CN116769185A - 一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法及其产品和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，制备步骤为：由海藻酸或海藻酸盐与环氧氯丙烷、N,N‑二甲基x烷基叔胺进行一锅法反应制备海藻酸季铵盐，所述x＝10～14；所述的环氧氯丙烷与N,N‑二甲基x烷基叔胺的摩尔比为10：11～10：13；所述的海藻酸或海藻酸盐与环氧氯丙烷的投料摩尔比为1：0.5～1：1.5；将提纯后的海藻酸季铵盐与温敏性聚合物溶液共混，得到海藻酸抗菌凝胶，所述的海藻酸季铵盐在溶液中浓度为5‑20mg/mL。制备的抗菌凝胶在具有较好的抑菌性能的同时保持良好细胞相容性，在不同温度下可发生性状的改变，可根据医用实际需要进行按需移除，将可以更广阔地在民用消毒和医用抗菌材料领域运用。
Description
技术领域
本发明属于抗菌材料领域，涉及一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法及其产品和应用。
背景技术
医用抗菌材料在伤口护理和修复领域具有广阔的应用前景。和民用消毒材料不同，医用抗菌材料不仅需要有效杀灭病原微生物，还需要具有高细胞相容性，以避免对血细胞、组织中细胞造成严重损害。海藻酸和海藻酸盐作为一种植物源性的多糖，由于其具有的绿色安全、保水性强、便宜易得等特性，使得其成为人们研究的热点材料。公开号为CN201910591877.5的中国发明专利公开文本中公开了一种海藻酸钠季铵盐止血抗菌剂，通过海藻酸钠接枝烷基链季铵盐得方法得到，同时具有止血和抗菌效果，但对产物是否具有高细胞相容性没有探究，能否满足医用抗菌凝胶的安全性要求是不确定的。除此之外，常规抗菌凝胶在伤口处虽具有良好的贴覆性，但也常难以简便除去。在伤口修复/护理的长周期里，这种难去除特点会导致伤口换药(抗菌凝胶)过程中易于产生疼痛疼痛和伤口二次损伤。因此，需要提供一种合成方式简单、兼具抗菌性能和高细胞相容性、且易于从伤口处按需移除的海藻酸抗菌凝胶材料。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法及其产品和应用。本发明具体提供了如下的技术方案：
1.一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，制备步骤为：
1)由海藻酸或海藻酸盐与环氧氯丙烷、N,N-二甲基x烷基叔胺进行一锅法反应制备海藻酸季铵盐，所述x＝10～14；所述的环氧氯丙烷与N,N-二甲基x烷基叔胺的摩尔比为10：11～10：13；所述的海藻酸或海藻酸盐与环氧氯丙烷的投料摩尔比为1：0.5～1：1.5；
2)将提纯后的海藻酸季铵盐与温敏性聚合物溶液共混，得到海藻酸抗菌凝胶，所述的海藻酸季铵盐在溶液中浓度为5-20mg/mL。
进一步，步骤1)所述的海藻酸或海藻酸盐需配成水溶液，质量分数为2～10％，加入环氧氯丙烷、N,N-二甲基x烷基叔胺后，在30～70℃下反应10-60小时。
进一步，步骤2)所述的提纯步骤为一锅法反应结束后，用浓度为50％～80％的电解质溶液搅拌反应得到的析出物，解开分子链缠结，得到发泡后的产物，用无水乙醇沉淀、洗涤；析出物为因静电作用团聚在一起的海藻酸钠季铵盐产物；电解质溶液为氯化钠或氯化钾溶液。
进一步，步骤2)所述的温敏性聚合物溶液浓度为150～300mg/mL。
进一步，步骤2)所述的温敏性聚合物为泊洛沙姆、泊洛沙姆与羟丙基甲基纤维素的混合物、泊洛沙姆与羟丙基纤维素的混合物、或泊洛沙姆与羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素的混合物。
进一步，所述的温敏聚合物溶液的溶剂为水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或葡萄糖溶液。
2.上述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法制备得到的凝胶。
3.上述凝胶在制备伤口敷料上的应用，所述凝胶在室温下是是作为伤口敷料是凝胶状态，在2-5℃的无菌生理盐水或无菌去离子水作用下，可变为流动溶液，从伤口移除。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法及其应用，第一步，在环氧氯丙烷与N,N-二甲基x烷基叔胺(x＝10～14)摩尔比10：11～13的条件下与海藻酸或海藻酸盐在水溶液中进行一锅法反应，将一定比例的长烷基季铵盐接枝到海藻酸或海藻酸盐的骨架上，制备出海藻酸季铵盐；第二步，通过将海藻酸季铵盐与温敏性聚合物溶液共混形成海藻酸抗菌凝胶，并控制海藻酸季铵盐在溶液中浓度为5-20mg/mL。第二步是发明关键，通过温敏凝胶形成的物理交联网络对海藻酸季铵盐进行包覆，不仅保持了海藻酸季铵盐对凝胶表面接触细菌后的抗菌性能，还有效降低了高浓度海藻酸季铵盐对于血细胞的杀伤(溶血率达到医用标准)；此外，温敏性聚合物还赋予海藻酸抗菌凝胶对于低温/高温的响应性，即其形态低温下为流动水溶液，37℃体温下为不流动凝胶，可实现所制备的海藻酸抗菌凝胶在伤口处按需移除。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为实施例1对应凝胶X1的流变测试曲线。
图2为对比例6对应凝胶Y6的流变测试曲线。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
1)取4g海藻酸钠(粘度为1000mPa·s)，加入到80mL的去离子水中，然后再加入1mL环氧氯丙烷、3.2mL N,N-二甲基癸胺，在N2的氛围中，在40℃的条件下反应24h。
2)反应结束用50％的氯化钠溶液搅拌反应得到的析出物，体系中因为搅拌而产生大量的泡沫(从过程称为发泡)后，用无水乙醇沉淀洗涤三次，每次2h，经真空干燥，得到海藻酸钠季铵盐X1。
3)将泊洛沙姆(F127)用生理盐水配置成浓度为200mg/mL的溶液，加入海藻酸钠季铵盐X1，使得其在溶液中的浓度为5mg/mL，得到具有温敏抗菌凝胶G1。
本例中，摩尔比SA(海藻酸钠):EP(环氧氯丙烷):NH2(N,N-二甲基癸胺上的叔胺)＝1：0.619：0.681，N,N-二甲基癸胺分子上的碳的个数为10个。
实施例2
1)取4g海藻酸钠(粘度为1000mPa·s)，加入到80mL的去离子水中，然后再加入1mL环氧氯丙烷、3.2g N,N-二甲基十二烷基胺，在N2的氛围中，在40℃的条件下反应24h。
2)反应结束用50％的氯化钠溶液搅拌反应得到的析出物，体系中因搅拌而产生大量的泡沫后，用无水乙醇沉淀洗涤三次，每次2h，之后经真空干燥，得到海藻酸钠季铵盐X2。
3)将泊洛沙姆(F127)用生理盐水配置成浓度为200mg/mL的溶液，加入海藻酸钠季铵盐X2，使得其在溶液中的浓度为15mg/mL，得到具有温敏抗菌凝胶G2。
本例中，摩尔比SA(海藻酸钠):EP(环氧氯丙烷):NH2(N,N-二甲基十二烷基胺上的叔胺)＝1：0.619：0.681，N,N-二甲基十二烷基胺分子的碳的个数为12个。
对比例1
将实施例1中的海藻酸钠季铵盐X1溶于生理盐水，使得其在溶液中的浓度为5mg/mL，得到溶液Y1。
对比例2
将实施例1中的海藻酸钠季铵盐X2溶于生理盐水，使得其在溶液中的浓度为15mg/mL，得到溶液Y2。
对比例3
1)取4g可溶性淀粉，加入到80mL的去离子水中，在90℃下糊化溶解，然后再加入1mL环氧氯丙烷、3.2mL N,N-二甲基癸胺，在N2的氛围中，在40℃的条件下反应24h。
2)反应结束，将反应体系透析处理，使用1次0.1M HCl，4次去离子水透析，得到季铵化淀粉。
3)将泊洛沙姆(F127)用生理盐水配置成浓度为200mg/mL的溶液，加入第二步制备的季铵化淀粉，使得其在溶液中的浓度为5mg/mL，得到具有温敏凝胶Y3。
对比例4
将泊洛沙姆(F127)用生理盐水配置成浓度为200mg/mL的溶液，加入实施例1中的海藻酸钠季铵盐X1，使得其在溶液中的浓度为2mg/mL，得到凝胶Y4。
该方案中，海藻酸钠季铵盐X1的浓度小于5-20mg/mL范围。
对比例5
将泊洛沙姆(F127)用生理盐水配置成浓度为200mg/mL的溶液，加入海藻酸钠(粘度为1000mPa·s)，使得其在溶液中的浓度为5mg/mL，得到凝胶Y5。
对比例6
将泊洛沙姆(F127)用生理盐水配置成浓度为200mg/mL的溶液，得到凝胶Y6。
该方案，不加海藻酸季铵盐。
测试例1血液相容性测试
检测方法：实验例1、2与对比例1、2进行血液相容性测试。检测方法：溶血率测试，检测用血液是新鲜SD大鼠柠檬酸钠抗凝血液，将全血离心(3000rpm，10min)，取血细胞，用生理盐水洗涤两次血细胞，然后将血细胞用生理盐水配置为4％的溶液。将受试材料(凝胶或溶液，取200μL)和4％血细胞溶液等体积。并设置阴阳对照组，阴性对照组为与血细胞溶液等体积的生理盐水溶液(200μL)，阳性对照组为与血细胞溶液等体积的4％曲拉通溶液(200μL)。37℃孵育3h，离心(3000rpm,3min)，取上清液100μL加入96孔板，用酶标仪读取各孔在545nm处的吸光度Abs。最后通过以下公式来计算溶血率。
溶血率＝(Abs材料-Abs阴性)/(Abs阳性-Abs阴性)×100％...................式
式中：Abs材料是材料组在545nm处的吸光度；Abs阳性是阳性组在545nm处的吸光度；Abs阴性是阴性组在545nm处的吸光度。实施例及对比例的溶血率如下表：
表1溶血率测试
| 样品 | X1 | X2 | Y1 | Y2 |
| 溶血率(％) | 0.8 | 0.9 | 65 | 80 |
溶血率用来表征血液接触材料的红细胞相容性，溶血即血液与材料接触后红细胞大量破碎，有血红蛋白的大量释放。一般来说，当溶血率小于5％时，表示材料的血液相容性较好(国家规定任何血液接触材料的溶血率不宜超过5％)；当溶血率大于5％时，表示材料的血细胞相容性不理想，使较多的红细胞破裂，会损伤血液的组成与功能，不宜用作血液接触材料。
从表1中可以看出，实施例X1、X2的溶血率都低于5％，但对比例Y1、Y2的溶血率远超过5％，甚至超过了50％。
上述结果表明：对于本发明第一步制备的海藻酸季铵盐(即对比例1和2的产物)，其高浓度水溶液虽具有高抗菌性能，但具有极差的血液相容性，考虑到这种高含量长烷基季铵盐易于产生细胞膜损伤的常识，该溶血率超过50％的溶液也将产生高哺乳动物细胞毒性，因此不能满足伤口抗菌的医用需求。
因此，本发明通过温敏聚合物溶液共混后得到抗菌凝胶(即实施例1和2)，具有优异、合格的低溶血率，原因在于37℃体温凝固状态下，温敏聚合物形成的物理交联网络限制了海藻酸季铵盐的释放、以及与血细胞的接触，显著降低了血细胞损伤。结合该温敏凝胶的高抗菌性能，可以看到本发明利用温敏聚合物与海藻酸季铵盐的结合，实现了医用抗菌凝胶关键性能要求的满足——兼顾抗菌性和细胞相容性。
测试例2抗菌效果对比
检测方法：实施例1、2与对比例1、2、3、4、5、6进行大肠杆菌的抑菌性能测试。检测用菌为大肠杆菌ATCC 25922。检测方法：将受试材料(凝胶或溶液，取1mL)放置于6孔细胞培养板，对照组为1mL的无菌PBS，37℃恒温孵育1h。将培养好的大肠杆菌菌液用PBS稀释为1×107CFU/mL的细菌悬液，取50μL上述悬菌液，在6孔板中与受试材料和对照样液接触(凝胶样为菌液滴加于凝胶样品表面；溶液样为菌液和溶液混合均匀)。放入37℃恒温培养箱中培养12h，然后通过固体培养基计算菌落数的方法，对材料组和对照组的细菌数量进行计算。实验重复三次并按下式计算抑菌率：
X＝(A-B)/A×100％，式中：X—抑菌率，A—对照组平均细菌数量，B—材料组平均细菌数量，得到各材料平均抑菌率结果如下表：
表1抑菌率测试
表2抑菌率测试
| 样品 | X1 | X2 | Y1 | Y2 | Y3 | Y4 | Y5 | Y6 |
| 抑菌率(％) | 99.4 | 100 | 100 | 100 | 30.4 | 30.1 | 2.1 | 3.1 |
从表2中可以看出，X1、X2和Y1、Y2的抑菌率远高于Y3、Y4、Y5、Y6。
X1、X2和Y1、Y2抑菌结果好的原因是：在海藻酸钠上接枝上了具有较好抗菌活性的长烷基链季铵盐，使得制备的海藻酸季铵盐的高浓度溶液(5和15mg/mL，即Y1、Y2)具有较好的抗菌性能，并在与温敏聚合物形成的温敏凝胶体系中保持了这一良好抗菌性能(即X1、X2)。
然而，对比例得到的Y1、Y2的抗菌效果较好，但溶血测试结果显示其细胞相容性很差(见测试例2，表2)，并不能满足医用抗菌凝胶的要求。
对比例Y3的抗菌效果较差，是因为将反应原料换为了可溶性淀粉，由于淀粉本身对细菌生长的促进作用，在相同的投料比例，其抑菌性显著低于海藻酸，因此其对应凝胶的抗菌效果很差，说明了本发明选择海藻酸接枝长烷基季铵盐的必要性。
对比例Y4的抗菌效果也较差，原因在于选择了较低浓度的海藻酸季铵盐(只有2mg/mL)，说明了抗菌凝胶中海藻酸季铵盐选用5-20mg/mL的高浓度是必要的；
对比例Y5的抗菌效果极差，说明了F127凝胶基本不具备抗菌性能。
对比例Y6的抗菌效果极差，说明了负载不改性的海藻酸的F127凝胶不具备抗菌性能。
测试例3温敏转变性能测试
检测方法：通过用流变仪(View discorvery HR-3，TA instruments)测定凝胶的相转变温度；设置仪器的温度温度测量范围为15～35℃下，角频率设置为10rad/s，升温速率设置为1℃/5s，测试高度设置为1000μm；测定实施例1和对比例6两种样品，随温度变化的存储模量(G')和损耗模量(G”)，定义凝胶温度(Tgel)为G'大于G”的温度。
图1为实施例1对应凝胶X1的流变测试曲线，从图1中可以看出根据流变学分析表明，随着温度的升高，凝胶X1的存储模量(G')和损耗模量(G”)明显增加，凝胶X1的凝胶温度为25.4℃。
图2为对比例6对应凝胶Y6的流变测试曲线，从图2中可以看出根据流变学分析表明，随着温度的升高，凝胶Y6的存储模量(G')和损耗模量(G”)明显增加，凝胶Y6的凝胶温度为21.8℃。
通过对比两种凝胶的凝胶温度可以看出，负载了海藻酸钠季铵盐制备的抗菌凝胶X1的凝胶温度高于纯的F127凝胶，证明海藻酸钠季铵盐的加入对F127凝胶网格有影响，阻碍了F127链段的运动和物理交联，使凝胶温度(Tgel)有明显升高；但同时X1仍保持了体温固化的温敏性，有利于本发明抗菌凝在体温下保持良好抗菌性和低溶血性，这种和室温接近的凝胶转变温度，也有利于通过降温处理(如2-5℃的无菌生理盐水或无菌去离子水)将温敏凝胶转变为流动状态、在伤口处移除。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，制备步骤为：
1)由海藻酸或海藻酸盐与环氧氯丙烷、N,N-二甲基x烷基叔胺进行一锅法反应制备海藻酸季铵盐，所述x＝10～14；所述的环氧氯丙烷与N,N-二甲基x烷基叔胺的摩尔比为10：11～10：13；所述的海藻酸或海藻酸盐与环氧氯丙烷的投料摩尔比为1：0.5～1：1.5；
2)将提纯后的海藻酸季铵盐与温敏性聚合物溶液共混，得到海藻酸抗菌凝胶，所述的海藻酸季铵盐在溶液中浓度为5-20mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的海藻酸或海藻酸盐需配成水溶液，质量分数为2～10％，加入环氧氯丙烷、N,N-二甲基x烷基叔胺后，在30～70℃下反应10-60小时。
3.根据权利要求1所述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的提纯步骤为一锅法反应结束后，用浓度为50％～80％的电解质溶液搅拌反应得到的析出物，解开分子链缠结，得到发泡后的产物，用无水乙醇沉淀、洗涤；析出物为因静电作用团聚在一起的海藻酸钠季铵盐产物；电解质溶液为氯化钠或氯化钾溶液。
4.根据权利要求1所述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的温敏性聚合物溶液浓度为150～300mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的温敏性聚合物为泊洛沙姆、泊洛沙姆与羟丙基甲基纤维素的混合物、泊洛沙姆与羟丙基纤维素的混合物、或泊洛沙姆与羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素的混合物。
6.根据权利要求1所述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的温敏聚合物溶液的溶剂为水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或葡萄糖溶液。
7.根据权利要求1-6所述的一种海藻酸抗菌凝胶的制备方法制备得到的凝胶。
8.根据权利要求7所述的凝胶在制备伤口敷料上的应用，其特征在于，所述凝胶在室温下作为伤口敷料是凝胶状态，在2-5℃的无菌生理盐水或无菌去离子水作用下，可变为流动溶液，从伤口移除。
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|---|---|---|---|---|
| CN117659222A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-03-08 | 青岛即昇科技有限公司 | 一种海藻酸接枝叔丁胺的抗菌后处理液及其制备方法 |
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