柱层析纯化，得到56mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率34.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.64(s,2H),10.60(s,2H),7.92(d,J＝7.8Hz,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,2H),7.38(d,J＝7.9Hz,2H),7.03(dt,J＝18.3,7.3Hz,4H),5.67(dd,J＝8.2,3.4Hz,2H),4.31(dd,J＝11.5,5.2Hz,2H),4.18(q,J＝7.7Hz,2H),3.46–3.36(2H),2.98(d,J＝10.4Hz,2H),2.89–2.83(2H),2.63(dd,J＝14.4,8.5Hz,2H),1.66(dd,J＝14.3,6.2Hz,1H),1.50–1.42(2H),1.33(d,J＝7.6H z,2H),1.24(s,2H),0.89(tt,J＝12.8,5.5Hz,6H),0.70(t,J＝5.3Hz,6H).ESI-MS(m/e):761[M+Na]+。
实施例26制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Th r)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-T)
称取190mg 6T于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应17小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到150mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率98.8％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.60(s,2H),7.84(s,1H),7.73(d,J＝8.5Hz,1H),7.55(d,J＝7.8Hz,2H),7.39(d,J＝7.9Hz,2H),7.13–6.96(4H),5.71(dd,J＝8.8,3.3Hz,2H),4.31(dd,J＝11.5,5.1Hz,2H),4.22(td,J＝5.9,3.2Hz,2H),4.08(ddd,J＝20.2,6.4,3.4Hz,4H),3.45(dd,J＝15.4,4.9Hz,2H),3.00(ddd,J＝18.7,9.2,5.9Hz,4H),2.85(d,J＝20.9Hz,2H),1.77–1.58(2H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.92(d,J＝6.3Hz,3H).ES I-MS(m/e):715[M+H]+。
实施例27制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Gl u)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-E)
称取150mg 6E于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应48小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到95mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率93.1％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.60(s,2H),8.13(d,J＝7.7Hz,2H),8.01(d,J＝7.4Hz,2H),7.55(d,J＝7.6Hz,2H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.11–6.97(4H),5.69(dd,J＝9.3,3.5Hz,2H),4.34–4.27(2H),4.25–4.14(2H),3.64–3.57(2H),3.49–3.42(1H),2.99(s,2H),2.84(s,2H),2.42(t,J＝7.4Hz,2H),2.26(d,J＝7.9Hz,2H),2.14(d,J＝7.8Hz,4H).ESI-MS(m/e):771[M+H]+。
实施例28制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-As p)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-D)
称取52mg 6D于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应48小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到30mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率83.3％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝12.57(s,4H),10.63(s,2H),8.22(d,J＝7.9Hz,2H),7.56(d,J＝7.6Hz,2H),7.43–7.35(2H),7.03(dt,J＝18.6,7.2Hz,2H),6.65(d,J＝8.5Hz,2H),5.69(d,J＝3.4Hz,0H),4.56–4.46(2H),4.44–4.36(1H),4.30(dd,J＝11.7,5.1Hz,1H),3.52–3.29(2H),3.05–2.82(2H),2.73–2.53(8H).ESI-MS(m/e):743[M+H]+。
实施例29制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Pr o)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-P)
称取240mg 6P于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应16小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到180mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率94.2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.22(s,2H),7.76–7.65(2H),7.55(d,J＝7.6Hz,1H),7.41–7.37(1H),7.31(d,J＝4.7Hz,1H),7.09–6.98(3H),5.71(s,1H),4.47(d,J＝11.6Hz,1H),4.33–4.28(1H),4.25–4.16(3H),3.91(dd,J＝8.4,4.4Hz,1H),3.72(d,J＝9.6Hz,1H),3.50(q,J＝6.2Hz,5H),3.34(t,J＝7.5Hz,3H),2.84–2.73(m,4H),1.89(s,1H),1.84(d,J＝6.9Hz,5H).ESI-MS(m/e):729[M+Na]+。
实施例30制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ser)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-S)
称取138mg 6S于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应16小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到106mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率97.2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.64(s,2H),8.03(d,J＝8.1Hz,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),7.70(dt,J＝13.1,4.7Hz,2H),7.56(d,J＝7.5Hz,2H),7.38(d,J＝8.0Hz,2H),7.14–6.94(4H),5.72(d,J＝6.3Hz,2H),4.24(dd,J＝15.0,8.4Hz,4H),3.67–3.56(4H),3.02(d,J＝12.6Hz,2H),2.97–2.88(2H),2.83–2.67(4H),1.64(dt,J＝14.4,6.8Hz,2H),1.37(q,J＝7.5Hz,2H).ESI-MS(m/e):725[M+K]+。
实施例31制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ly s)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-K)
称取203mg 6K于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应15小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，经C18柱层析纯化，得到52mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率40.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝11.05(s,2H),7.92(d,J＝7.7Hz,2H),7.53(d,J＝7.7Hz,2H),7.41–7.31(2H),7.02(dq,J＝18.6,7.3Hz,4H),5.62(s,2H),4.39–4.22(2H),4.10–3.87(6H),2.72(q,J＝7.2Hz,8H),1.66(t,J＝7.0Hz,2H),1.51(p,J＝7.4Hz,8H),1.31(q,J＝7.7Hz,6H).ESI-MS(m/e):807[M+K]+。
实施例32制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Ph e)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-F)
称取246mg 6F于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应16小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到181mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率90％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝8.33(s,1H),8.22(s,1H),7.95(d,J＝14.0Hz,1H),7.80(d,J＝8.6Hz,1H),7.70(dt,J＝14.2,5.0Hz,2H),7.30(d,J＝9.7Hz,10H),7.13–7.03(6H),5.75–5.53(2H),5.18(d,J＝7.2Hz,1H),5.11–4.97(2H),4.87(d,J＝12.3Hz,1H),4.41(s,1H),4.23(t,J＝6.6Hz,1H),3.87(d,J＝6.2Hz,1H),3.78(d,J＝28.6Hz,1H),3.32(d,J＝3.6Hz,2H),3.30(s,2H),3.19(d,J＝9.1Hz,1H),3.11(d,J＝4.9Hz,2H),3.06(d,J＝6.6Hz,1H).ESI-MS(m/e):807[M+H]+。
实施例33制备化合物(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-Tr p)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(7-W)
称取305mg 6W于50毫升茄瓶中，加入20毫升甲醇、2毫升二氯甲烷溶解，加入20mgPd/C，抽去瓶内空气，通入氢气加压在室温下搅拌反应17小时，TLC(DCM:MeOH＝30:1)监测，原料点消失，有新点生成，停止反应。过滤除去Pd/C，滤液旋干，得到175mg淡黄色粉末，即为标题化合物，收率69.2％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm＝10.93(s,1H),10.86(s,1H),10.78(s,1H),10.53(s,1H),8.23(s,1H),8.14(d,J＝5.9Hz,1H),8.01(d,J＝7.7Hz,1H),7.77(d,J＝8.9Hz,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,2H),7.53(d,J＝8.4Hz,2H),7.34(dd,J＝10.6,7.9Hz,4H),7.11–7.01(m,10H),6.43(d,J＝7.9Hz,1H),5.69(d,J＝9.3Hz,1H),4.48(s,1H),4.40(d,J＝5.8Hz,1H),4.25(dt,J＝18.1,6.3Hz,2H),3.70(d,J＝10.7Hz,2H),3.41–3.33(4H),3.29(s,2H),3.13–3.03(4H).ESI-MS(m/e):885[M+H]+。
实施例45评价5-R,R,7-AA的抗动脉血栓活性
1)实验材料：
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(CAS：9041-08-1，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
2)实验动物：
SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
3)实验方法：
实验采用动静脉旁路丝线血栓形成模型。
4)旁路插管的准备：
旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管受热拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段由内径3.5mm的聚乙烯管构成，定长为8.0cm；将表面毛糙的丝线定长为6.0cm，选用重4.0±0.1mg且毛糙程度相同的丝线。三段聚乙烯管内壁均用1％的硅醚溶液(1％硅油的乙醚溶液)进行硅烷化，在完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中，利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。
5)分组及给药剂量：
5-R,R剂量为1μmol/kg和0.1μmol/kg；7-AA系列化合物剂量为0.1μmol/kg；阳性对照阿司匹林剂量为167μmol/kg，阴性对照为5‰羧甲基纤维素钠水溶液。
6)所用试剂配制：
麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液，抗凝剂为用生理盐水配制的42mg/100mL的肝素钠水溶液。
7)实验操作：
以0.3mL/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1mL/100g体重的剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外循环旁路。
维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，吸去丝线上的浮血后称量并记录其湿重，代表抗动脉血栓活性。
8)实验结果及讨论：
利用动静脉旁路丝线血栓形成模型评价5-R,R和7-AA系列化合物的体内抗动脉血栓形成的活性。口服给予的阴性对照组的血栓湿重为31.2±4.8mg，而口服给予的阳性对照167μmol/kg的阿司匹林组的血栓湿重为19.7±5.1mg，这两组数据具有显著性差距P<0.05，这表明该模型建立成功。
在1μmol/kg和0.1μmol/kg口服给药的剂量下，5-R,R的血栓湿重分别为25.9±5.3mg和25.4±2.4mg，与阴性对照羧甲基纤维素钠组(血栓湿重为31.2±4.8mg)相比具有显著差异P<0.05，这表明5-R,R可以抑制体内动脉血栓的形成，表现出良好的抗动脉血栓活性。
在0.1μmol/kg口服给药剂量下，7-AA系列化合物组中，除7-K、7-F、7-W外，其他化合物组的血栓湿重与阴性对照羧甲基纤维素钠组相比均具有显著性差异P<0.05。其中化合物7-V、7-Y、7-T在0.1μmol/kg口服给药的剂量下血栓湿重分别为：23.0±6.0mg、23.2±6.5mg、22.5±3.8mg，与阳性对照167μmol/kg的阿司匹林组(血栓湿重为19.7±5.1mg)相比没有显著性差异P>0.05，这表明化合物7-V、7-Y、7-T的抗动脉血栓活性比阿司匹林强1670倍，具有更好的抑制动脉血栓形成的活性。并且7-AA系列化合物在0.1μmol/kg口服给药的剂量下血栓湿重与1μmol/kg口服给药的剂量下5-RR的血栓湿重相比没有显著性差异P>0.05，这表明在降低了10倍的剂量下，通过氨基酸修饰后得到的目标化合物具有更好的抑制体内动脉血栓形成的活性。本发明具有意想不到的技术效果。
表1受试化合物的抗动脉血栓活性
a)与羧甲基纤维素钠比P<0.05；b)与167μmol/kg阿司匹林比P>0.05；n＝12.
实施例46评价化合物7-T抗动脉血栓的剂量依赖关系
1)实验材料：
乌拉坦(氨基甲酸乙酯，CAS：51-79-6，国药集团化学试剂有限公司)、肝素钠(CAS：9041-08-1，百灵威科技有限公司)、生理盐水(石家庄四药有限公司)。
2)实验动物：
SD品系大鼠，雄性，200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
3)实验方法：
实验采用动静脉旁路丝线血栓形成模型。
4)旁路插管的准备：
旁路插管由三段组成，将内径1.0mm，外径2.0mm的聚乙烯管受热拉成一端为斜口的细管，定长为10.0cm，分别为右颈静脉和左颈动脉插管，位于旁路插管的两端；中段由内径3.5mm的聚乙烯管构成，定长为8.0cm；将表面毛糙的丝线定长为6.0cm，选用重4.0±0.1mg且毛糙程度相同的丝线。三段聚乙烯管内壁均用1％的硅醚溶液(1％硅油的乙醚溶液)进行硅烷化，在完全晾干后，将丝线于颈动脉插管方向置于中段聚乙烯管中，利用封口膜将三段聚乙烯管组装并固定，插管前需在管中充满肝素。
5)分组及给药剂量：
7-T为三个剂量分别是0.01μmol/kg、0.1μmol/kg、1μmol/kg；阳性对照阿司匹林剂量为167μmol/kg，阴性对照为5‰羧甲基纤维素钠水溶液。
6)所用试剂配制：
麻醉剂为用生理盐水配制的20％的乌拉坦水溶液，抗凝剂为用生理盐水配制的42mg/100mL的肝素钠水溶液。
7)实验操作：
以0.3mL/100g体重的剂量分别对大鼠进行灌胃给药，给药30min后腹腔注射20％的乌拉坦溶液进行麻醉(0.7mL/100g)。仰卧位将大鼠固定于大鼠固定板上，剪开颈部皮肤，分离右颈总动脉及左颈外静脉，分别将右颈总动脉和左颈外静脉的远心端用手术线进行结扎，于暴露的左颈外静脉剪一V字型小口，将上面制好的旁路插管的静脉端斜口插入左颈外静脉开口的近心端，插管处用手术线将血管与聚乙烯管固定，以0.1mL/100g体重的剂量通过旁路插管准确注入肝素钠水溶液，注射器不撤离聚乙烯管。用动脉夹夹住右颈总动脉近心端，在暴露的动脉上剪一V字型小口，将聚乙烯管的尖端从注射器取下，将管插入右颈总动脉的近心端，用手术线将动脉血管与聚乙烯管固定，松开动脉夹，建立体外循环旁路。
维持大鼠体温及旁路插管中血流通畅，体循环15min后先将静脉端插管剪断观察血液循环是否顺畅，从插管的动脉端取出血栓线，在滤纸上吸去丝线上的浮血后称量并记录其湿重，代表抗动脉血栓活性。8)实验结果及讨论：
利用动静脉旁路丝线血栓形成模型评价7-T的体内抗动脉血栓形成的活性是否存在剂量依赖关系。口服给予的阴性对照生理盐水组的血栓湿重为33.7±3.7mg，而口服给予的阳性对照167μmol/kg的阿司匹林组的血栓湿重为17.8±1.8mg，这两组数据具有显著性差距P<0.01，这表明该模型建立成功。
(1μmol/kg)7-T的栓重与生理盐水组相比P<0.01,与阿司匹林组相比P>0.05,说明在1μmol/kg的剂量下7-T表现出了优秀的抗动脉血栓活性。在降低10剂量之后，(0.1μmol/kg)7-T组的栓重与生理盐水组相比P<0.01，与阿司匹林组相比P>0.05且与(0.01μmol/kg)7-T相比P<0.05，说明在降低10倍计量后7-T仍具有抗动脉血栓活性，且存在剂量依赖关系；在降低100倍剂量后，(0.01μmol/kg)7-T的栓重与生理盐水组相比P>0.05，说明已经不具有抗动脉血栓活性。
表2三种剂量的化合物6l的抗动脉血栓活性
a)与羧甲基纤维素钠比P<0.05；b)与167μmol/kg阿司匹林比P>0.05；c)与(0.1μmol/kg,1μmol/kg)7-T比P<0.05,n＝10,11。
实施例47评价5-R,R,7-AA抑制体内P-选择素表达的活性1)实验仪器及材料：
高速离心机：Centrifuge 5810R,德国Eppendorf公司；
酶标仪：SpectraMax M3，Molecular Devices公司；
烘箱：101-1AB，天津市泰斯特仪器有限公司；
0.5-10μL移液枪：-8，德国BRAND公司；
10～100μL移液枪：S，德国BRAND公司；
10～300μL多通道移液枪：S，德国BRAND公司；
纯水：优普纯水机；
酶联免疫试剂盒Rat P-selectin ELISA kit(F2995-A，凡科维)。2)实验样本：
大鼠抗动脉血栓实验，体循环后动脉血。
3)实验方法：
采用大鼠P-选择素蛋白酶联免疫法进行测定。
4)样本的采集：
收集实验抗动脉血栓活性评价中经手术循环后的各组大鼠的动脉全血，室温下自然静置凝固20-30分钟，离心20分钟(3000转/分)，收集上清，分装，-20摄氏度冷冻保存。
5)样本检测：
测定前将待测样本在室温条件下平衡60分钟。试剂盒在室温下平衡30分钟。96孔酶标包被板设定标准品孔、空白孔、待测样品孔。操作时，先将标准孔内加入不同浓度的标准品50微升，在待测样品孔中先加入样品稀释液40微升，然后加入待测样品10微升，轻晃混匀。除空白孔外，每孔加入酶标试剂100微升。用封板膜封板后在37摄氏度孵箱中孵育1小时，孵育结束后揭去封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先后加入两种显色剂，轻轻震荡混匀，37摄氏度避光显色15分钟，显色结束后，每孔加入终止液50微升，终止反应。450nm波长下测定各孔的吸光度。
7)实验结果：
从表中的数据可以看出，在0.1μmol/kg的剂量下7-AA系列化合物治疗大鼠体内P-选择素含量显著低于羧甲基纤维素钠组治疗大鼠的P选择素含量(P＜0.05)，这表明所设计的目标化合物具有降低大鼠体内P-选择素含量的作用。
表3受试化合物降低体内P-选择素含量
a)与羧甲基纤维素钠比P<0.05；n＝3。

Claims (4)

1.下式的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基)。
2.权利要求1的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮的制备方法，该方法包括：
(1)将L-色氨酸苄酯在三氟乙酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合,得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)；
(2)在甲醇溶液中1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下,与H2反应脱去苄酯得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；
(3)在二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)条件下，1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中进行分子间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(3-R,R)；
(4)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，在冰醋酸、水的条件下，将缩醛转变为醛基得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(4-R,R)；
(5)(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲基)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在高锰酸钾为氧化剂的条件下，将醛氧化为羧酸得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲酸)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5-R,R)；
(6)在2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)条件下，(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-羰甲酸)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在DMF中，与14种天然氨基酸苄酯进行分子间缩合反应，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AAOBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(6-AA)。AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基；
(7)在甲醇溶液中(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AAOBzl)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物在Pd/C催化下,与H2反应脱去苄酯得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮系列化合物(7-AA)。AA表示：L-Ala残基、L-Phe残基、L-Ile残基、L-Leu残基、L-Trp残基、L-Asp残基、Gly残基、L-Lys残基、L-Pro残基、L-Gln残基、L-Ser残基、L-Thr残基、L-Val残基、L-Tyr残基。
3.权利要求1的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在制备抗动脉血栓药物中的应用。
4.权利要求1的(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1R-乙酰基-AA)-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮在制备P-选择素拮抗剂中的应用。
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