CN116789662A - 一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法 - Google Patents

一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116789662A
CN116789662A CN202310749927.4A CN202310749927A CN116789662A CN 116789662 A CN116789662 A CN 116789662A CN 202310749927 A CN202310749927 A CN 202310749927A CN 116789662 A CN116789662 A CN 116789662A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phellodendron
alkaloid
countercurrent chromatography
separating
extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310749927.4A
Other languages
English (en)
Inventor
王晓
朱姮
于金倩
耿岩玲
刘伟
纪文华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Analysis and Test Center
Original Assignee
Shandong Analysis and Test Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Analysis and Test Center filed Critical Shandong Analysis and Test Center
Priority to CN202310749927.4A priority Critical patent/CN116789662A/zh
Publication of CN116789662A publication Critical patent/CN116789662A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D455/00—Heterocyclic compounds containing quinolizine ring systems, e.g. emetine alkaloids, protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine
    • C07D455/03—Heterocyclic compounds containing quinolizine ring systems, e.g. emetine alkaloids, protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine containing quinolizine ring systems directly condensed with at least one six-membered carbocyclic ring, e.g. protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/68—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D211/72—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms, with at the most one bond to halogen, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D211/74—Oxygen atoms
    • C07D211/76—Oxygen atoms attached in position 2 or 6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/044—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring
    • C07D491/048—Ortho-condensed systems with only one oxygen atom as ring hetero atom in the oxygen-containing ring the oxygen-containing ring being five-membered

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，属于中药有效成分制备技术领域，包括以下步骤：步骤一、黄柏提取物的制备：取干燥黄柏药材，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄柏醇提物，步骤二、将步骤一中得到的黄柏醇提物用石油醚萃取，除去脂溶性杂质，步骤三、黄柏生物碱粗提物的制备：将步骤二中萃取后剩余水相用氨水调节pH至碱性，用氯仿萃取，蒸干氯仿相得黄柏生物碱粗提物。本发明中的黄柏生物碱粗提物，经pH区带逆流色谱和常规+循环逆流色谱分离后得到各单体成分经HPLC进行纯度检测，可得到95％以上的纯品，适用于从黄柏中快速纯化制备出高纯度的6种生物碱类化合物，耗时短，操作简便、方法重现性好。

Description

一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法
技术领域
本发明涉及中药有效成分制备技术领域，具体为一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法。
背景技术
黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮的功效，是中药中一种常用的清热药，用于治疗湿热泻痢，黄疸尿赤，带下阴痒，热淋涩痛，脚气痿躄，骨蒸劳热，盗汗，遗精，疮疡肿毒，湿疹湿疮，生物碱类是黄柏中主要化学成分，含量高达3％，主要包括小檗碱、药根碱、巴马汀、木兰花碱、异阔果芸香碱等。
目前对黄柏中生物碱类化合物的分离报道多采用硅胶柱色谱法、高压制备柱色谱法、大孔树脂柱色谱法等，传统柱色谱法存在耗时长、易导致样品不可逆吸附、样品变性和回收率低等缺点。
高速逆流色谱(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是一种液－液分配色谱分离技术，在高速旋转的螺旋管内两相溶剂体系建立一种特殊的单向性流体动力学平衡，其中一相溶剂系统作为固定相，另一相溶剂系统作为流动相，可以进行连续高效的色谱分离，高速逆流色谱法的固定相和流动相都是液体，没有不可逆吸附，与传统的分离纯化方法相比具有样品无损失、无污染、高效、快速等优点，此项技术己被广泛应用于天然产物、保健品、地质、农业、环境、材料、化工、海洋生物等领域样品的分离纯化。
pH区带精制逆流色谱(pH-CCC)是从常规逆流色谱分离过程中发展来的一种适用于有机酸或生物碱类化合物分离的色谱技术，其分离原理主要是依据待分离物质的解离常数(pKa)和疏水性的差异而实现分离，与常规的HSCCC相比具有进样量大(达到克级)、分离纯度高、分离时间短等优势。
发明内容
本发明提供的发明目的在于提供一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法。通过本发明一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，该高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，本发明中的黄柏生物碱粗提物，经pH区带逆流色谱和常规+循环逆流色谱分离后得到各单体成分经HPLC进行纯度检测，可得到95％以上的纯品：小檗碱(1)、巴马汀(2)、6－甲基哌啶-2－酮(3)、异阔果芸香碱(4)、氧化小檗碱(5)、表小檗碱(6)，高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法适用于从黄柏中快速纯化制备出高纯度的6种生物碱类化合物，耗时短，操作简便，单品纯度高、方法重现性好。
为了实现上述效果，本发明提供如下技术方案：一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、黄柏提取物的制备：取干燥黄柏药材，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄柏醇提物；
步骤二、将步骤一中得到的黄柏醇提物用石油醚萃取，除去脂溶性杂质；
步骤三、黄柏生物碱粗提物的制备：将步骤二中萃取后剩余水相用氨水调节pH至碱性，用氯仿萃取，蒸干氯仿相得黄柏生物碱粗提物；
步骤四、黄柏中生物碱单体成分的分离：针对步骤三中黄柏生物碱粗提物，进行pH区带逆流色谱和常规+循环逆流色谱分离，每隔5min收集一次馏分，最终成功分离得到6种生物碱类化合物。
进一步的，根据步骤一中的操作步骤，所述乙醇加热回流提取具体为：乙醇加热回流提取多次，合并滤液，减压旋蒸至无醇味，得黄柏醇提物。
进一步的，根据步骤一中的操作步骤，所述乙醇为体积比为50～～90％的乙醇，进一步优选为90％乙醇，
进一步的，根据步骤一中的操作步骤，所述乙醇加热回流提取中，固液比为1：10，提取3次，时间分别为2h，2h，1h，采用此条件的加热回流提取操作。
进一步的，根据步骤二中的操作步骤，所述采用黄柏醇提物用石油醚萃取处理具体为：石油醚萃取3次，弃去石油醚部分，水相为除去脂溶性杂质后的黄柏醇提物。
进一步的，根据步骤三中的操作步骤，所述黄柏生物碱粗提物的制备具体为：石油醚萃取后剩余水相用氨水调节pH至9～10，用氯仿萃取3次，合并氯仿相，减压蒸干得黄柏生物碱粗提物。
进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述黄柏中生物碱单体成分的分离具体为：采用pH区带逆流色谱得到2个生物碱成分和组分I，采用常规+循环逆流色谱分离得到4个生物碱成分。
进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述黄柏生物碱粗提物的pH区带逆流色谱，溶剂系统为氯仿-甲醇-水，体积比为4:3:3，上相为固定相(含有10mM HCl)，下相为流动相(含有10mM TEA)。
进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量2.0g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.7％，紫外检测器检测波长254nm，进行pH区带逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到2种生物碱类化合物和组分I，经NMR确证，结构分别为小檗碱和巴马汀。
进一步的，根据步骤四中的操作步骤，所述组分I的常规高速逆流色谱，溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，体积比为5:5:2:8，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率78.5％，紫外检测器检测波长254nm，进行常规+循环逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到4种高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为6-甲基哌啶-2-酮、异阔果芸香碱、氧化小檗碱、表小檗碱。
本发明提供了一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，具备以下有益效果：该高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，本发明中的黄柏生物碱粗提物，经pH区带逆流色谱和常规+循环逆流色谱分离后得到各单体成分经HPLC进行纯度检测，可得到95％以上的纯品：小檗碱(1)、巴马汀(2)、6-甲基哌啶-2-酮(3)、异阔果芸香碱(4)、氧化小檗碱(5)、表小檗碱(6)，高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法适用于从黄柏中快速纯化制备出高纯度的6种生物碱类化合物，耗时短，操作简便，单品纯度高、方法重现性好。
附图说明
图1为本发明实施例中pH区带逆流色谱和常规高速逆流色谱从黄柏生物碱粗提物中分离纯化生物碱类成分的色谱图；
图2为本发明实施例中常规+循环逆流色谱从黄柏生物碱粗提物中分离纯化生物碱类成分的色谱图；
图3为本发明实施例中黄柏生物碱粗提物及分离得到各单体化合物的高效液相色谱图；
图4为本发明实施例中分离纯化得到小檗碱(1)、巴马汀(2)、6－甲基哌啶-2－酮(3)、异阔果芸香碱(4)、氧化小檗碱(5)、表小檗碱(6)的结构式；
图5为本发明的制备流程示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于现有对黄柏中生物碱类化合物的分离纯化技术多采用传统柱色谱分离，耗时长、易导致样品不可逆吸附、样品变性和回收率低，本发明提出了一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，包括如下步骤：
步骤一、黄柏提取物的制备：取干燥黄柏药材，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄柏醇提物。
步骤二、将步骤一中得到的黄柏醇提物用石油醚萃取，除去脂溶性杂质。
步骤三、黄柏生物碱粗提物的制备：将步骤二中萃取后剩余水相用氨水调节pH至碱性，用氯仿萃取，蒸干氯仿相得黄柏生物碱粗提物。
步骤四、黄柏中生物碱单体成分的分离：针对步骤三中黄柏生物碱粗提物，进行pH区带逆流色谱和常规高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次馏分，最终成功分离得到6种生物碱类化合物。
该实施方式的一些实施例中，步骤一中，所述乙醇加热回流提取具体为：乙醇加热回流提取多次，合并滤液，减压旋蒸至无醇味，得黄柏醇提物。
采用乙醇进行加热回流，可以将黄柏中的活性成分尽可能多的提取出来。
优选的，所述乙醇为体积比为50％～90％的乙醇，进一步优选为90％乙醇。
优选的，乙醇加热回流提取中，固液比为1：10，提取3次，时间分别为2h，2h，1h。采用此条件的加热回流提取操作，可以尽可能多的获得黄柏中的活性成分，尤其是生物碱类化合物。
该实施方式的一些实施例中，步骤二中，所述采用黄柏醇提物用石油醚萃取处理具体为：石油醚萃取3次，弃去石油醚部分，水相为除去脂溶性杂质后的黄柏醇提物。
该实施方式的一些实施例中，步骤三中，所述黄柏生物碱粗提物的制备具体为：石油醚萃取后剩余水相用氨水调节pH至9～10，用氯仿萃取3次，合并氯仿相，减压蒸干得黄柏生物碱粗提物。
该实施方式的一些实施例中，步骤四中，所述黄柏中生物碱单体成分的分离具体为：采用pH区带逆流色谱得到2个生物碱成分和组分I，采用常规+循环逆流色谱分离得到4个生物碱成分。
优选的，针对黄柏生物碱粗提物的pH区带逆流色谱，溶剂系统为氯仿－甲醇一水，体积比为4:3:3，上相为固定相(含有10mMHCl)，下相为流动相(含有10mM TEA)，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量2.0g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.7％，紫外检测器检测波长254nm，进行pH区带逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到2种生物碱类化合物和组分I，经NMR确证，结构分别为小檗碱和巴马汀。
进一步优选的，针对组分I的常规高速逆流色谱，溶剂系统为石油醚－乙酸乙酯－甲醇一水，体积比为5:5:2:8，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率78.5％，紫外检测器检测波长254nm，进行常规+循环逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到4种高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为6－甲基哌啶-2－酮、异阔果芸香碱、氧化小檗碱、表小檗碱。
本发明的另一种典型实施方式，提供上述高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法得到的生物碱类化合物。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物
步骤一、黄柏提取物的制备：取干燥黄柏药材1.5kg，粉碎至20-40目，90％乙醇加热回流提取，固液比为1:10，提取3次，时间分别为2h，2h，1h，合并滤液，减压浓缩至无醇味，得黄柏醇提物。
步骤二、黄柏醇提物用石油醚萃取3次，弃去石油醚相，水相为除去脂溶性杂质后的黄柏醇提物。
步骤三、黄柏生物碱粗提物的制备：石油醚萃取后剩余水相用氨水调节pH至9～10，用氯仿萃取，减压蒸干氯仿相得黄柏生物碱粗提物(200g)。
步骤四、黄柏中生物碱单体成分的分离：
应用pH－区带逆流色谱对黄柏生物碱粗提物进行分离：
溶剂系统为氯仿－甲醇一水(4:3:3,v/v)，上相为固定相(含有10mM HCl)，下相为流动相(含有10mM TEA)，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量2.0g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.7％，紫外检测器检测波长254nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到2个生物碱成分和组分I；
经NMR确证，结构分别为小檗碱和巴马汀；
具体的操作步骤是：按溶剂系统氯仿－甲醇一水(4:3:3,v/v)溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，平衡后得到上下两相溶剂系统，上相为固定相(含有10mMHCl)，下相为流动相(含有10mM TEA)，取8mL含酸上相和8mL不含碱下相，将2.0g黄柏生物碱粗提物溶解于其中作为样品溶液。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，首先将固定相用泵以30mL/min的流速泵入色谱柱，待有上相流出后，设置紫外检测器波长为254nm，将配好的样品溶液注入进样阀，由load变为inject，使样品进入高速逆流色谱仪；同时使色谱柱正转，转速设置为800rpm；待转速达到800rpm后，以2.0mL/min的流速泵入流动相。然后根据紫外光谱图(图1)接收目标成分，2个生物碱成分和组分I。
应用常规+循环逆流色谱对部分I进行分离：
针对所得部分I，溶剂系统为石油醚－乙酸乙酯－甲醇一水(5:5:2:8,v/v)，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率78.5％，紫外检测器检测波长254nm，进行高速逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到4个生物碱类化合物；
经NMR确证，结构分别为6－甲基哌啶-2－酮、异阔果芸香碱、氧化小檗碱、表小檗碱；
具体的操作步骤是：按溶剂系统石油醚－乙酸乙酯－甲醇一水(5:5:2:8,v/v)溶剂比例配制溶剂系统，置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，平衡后得到上下两相溶剂系统，上相作为固定相，下相作为流动相，取8mL上相和8mL下相，将0.25g黄柏部分I溶解于其中作为样品溶液。采用上海同田公司研制的半制备型高速逆流色谱仪，首先将固定相用泵以30mL/min的流速泵入色谱柱，待有上相流出后，使色谱柱正转，转速设置为800rpm。待转速达到800rpm后，以2.0mL/min的流速泵入流动相，直至下相流出，设置紫外检测器波长为254nm，将配好的样品溶液注入进样阀，由load变为inject，使样品进入高速逆流色谱仪。然后根据紫外光谱图(图2)接收目标成分，得4个生物碱类成分。
利用高效液相色谱分析分离物，液相条件：Waters-C18(250×4.6mm,5μm)，紫外检测波长254nm，柱温：25℃，流速：1.0mL/min，进样量：10μL，流动相采用乙腈(A)和20mM乙酸铵溶液(B)梯度洗脱，梯度条件如下：0-5min,5％A to 20％A.5-30min,20％Ato 40％A.30-35min,40％A to 90％A。
图4为实施例1得到的六种生物碱类化合物的结构式，小檗碱(1)、巴马汀(2)、6－甲基哌啶-2－酮(3)、异阔果芸香碱(4)、氧化小檗碱(5)、表小檗碱(6)的结构式。
实施例2：对分离得到的单体成分进行结构鉴定
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得数据如下：
小檗碱(1)：ESI-MS,m/z 336.1[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:9.92(1H,s,H-8),8.97(1H,s,H-13),8.20(1H,d,J＝9.0Hz,H-11),8.01(1H,d,J＝9.0Hz,H-12),7.80(1H,s,H-1),7.09(1H,s,H-4),6.18(2H,s,2,3-OCH2O),4.95(2H,s,H-6),4.08(3H,S,10-OCH3),4.06(3H,S,9-OCH3),3.21(2H,s,H-5).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:150.87(C-4),150.28(C-11),148.15(C-5),145.94(C-10),144.14(C-12),137.94(C-16),133.47(C-17),131.15(C-13),127.21(C-7),124.01(C-8),121.88(C-14),120.92(C-9),120.69(C-18),108.90(C-3),105.92(C-6),102.56(C-15),62.41(11-OCH3),57.55(C-1),55.65(10-OCH3),26.81(C-2).
巴马汀(2)：ESI-MS,m/z 352.1[M+H]+.1H-NMR(MeOD,400MHz)δ:9.78(1H,s,H-8),8.82(1H,s,H-13),8.12(1H,d,J＝9.1Hz,H-11),8.03(1H,d,J＝9.1Hz,H-12),7.71(1H,s,H-1),7.06(1H,s,H-4),4.96(2H,t,J＝6.3Hz,H-6),4.23(3H,s,10-OCH3),4.12(3H,s,9-OCH3),4.01(3H,s,2-OCH3),3.96(3H,s,3-OCH3),3.30(2H,d,J＝6.3Hz,H-5).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:152.43(C-9),150.50(C-3),149.51(C-2),144.96(C-8),144.33(C-10),138.39(C-14),133.87(C-17),128.66(C-16),126.66(C-12),123.07(C-11),121.87(C-18),119.88(C-13),119.06(C-15),110.85(C-1),108.59(C-4),61.15(C-6),56.25(10-OCH3),55.96(9-OCH3),55.64(3-OCH3),55.28(2-OCH3),26.41(C-5).
6－甲基哌啶-2－酮(3)：ESI-MS,m/z 112.9[M-H]-.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:3.73(1H,m,H-6),1.25(3H,d,J＝6.5Hz,CH3).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:173.31(C-1),48.99(C-5),29.48(C-2),29.32(C-4),22.29(CH3),14.42(C-3).
异阔果芸香碱(4)：ESI-MS,m/z 260.1[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.27(1H,d,J＝7.5Hz,H-5),7.96(1H,t,J＝8.5Hz,H-7),7.90(1H,t,J＝7.5Hz,H-6),7.61(1H,t,J＝7.5Hz,H-8),5.13(1H,t,J＝8.5Hz,H-11),4.05(2H,d,J＝8.5Hz,H-10),3.92(3H,s,N-CH3),1.30(3H,s,H-14),1.16(3H,s,H-13).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:173.63(C-4),164.59(C-2),137.95(C-1),132.95(C-7),125.55(C-9),124.75(C-6),121.75(C-5),117.12(C-8),102.96(C-3),93.88(C-11),70.48(C-12),33.40(N-CH3),27.74(C-10),25.90(C-13),25.34(C-14).
氧化小檗碱(5)：ESI-MS,m/z 352.1[M+H]+.1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:7.32(1H,d,J＝8.7Hz,H-12),7.27(1H,d,J＝8.7Hz,H-11),7.21(1H,s,H-1),6.71(1H,s,H-13),6.70(1H,s,H-4),6.00(2H,s,OCH2O),4.34-4.25(2H,m,H-6),4.01(3H,s,10-OCH3),3.95(3H,s,9-OCH3),2.92-2.85(2H,m,H-5).
13C-NMR(CDCl3,100MHz)13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:160.10(C-8),151.44(C-10),149.62(C-9),148.45(C-3),147.36(C-2),135.66(C-13a),132.40(C-12a),130.05(C-4a),123.78(C-13b),122.26(C-12),119.42(C-11),119.09(C-8a),107.92(C-4),104.70(C-1),101.41(OCH2O),101.28(C-13),61.61(9-OCH3),56.91(10-OCH3),39.37(C-6),28.73(C-5).
表小檗碱(6)：ESI-MS,m/z 336.1[M+H]+.1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:9.97(1H,s,H-8),9.09(1H,s,H-13),8.03(1H,d,J＝8.7Hz,H-12),7.87(1H,d,J＝8.7Hz,H-11),7.71(1H,s,H-4),7.08(1H,s,H-1),6.53(2H,s,OCH2O),4.91(2H,t,H-6),3.94(3H,s,3-OCH3),3.87(3H,s,2-OCH3),3.22(2H,t,H-5).
13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:151.97(C-2),149.25(C-3),147.40(C-9),145.02(C-10),144.27(C-8),137.53(C-13a),132.96(C-12a),129.00(C-4a),122.12(C-13),121.46(C-12),121.24(C-11),119.47(C-8a),112.13(C-1a),111.81(C-4),109.26(C-1),104.92(OCH2O),56.71(9-OCH3),56.35(10-OCH3),55.76(C-6),26.41(C-5)。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、黄柏提取物的制备：取干燥黄柏药材，粉碎，乙醇加热回流提取，得黄柏醇提物；
S2、将S1中得到的黄柏醇提物用石油醚萃取，除去脂溶性杂质；
S3、黄柏生物碱粗提物的制备：将S2中萃取后剩余水相用氨水调节pH至碱性，用氯仿萃取，蒸干氯仿相得黄柏生物碱粗提物；
S4、黄柏中生物碱单体成分的分离：针对S3中黄柏生物碱粗提物，进行pH区带逆流色谱和常规+循环逆流色谱分离，每隔5min收集一次馏分，最终成功分离得到6种生物碱类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S1中的操作步骤，所述乙醇加热回流提取具体为：乙醇加热回流提取多次，合并滤液，减压旋蒸至无醇味，得黄柏醇提物。
3.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S1中的操作步骤，所述乙醇为体积比为50～～90％的乙醇，进一步优选为90％乙醇。
4.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S1中的操作步骤，所述乙醇加热回流提取中，固液比为1：10，提取3次，时间分别为2h，2h，1h，采用此条件的加热回流提取操作。
5.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S2中的操作步骤，所述采用黄柏醇提物用石油醚萃取处理具体为：石油醚萃取3次，弃去石油醚部分，水相为除去脂溶性杂质后的黄柏醇提物。
6.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S3中的操作步骤，所述黄柏生物碱粗提物的制备具体为：石油醚萃取后剩余水相用氨水调节pH至9～10，用氯仿萃取3次，合并氯仿相，减压蒸干得黄柏生物碱粗提物。
7.根据权利要求1所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S4中的操作步骤，所述黄柏中生物碱单体成分的分离具体为：采用pH区带逆流色谱得到2个生物碱成分和组分I，采用常规+循环逆流色谱分离得到4个生物碱成分。
8.根据权利要求7所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S4中的操作步骤，所述黄柏生物碱粗提物的pH区带逆流色谱，溶剂系统为氯仿-甲醇-水，体积比为4:3:3，上相为固定相(含有10mM HCl)，下相为流动相(含有10mM TEA)。
9.根据权利要求8所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S4中的操作步骤，所述高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量2.0g，分离柱转速为800rpm，流速2.0mL/min，固定相保留率66.7％，紫外检测器检测波长254nm，进行pH区带逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到2种生物碱类化合物和组分I，经NMR确证，结构分别为小檗碱和巴马汀。
10.根据权利要求9所述的一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据S4中的操作步骤，所述组分I的常规高速逆流色谱，溶剂系统为石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水，体积比为5:5:2:8，上相为固定相，下相为流动相，高速逆流色谱仪柱体积为300mL，上样量0.25g，分离柱转速为800rp m，流速2.0mL/min，固定相保留率78.5％，紫外检测器检测波长254nm，进行常规+循环逆流色谱分离，每隔5min收集一次流份，最终成功分离得到4种高异黄酮类化合物，经NMR确证，结构分别为6-甲基哌啶-2-酮、异阔果芸香碱、氧化小檗碱、表小檗碱。
CN202310749927.4A 2023-06-25 2023-06-25 一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法 Pending CN116789662A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310749927.4A CN116789662A (zh) 2023-06-25 2023-06-25 一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310749927.4A CN116789662A (zh) 2023-06-25 2023-06-25 一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116789662A true CN116789662A (zh) 2023-09-22

Family

ID=88047702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310749927.4A Pending CN116789662A (zh) 2023-06-25 2023-06-25 一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116789662A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yubin et al. The extraction, separation and purification of alkaloids in the natural medicine
CN102285982B (zh) 从中药黄连中分离纯化单体化合物的方法
CN103450145A (zh) 一种利用高速逆流色谱从苏木中分离制备巴西木素和原苏木素b的方法
CN105367531A (zh) 一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法
CN111560024B (zh) 一种高速逆流色谱结合制备液相色谱从钩吻生物碱中分离钩吻生物碱单体的方法
CN106957310B (zh) 一种山楂叶中黄酮类单体的高效制备方法
CN106496292A (zh) 一种从栀子中同时制备6个环烯醚萜苷类成分的方法
CN109265494B (zh) 从滇山茶中提取山奈酚葡萄糖苷类化合物的方法
CN101732379A (zh) D101大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺
CN102532147B (zh) 高纯度白鲜碱单体的制备方法
CN103340916A (zh) 一种野马追提取物、制备方法及其应用
CN106831892B (zh) 一种山楂叶中黄酮单体的制备方法
CN116789662A (zh) 一种高速逆流色谱分离纯化黄柏中生物碱类化合物的方法
CN109912582A (zh) 从芒果叶中提取芒果苷的方法
CN101210039B (zh) 一种羟基积雪草甙化学对照品的分离制备方法
CN111718318B (zh) 一种基于逆流色谱分离皂角刺中黄酮单体的方法
CN109320572B (zh) 从滇山茶中提取黄酮类化合物的方法
CN109369382B (zh) 一种银杏酸类成分的制备方法
CN105732611A (zh) 应用高速逆流色谱分离功劳木中生物碱类化合物的方法
CN103819533B (zh) 丹参酸甲酯磺酸钠的制备方法和应用
CN111718356B (zh) 一种分离制备墨旱莲单体的方法
CN103316087B (zh) 肉豆蔻五味有效部位及其制备方法、质量检测方法和应用
CN111909165B (zh) 一种同时制备地胆草内酯、异地胆草内酯的方法
CN114456138B (zh) 一种从佛手提取物中分离三种香豆素类化合物的方法
CN111592514B (zh) 一种从鹅不食草中分离制备山金车内酯c的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination