CN116769034A - 抗cd73抗体或其抗原片段及其应用 - Google Patents

抗cd73抗体或其抗原片段及其应用 Download PDF

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Abstract

本文提供了特异性结合CD73的抗CD73抗体或其抗原结合片段。本文还提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段在肿瘤治疗方面的应用。

Description

抗CD73抗体或其抗原片段及其应用
本申请为2022年8月12日提交的、申请号为202210965534.2的中国专利申请的分案申请，在此通过引用将其全文并入本文。
技术领域
本申请涉及能够与CD73蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段以及此类制剂的用途。该抗体或其抗原结合片段可用于治疗与CD73活性有关的疾病。
背景技术
腺苷途径能下调炎症并抑制免疫反应以维持免疫稳态。在肿瘤微环境(TME)中，当免疫原性肿瘤细胞死亡时，ATP将被释放到肿瘤TME中，随后ATP通过CD39和CD73蛋白分解成腺苷。丰富的细胞外腺苷具有免疫抑制作用，它通过A2a受体和A2b受体抑制T细胞和NK细胞的扩张和细胞毒性，阻碍树突状细胞的抗原递呈，同时有利于调节性T细胞(调节性T细胞)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)的发育(参考文献1)。
细胞外ATP的分解是通过CD39/CD73串联反应介导的，CD39催化ATP转化为AMP，CD73催化AMP转化为腺苷。在实体瘤中检测到的腺苷浓度比周围组织高，表明其在TME和肿瘤进展中抑制免疫反应的作用。细胞表面CD73蛋白和可溶性CD73直接将AMP分解为腺苷，CD73因此成为肿瘤治疗的热点靶点。CD73在缺氧(HIFa)、炎症(TGFβ)和化疗导致的细胞死亡时被诱导表达。它直接响应HIFα信号转导，这可以解释为什么肿瘤细胞在缺氧状态下CD73表达升高(参考文献2)。TGFb信号稳定H1Fα蛋白并间接增强CD73表达。CD73也在Treg、CD4+记忆性T细胞上表达，尤其是被用来标记Th17的表面蛋白。
在过去的10年中，TME中CD73腺苷途径的免疫抑制受到高度关注。CD73抗体的治疗潜力已在临床前研究(参考文献3)中得到证实，并正在进行临床试验。Olecumab(MEDI9447)是抗CD73单克隆抗体，是临床试验2中的第一个抗CD73抗体药物。在CT26同系动物模型中，Olecumab在体外和体内缓解腺苷介导的免疫抑制。10mg/kg Olecumab可抑制50％的肿瘤生长，并在TIL(肿瘤浸润淋巴细胞)中显示出CD8+细胞毒性T淋巴细胞的大量增加。结合PD-1抗体治疗，Olecumab与PD-1抗体联合给药在小鼠肿瘤排斥反应具有相加效应，能增加T细胞分泌IFNγ以及TNFα。因此在癌症治疗中，将抗CD73抗体与其他免疫检查点阻断剂相结合是可能的。临床一期试验中的其他CD73抗体药物包括百时美施贵宝的BMS-986179、Corvus药物公司(Corvus Pharmaceuticals Inc.)的CPI-006(参考文献4)、Gilead Sciences的双特异型抗体GS-1423和Akeso的AK119，其中大多数药物在临床试验中结合了其他免疫检查点阻断剂，例如PD-1、PD-L1或CTLA-4(参考文献1)。
发明内容
在一方面，本文提供了分离的抗体或其抗原结合片段，包括：
I)重链可变结构域(VH)，包括：
1)重链CDR1(HCDR1)，其包括选自SEQ ID NO:2、10、18、26、34、42、50、58、66、74和82之一的氨基酸序列；
2)重链CDR2(HCDR2)，其包括选自SEQ ID NO:3、11、19、27、35、43、51、59、67、75和83之一的氨基酸序列；以及
3)重链CDR3(HCDR3)，其包括选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84和105之一的氨基酸序列；以及
II)轻链可变结构域(VL)，包括：
1)轻链CDR1(LCDR1)，其包括选自SEQ ID NO:6、14、22、30、38、46、54、62、70、78和86之一的氨基酸序列；
2)轻链CDR2(LCDR2)，其包括选自SEQ ID NO:7、15、23、31、39、47、55、63、71、79和87之一的氨基酸序列；以及
3)轻链CDR3(LCDR3)，其包括选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80和88之一的氨基酸序列，
其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合CD73，优选人CD73。
在一些实施方案中，1)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:18、19和20所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:22、23和24所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；2)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:34、35和36所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:38、39和40所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；3)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:2、3和4所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQID NO:6、7和8所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；4)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:10、11和12所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:14、15和16所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；5)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:26、27和28所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:30、31和32所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；6)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:42、43和44所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3或分别具有SEQ ID NO:42、43和105所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:46、47和48所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；7)所述VH包括分别具有SEQ IDNO:50、51和52所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:54、55和56所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；8)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:58、59和60所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:62、63和64所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；9)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:66、67和68所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:70、71和72所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；10)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:74、75和76所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:78、79和80所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或11)所述VH包括分别具有SEQ ID NO:82、83和84所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3、所述VL包括分别具有SEQ ID NO:86、87和88所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，所述VH包括与选自SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73和81之一的序列有至少80％一致性的氨基酸序列，所述VL包括与选自SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77和85之一的序列有至少80％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述VH包括选自SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73和81之一的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:1、9、17、25、33、41、49、57、65、73和81之一的氨基酸序列包括至多3个氨基酸替换的变体，所述VL包括选自SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77和85之一的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:5、13、21、29、37、45、53、61、69、77和85之一的氨基酸序列包括至多3个氨基酸替换的变体。
在一些实施方案中，1)所述VH包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列，所述VL包括SEQID NO:21所示氨基酸序列；2)所述VH包括SEQ ID NO:33所示氨基酸序列，所述VL包括SEQID NO:37所示氨基酸序列；3)所述VH包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ IDNO:5所示氨基酸序列；4)所述VH包括SEQ ID NO:9所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:13所示氨基酸序列；5)所述VH包括SEQ ID NO:25所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:29所示氨基酸序列；6)所述VH包括SEQ ID NO:41所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:45所示氨基酸序列；7)所述VH包括SEQ ID NO:49所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:53所示氨基酸序列；8)所述VH包括SEQ ID NO:57所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:61所示氨基酸序列；9)所述VH包括SEQ ID NO:65所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:69所示氨基酸序列；10)所述VH包括SEQ ID NO:73所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ ID NO:77所示氨基酸序列；或11)所述VH包括SEQ ID NO:81所示氨基酸序列，所述VL包括SEQ IDNO:85所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性具有10-1μg/mL至10-3μg/mL的IC50值。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与表达所述CD73的细胞结合的EC50值为1μg/mL至10-2μg/mL。
在一些实施方案中，所述抗体为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2或Fv。
在一些实施方案中，所述人源化抗体的VH包括选自SEQ ID NO:91、93、89、95、97、99或101的氨基酸序列，所述人源化抗体的VL包括选自SEQ ID NO:92、94、90、96、98、100或102的氨基酸序列。
在一些实施方案中，1)所述VH包括SEQ ID NO:91所示氨基酸序列和所述VL包括SEQ ID NO:92所示氨基酸序列；2)所述VH包括SEQ ID NO:93所示氨基酸序列和所述VL包括SEQ ID NO:94所示氨基酸序列；3)所述VH包括SEQ ID NO:89所示氨基酸序列和所述VL包括SEQ ID NO:90所示氨基酸序列；4)所述VH包括SEQ ID NO:95所示氨基酸序列和所述VLSEQID NO:96所示氨基酸序列；5)所述VH包括SEQ ID NO:97所示氨基酸序列和所述VL包括SEQID NO:98所示氨基酸序列；6)所述VH包括SEQ ID NO:99所示氨基酸序列和所述VL包括SEQID NO:100所示氨基酸序列；或7)所述VH包括SEQ ID NO:101所示氨基酸序列和所述VL包括SEQ ID NO:102所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述人源化抗体针对表达所述细胞表面表达的所述CD73的酶活性具有10-1μg/mL至10-2μg/mL的IC50值。
在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与所述CD73之间结合的KD值为10-8M至10-11M。
在一些实施方案中，所述VH和/或VL连接至免疫球蛋白的恒定区；优选地，所述VH连接至IgG1恒定区。
另一方面，本文提供了双特异性抗体，其上述抗体或其抗原结合片段和第二抗体部分。
在一些实施方案中，所述第二抗体部分能够结合不同于CD73的抗原。
在一些实施方案中，所述不同于CD73的抗原为CD39、CTLA-4、PD-L1、TIM-3、LAG-3或A2aR。
在一些实施方案中，所述第二抗体部分为Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdAb。
另一方面，本文提供了编码权利要求上述抗体或其抗原结合片段或双特异性抗体的多核苷酸。
另一方面，本文提供了上述多核苷酸的载体。
另一方面，本文提供了包含上述多核苷酸或载体的细胞。
另一方面，本文提供了用于癌症治疗的药物组合物，包括：上述抗体或其抗原结合片段，或上述双特异性抗体；以及药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括一种或更多种其他抗癌剂。
在一些实施方案中，所述癌症为实体癌。
在一些实施方案中，所述癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或胰腺癌。
另一方面，本文提供了包含上述抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体、多核苷酸、载体或细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述癌症为实体癌。
在一些实施方案中，所述癌症选自非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌或胰腺癌。
再一方面，本文提供一种治疗疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的上文所述的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或上述药物组合物。
在一些实施方案中，所述受试者为人。
在一些实施方案中，所述疾病为癌症。在一些优选实施方案中，所述疾病为实体癌。在更有选的实施方案中，所述实体癌选自非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或胰腺癌。
在本发明中，我们鉴定了11种抗体，8种抗体对CD73胞外-5'-核苷酸酶的拮抗能力优于MEDI9447，并且在多表位靶向方面具有高度多样性。根据CD73在多种肿瘤组织中的高表达水平(参考文献5，参考文献6)，这些抗体先导物在肿瘤治疗中具有很高的潜力，具有广泛的适应症，包括非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)和胰腺癌等。同时，抗CD73抗体在联合治疗中具有高度的灵活性，包括PD-1、PD-L1、化疗、A2AR拮抗剂等。
本发明根据CD73在免疫调节中的功能和肿瘤细胞中CD73的高表达以及高腺苷浓度，通过抗CD73抗体阻断CD73酶活性可减轻腺苷途径对肿瘤微环境的免疫抑制，有利于T细胞和NK细胞对肿瘤的特异性杀伤作用。
在本发明中，我们鉴定出的抗体对CD73胞外-5'-核苷酸酶的拮抗能力优于MEDI9447，并且在多表位靶向方面具有高度多样性。这些抗体先导物可以为抗体治疗、双特异性抗体设计以及与化疗和放疗的联合治疗提供良好的候选物。
附图说明
图1：52A6B3和100C5A3对AMP水解的抑制作用。
图2：52A8B3、96A5A5和134D2H6对AMP水解的抑制作用。
图3：141G7E9、143H3C5和143E5D2对AMP水解的抑制作用。
图4：9E12E3、22E1B4和35D8G8对AMP水解的抑制作用。
图5：抗CD73小鼠单克隆抗体结合人CD73-CHO-K1细胞系的FACS数据。
图6：7种人源化抗体对CD73介导的AMP水解的抑制作用，(A)为5种人源化抗体对CD73介导的AMP水解的抑制作用；(B)为另2种人源化抗体对CD73介导的AMP水解的抑制作用。
具体实施方式
本公开提供了抗CD73单克隆抗体及其应用。本公开涉及小鼠抗CD73单克隆抗体(9E12E3、22E1E4、35D8G8、52A8B3、52A6B3、96A5A5、100C5A3、134D2H6、141G7E9、143E5D2和143H3C5克隆)的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。它还涉及到在这些小鼠抗CD73单克隆抗体克隆上进行人源化或翻译后修饰后的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。本公开还涉及到抗CD73单克隆抗体的产生方法。
本公开通过将所披露的小鼠抗CD73单克隆抗体的重链和轻链的可变区与人IgG的恒定区融合，提供抗人CD73嵌合抗体。本发明提供了小鼠抗CD73单克隆抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的人源化形式。在一些例子中，小鼠抗CD73单克隆抗体的CDR被嫁接到人IgG框架序列上，所获得的人源化可变结构域还可以进一步与人IgG的恒定区域融合。
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
术语“或”是指列举的可选择要素中的单个要素，除非上下文明确地另外指出。术语“和/或”是指所列举的可选择要素中的任意一个、任意两个、任意三个、任意更多个或其全部。
本文所用术语“约”表示给定数值的±10％范围内的值。
本文所用术语“包含”、“含有”、“具有”以及类似的表述表示不排除未列举的要素。这些术语也包括仅由所列举的要素组成的情形。
“抗体”指由浆细胞(效应B细胞)分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质(多肽、病毒、细菌等)的免疫球蛋白。该外来物质相应地称作抗原。经典抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区(V)和位于羧基端的恒定区(C)。一条重链和一条轻链的可变区相互作用形成了抗原结合部位(Fv)。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域(骨架区，FR)更易变化，称为高变区(HVR)，高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区(complementarity-determining region、CDR)。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR2、LCDR3。CDR的氨基酸序列可以使用本领域公认的编号方案来确定，例如Kabat、Chothia、IMGT、AbM或Contact编号方案。在一个具体实施方案中，已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR序列。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为五种主要的不同类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些抗体类型根据铰链区的大小，链间二硫键的位置和分子量的不同可进一步分为亚类，例如，IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3等。根据抗体轻链恒定区氨基酸组成和排列的不同，可将轻链分为κ和λ两种类型。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构象在本领域内是已知的。
抗体分子的“抗原结合片段”指抗体分子中参与抗原特异性结合的氨基酸片段，例如，Fab、Fab’、(Fab’)2、scFv和sdAb等。本领域技术人员已知如何获得这些抗原结合片段。例如，经典抗体分子可经木瓜蛋白酶消化而得到Fab片段，经胃蛋白酶消化得到F(ab’)2，通过以还原剂处理断开F(ab’)2铰链区之间的二硫键而形成Fab’片段。
单链抗体(single chain fragment variable、scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接成一条肽链而构成。通过正确折叠，来自重链和轻链的可变区通过非共价键相互作用形成Fv段，因而scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性。
“单域抗体(single domain antibody，sdAb)”，或者也称为“VHH抗体”，指具有抗原结合能力，包括重链可变区而无轻链的抗体分子。从结构上看，单域抗体也可以认为是抗体分子的一种抗原结合片段。其首先在骆驼科动物中被发现，随后，研究人员通过抗体库(例如噬菌体展示文库)筛选发现了更多的具有抗原结合能力的单域抗体。单域抗体相对于普通抗体分子(例如，经典四聚体抗体分子)或其抗原结合片段具有一些优势，例如包括但不限于：分子量更小，使用于人体时易于到达普通抗体分子难以到达的组织或部位，或者，能够接触到蛋白或多肽中普通抗体分子难以接触到的抗原表位；更加稳定，能够耐受例如温度和pH的变化以及变性剂和蛋白酶的作用。
“Fc片段”指Y”形抗体分子的柄部区域，即可结晶片段(fragmentcrystallizable，Fc)包括重链的第二和第三恒定结构域(CH2和CH3结构域)。可通过蛋白水解酶(如木瓜蛋白酶)水解抗体分子得到抗体Fc区。在一些实例中，Fc区可包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时可介导两个含Fc的多肽之间的二聚化。Fc片段可来自IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。在一些实例中，Fc区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。“Fc片段”还包括来自天然Fc片段，经改动但仍保持其效应功能的变体Fc片段。“变体Fc片段”包含在天然Fc片段的氨基酸序列上具有至少一个氨基酸变动的氨基酸序列。在一些实例中，变体Fc片段相比于亲本Fc片段(天然Fc片段)具有至少一个氨基酸取代，例如在亲本Fc片段中约1至约10个氨基酸被取代，且优选约1至约5个氨基酸取代。在一些实例中，变体Fc片段Fc区与亲本Fc片段具有至少约80％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性。“Fc片段”的效应功能可包括与Fc受体的结合、Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、介导吞噬作用等。在一些情形下，可视情况下对Fc片段进行改造，一以增强、减弱或消除其效应功能。
“鼠抗体”指可变区和恒定区(如果有的话)衍生自小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗体。鼠抗体可方便地以相应抗原免疫小鼠或大鼠并从其分离目的抗体而获得。或者，在以相应抗原免疫小鼠或大鼠后，分离并培养表达目的抗体的细胞(如B细胞)而获得。又或者，在以相应抗原免疫小鼠或大鼠后，分离并培养表达目的抗体的细胞，将其与永生化细胞如骨髓瘤细胞融合而获得杂交瘤细胞，培养杂交瘤细胞则可长期和大量获得目的抗体(如单克隆抗体)。在一些实施方案中，所述“鼠抗体”是小鼠抗体。
“人源化抗体”是指对非人抗体，即可变区和恒定区(如果有的话)非衍生自人免疫球蛋白的抗体进行人为改造以使其含有人抗体的氨基酸序列，由此获得的嵌合抗体。人源化抗体可以包含人抗体的恒定区和/或骨架区。人源化抗体可以通过基因工程手段获得，例如以人抗体的恒定区替换鼠抗体的恒定区和/或以人抗体的骨架区替换鼠抗体的骨架区。这种人源化改造通常不影响原抗体与对应抗原的结合特异性，因此这样的抗原也包括在本发明的范围内。
“人抗体”或“人源抗体”指可变区和恒定区(如果有的话)均衍生自人生殖系免疫球蛋白序列的抗体。人抗体可通过多种技术获得，包括噬菌体抗体库技术、单个B细胞克隆技术、转基因小鼠技术(例如，使用引入了人生殖系免疫球蛋白基因并去除了小鼠自身生殖系免疫球蛋白基因的转基因小鼠)等。相对于动物源抗体(例如鼠源抗体)，人抗体在用于人患者时具有免疫原性小、安全性高的优势。
本文使用的术语“单克隆抗体”指均一的、仅针对某一特定抗原表位的抗体。与典型地包括针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个抗原决定簇。修饰语“单克隆”表示抗体的均一特征，不解释为需要通过任何特定方法产生的抗体。本发明的单克隆抗体可通过本领域公知的杂交瘤方法或重组DNA方法产生，或通过本文其它地方描述的筛选方法获得。
“分离的”抗体是已经从其自然环境或生产环境(例如细胞培养物)中被分离和/或回收的抗体。生产环境中的污染成分，如来自重组转染细胞的成分(例如酶、激素和其他蛋白或非蛋白组分、核酸)通常会干扰抗体的研究、诊断或治疗用途。因此，优选地，该分离的抗体基本上与其自然环境或生产环境中的其他成分没有关联。
“表位”指分子(如抗原)中与抗体结合的分子部分。表位可以包含该分子的非相邻的部分(例如，多肽中，在该多肽的主要序列上不相邻、但在该多肽的三价和四价结构中彼此足够靠近以被抗体结合的氨基酸残基)。
“双特异性抗体”指具有两个不同的结合位点、能分别识别和结合两种不同的抗原的抗体分子。在一个实施方案中，双特异性抗体的一个结合位点可用于结合免疫细胞(例如T细胞)，另一个结合位点用于结合肿瘤细胞，进而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少脱靶毒性等副作用。在另一实施方案中，双特异性抗体的两个结合位点分别结合与肿瘤微环境与免疫抑制有关的蛋白或抗原(如CD73和PD-L1)。这种具有双功能的抗体作为治疗肿瘤的药物通常比单抗药物有更高的疗效。类似地，可对抗体分子进行改造以使其包括多个不同的结合位点，生成“三特异性抗体”、“四特异性抗体”等。本文使用的“多特异性抗体”涵盖这些双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等。
“融合蛋白”指人为生成(例如通过基因工程技术)的由至少两个不同肽段构成的蛋白分子。这些肽段在自然界中不存在，或者不存在于同一个蛋白分子中。常见的包括抗体片段的融合蛋白的实例包括嵌合抗体、抗体-细胞因子融合蛋白、抗体-细胞毒素融合蛋白(也称为免疫毒素)、用于免疫检测的酶标抗体、嵌合抗原受体(CAR)等。
“靶向”或“特异性结合”指，相对于环境中同时存在的其他分子，一种分子(例如抗体或其抗原结合片段)对另一种分子(如肿瘤细胞表面抗原)具有更高的结合亲和力。“靶向”或“特异性结合”并不排除该分子可以对一种以上的分子具有结合亲和力，例如双特异性抗体可以对两种不同抗原具有高亲和力。
EC50(concentration for 50％of maximal effect)指引起50％最大效应的浓度。在FACS中用于表示抗体分子与细胞上对应抗原的结合能力时，可指产生最大荧光强度一半时的抗体分子浓度。EC50值越低，则与细胞上抗原的结合亲和力越大。
KD值也可以用于衡量抗体与其抗原之间的结合亲和力。KD值是抗体与其抗原之间的平衡解离常数，即koff/kon的比值。因此KD值越低(浓度越低)，抗体的亲和力越高。
对于一种抑制剂对活性分子的生物活性的抑制效果，可通过IC50值(半数最大抑制浓度)来衡量。IC50表示需要何种抑制剂浓度才能将该活性分子(例如CD73)的活性(如催化AMP转化为腺苷)抑制一半。IC50值越小，表明其对该活性分子的抑制能力越强。
“变体”指相对于参照序列(例如本文公开的CDR序列、VH或VL序列)在氨基酸序列上引入了差异而产生的产物序列(例如CDR序列、VH或VL序列)。本领域技术人员可以理解的是，在本文提供的具体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原CD73的结合能力或对其抑制能力，从而获得本文提供的靶向CD73的抗体或其抗原结合片段的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。例如，在本文公开的抗体或其抗原结合片段在全长或CDR序列上，可以有至少1个且不超过10，或不超过5、4、3、2或1个氨基酸的改变。
“纯化标签”指与目的蛋白或多肽以融合蛋白形式一起表达的用于纯化该目的蛋白或多肽的氨基酸序列，包括但不限于His6标签、Flag标签、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签和GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签、SUMO(小泛素相关修饰物(small ubiquitin relatedmodifier))等。这些标签可在纯化后通过酶切去除，或者在不影响目的蛋白或多肽正常功能情况下可带标签使用(例如His6标签)。
“可检测标签”指与蛋白或多肽连接的氨基酸序列或其他化学基团，用于指示样品中该蛋白或多肽的存在或含量，或者用于跟踪该蛋白或多肽在受试者体内或细胞内的位置信息。可检测标签的实例包括免疫检测中可使用的各种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)；荧光基团(如FAM、FITC)或荧光蛋白(如GFP)；放射性同位素(例如3H、14C、35S)。当可检测标签为酶时，可通过酶的酶学活性来确定与酶连接的蛋白或多肽的存在或含量。
本文中，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指核苷酸聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸且包括(但不限于)DNA、RNA和PNA。“核酸序列”指包含于核酸分子或多核苷酸中的核苷酸线性序列。
术语“载体”指可经工程改造以含有目的多核苷酸(例如目的多肽的编码序列)的核酸分子或可在宿主细胞中复制的核酸分子(例如，核酸、质粒或病毒等)。载体可包括以下组件中的一个或更多个：复制起点、一个或更多个调控目的多核苷酸的表达的调控序列(诸如启动子和/或增强子子)和/或一个或更多个可选择标记物基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析中的基因，例如β-半乳糖)。术语“表达载体”指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。
“宿主细胞”指可为或已为载体或经分离多核苷酸的接受体的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括(但不限于)NSO细胞、293以及CHO细胞，以及其衍生细胞，诸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S和CHO-DS细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始母细胞完全一致(在形态或基因组DNA互补方面)。宿主细胞也包括在活体内经本文提供的核酸分子或表达载体转染的细胞。
“治疗”指对受试者进行处理以获得有益的或所期望的临床结果。本文所用的“治疗”涵盖各种处理手段，包括以任何可能的药物向受试者给药、手术、辐射等。出于本发明的目的，有益或所期望的临床结果包括但不限于以下的任一种或多种：减轻一种或更多种症状、减弱疾病程度、预防或延迟疾病扩散(例如转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病病况、抑制疾病或疾病进展、阻滞其发展和缓解(无论部分抑或完全缓解)。本文所提供的方法涵盖这些治疗方面中的任一种或多种。按照以上内容，“治疗”不需要完全去除病症或疾病的所有症状或完全缓解。
术语“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本发明融合蛋白的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01mg至100mg或更多活性成分。
“实体癌(或实体瘤)”指有形肿瘤，可通过诸如CT、磁共振等的影像学检查方法检测到。实体瘤的实例包括胃癌、肺癌、结直肠肠、胰腺癌、乳腺癌及肝癌等。
提及药物组合物，所使用的术语“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂、稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。依照给药途径，可以施用本领域众所周知的各种不同的载体，包括，但不限于糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽糖、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸缓冲液、乳化剂、等渗盐水和/或无热原水等。本文所提供的药物组合物可以制成粉末、注射剂等临床可接受的剂型。可以使用任何适当的途径向受试者施用本发明的药物组合物，例如可通过口服、静脉内输注、肌肉内注射、皮下注射、腹膜下、直肠、舌下，或经吸入、透皮等途径给药。
“受试者”指动物，例如哺乳动物，包括(但不限于)人类、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳类实验动物、哺乳类农畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。受试者可为雄性或雌性且可为任何适龄受试者，包括婴儿、幼年、青年、成年和老年受试者。在一些实例中，受试者指需要治疗疾病或病症的个体。在一些实例中，接受治疗的受试者可为患者，其患有与该治疗有关联的病症，或有风险患上该病症。在另一些实例中，受试者为健康个体或者为患有非所关注疾病的个体。在特定实例中，受试者为人类，诸如人类患者。该术语通常可与“患者”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。
提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性(sequence identity)”(也称为“序列同一性”)指两氨基酸或核苷酸序列(例如查询序列和参照序列)之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对(alignment)并引入缺口(gap)(如果有的话)。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST(可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到)，通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。
“CD73”也被称为胞外-5'-核苷酸酶(ecto-5'-NT或EC 3.1.3.5)，是一种细胞表面磷酸酶，催化细胞外AMP的去磷酸化以产生腺苷。在生理上，CD73被缺氧诱导以控制损伤部位的炎症。在病理学上，CD73经常被发现在调节性T细胞(Tregs)和肿瘤细胞上过度表达。CD73活性的提高导致了腺苷在肿瘤微环境(TME)中的积累。通过与腺苷受体A2a和A2b结合，腺苷通过调节许多免疫细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞和T效应细胞，抑制先天和适应性免疫。因此，有推测，腺苷的免疫抑制可能通过抑制TME中CD73的活性而得到缓解。事实上，体内的动物研究表明，抑制CD73的活性可以抑制肿瘤的形成和生长，这表明CD73是一个有希望的癌症治疗目标。术语“人CD73”是指源自人类的CD73。人CD73的一个示例性氨基酸序列在GenBank登录号P21589.1中表示。
在一些实施方案中，本公开的抗CD73单克隆抗体可与人类以外的物种的CD73或与人类CD73结构相关的其他蛋白质发生交叉反应。在一些实施方案中，本文提供的抗CD73单克隆抗体对人CD73具备完全的特异性，不表现出物种或其他类型的交叉反应性。
抗CD73抗体或其抗原结合片段
本文提供了特异性结合CD73的抗CD73抗体或其抗原结合片段。该抗CD73抗体或其抗原结合片段以相对较高的结合亲和力结合CD73分子。例如下文实施例中所阐述的，抗CD73抗体或其抗原结合片段与CD73结合能力可通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)和流式细胞荧光分选技术(FACS)的测定方法来进行测量。另外，也可通过本领域已知的其他蛋白相互作用测定方法来测定，例如，表面等离子体共振技术(SPR)、生物层干涉(BLI)技术。抗CD73抗体或其抗原结合片段与CD73结合后可抑制其活性，例如将AMP转化为腺苷的催化活性。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD73单克隆抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，该VH包括选自SEQ ID NO:2(NYWIH)、SEQ IDNO:10(NYWMH)、SEQ ID NO:18(SYWIN)、SEQ ID NO:26(NYGIS)、SEQ ID NO:34(SYWIN)、SEQID NO:42(NYGIT)、SEQ ID NO:50(SYGIN)、SEQ ID NO:58(GYYMH)、SEQ ID NO:66(SYAMS)、SEQ ID NO:74(RYGIH)或SEQ ID NO:82(GYYMH)的HCDR1或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该HCDR1变体，选自SEQ ID NO:3(YINPGDDYIKYSQNFKG)、SEQ ID NO:11(YINPSDAYTTYSQNFKG)、SEQ ID NO:19(NIYPGNSDTNNNEKFRN)、SEQ ID NO:27(EIYPGSGNTYYNEKFKD)、SEQ ID NO:35(NIYPGNSNTNYNEKFKS)、SEQ ID NO:43(EIYPGSGNAYYKENFKG)、SEQ ID NO:51(EIYPGSGNTYYNEKFKV)、SEQ ID NO:59(RINPYNGATTYNQNFKD)、SEQ ID NO:67(TISSGGSSTYYPDSVKG)、SEQ ID NO:75(VIWVGGSTNYNSTLMS)或SEQ ID NO:83(RINPYNGATNYNQNFKD)的HCDR2或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该HCDR2变体，以及选自SEQ ID NO:4(SPIYYNDFDY)、SEQ ID NO:12(SPIYYNNFDY)、SEQ ID NO:20(ENGNNDWYFDV)、SEQ ID NO:28(FDYSGYYYALDY)、SEQ ID NO:36(EGDTYSWYFDV)、SEQ ID NO:44或105(FDYIYYNGLEY或FDYIYYNALEY)、SEQ ID NO:52(NWDYYFDY)、SEQ ID NO:60(SIGSSPFDY)、SEQ ID NO:68(RGTTEVPHFDY)、SEQ ID NO:76(DGGITTVVADY)或SEQ ID NO:84(SHYGSFDY)的HCDR3或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该HCDR3变体；该VL包括选自SEQ ID NO:6(KASQDIKSYLS)、SEQ ID NO:14(KASQDIKSYLS)、SEQ ID NO:22(RASQSVSTSGYSYMH)、SEQ ID NO:30(KASQDLSTAVA)、SEQ IDNO:38(SASSSISSNYLH)、SEQ ID NO:46(KASQDVTTAVA)、SEQ ID NO:54(KASQDIKGYLG)、SEQID NO:62(KASQDINSYLS)、SEQ ID NO:70(KASQSVSNEAA)、SEQ ID NO:78(KASQDINSFLS)或SEQ ID NO:86(KASQDINSYLS)的LCDR1或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该LCDR1变体，选自SEQ ID NO:7(YATSLAD)、SEQ ID NO:15(YATDLAD)、SEQ ID NO:23(LASNLKS)、SEQID NO:31(PASFLYT)、SEQ ID NO:39(GTSNLAS)、SEQ ID NO:47(SASHRYT)、SEQ ID NO:55(YTTNLAD)、SEQ ID NO:63(RGNWLVD)、SEQ ID NO:71(YASNRYS)、SEQ ID NO:79(RAKRLVD)或SEQ ID NO:87(RANILID)的LCDR2或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该LCDR2变体，和选自SEQ ID NO:8(LQYGDTTYT)、SEQ ID NO:16(LQYGENTYT)、SEQ ID NO:24(QHSRELPWT)、SEQ ID NO:32(QQRYSTPYT)、SEQ ID NO:40(QQGYILPFT)、SEQ ID NO:48(QQHSSPPFT)、SEQID NO:56(LQHGESPFT)、SEQ ID NO:64(LQYDEFPNT)、SEQ ID NO:72(QQDYSSPWT)、SEQ IDNO:80(LQYDELYT)或SEQ ID NO:88(LQYDEFPYT)的LCDR3或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该LCDR3变体。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段为CD73的抑制剂，并且针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性具有约10-1μg/mL至约10-3μg/mL的IC50值。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性的IC50值小于参照抗体MEDI9447针对CD73的IC50值。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段结合表达CD73的细胞的EC50值为约1μg/mL至约10-2μg/mL(如通过FASC检测的)。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段结合表达CD73的细胞的EC50值小于参照抗体MEDI9447结合表达CD73的细胞的EC50值。
在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段包括选自SEQ ID NO:4、12、20、28、36、44、52、60、68、76、84或105的HCDR3和选自SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48、56、64、72、80或88的LCDR3，而氨基酸替换出现在VH和VL的CDR1和CDR2结构域中。
因此，在一些实施方案中，本文提供了这样的抗CD73抗体或其抗原结合片段，其VH包括选自SEQ ID NO:2(NYWIH)、SEQ ID NO:10(NYWMH)、SEQ ID NO:18(SYWIN)、SEQ ID NO:26(NYGIS)、SEQ ID NO:34(SYWIN)、SEQ ID NO:42(NYGIT)、SEQ ID NO:50(SYGIN)、SEQ IDNO:58(GYYMH)、SEQ ID NO:66(SYAMS)、SEQ ID NO:74(RYGIH)或SEQ ID NO:82(GYYMH)的HCDR1或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该HCDR1变体，选自SEQ ID NO:3(YINPGDDYIKYSQNFKG)、SEQ ID NO:11(YINPSDAYTTYSQNFKG)、SEQ ID NO:19(NIYPGNSDTNNNEKFRN)、SEQ ID NO:27(EIYPGSGNTYYNEKFKD)、SEQ ID NO:35(NIYPGNSNTNYNEKFKS)、SEQ ID NO:43(EIYPGSGNAYYKENFKG)、SEQ ID NO:51(EIYPGSGNTYYNEKFKV)、SEQ ID NO:59(RINPYNGATTYNQNFKD)、SEQ ID NO:67(TISSGGSSTYYPDSVKG)、SEQ ID NO:75(VIWVGGSTNYNSTLMS)或SEQ ID NO:83(RINPYNGATNYNQNFKD)的HCDR2或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该HCDR2变体，以及选自SEQ ID NO:4(SPIYYNDFDY)、SEQ ID NO:12(SPIYYNNFDY)、SEQ ID NO:20(ENGNNDWYFDV)、SEQ ID NO:28(FDYSGYYYALDY)、SEQ ID NO:36(EGDTYSWYFDV)、SEQ ID NO:44或105(FDYIYYNGLEY或FDYIYYNALEY)、SEQ ID NO:52(NWDYYFDY)、SEQ ID NO:60(SIGSSPFDY)、SEQ ID NO:68(RGTTEVPHFDY)、SEQ ID NO:76(DGGITTVVADY)或SEQ ID NO:84(SHYGSFDY)的HCDR3；其VL包括选自SEQ ID NO:6(KASQDIKSYLS)、SEQ ID NO:14(KASQDIKSYLS)、SEQ ID NO:22(RASQSVSTSGYSYMH)、SEQ ID NO:30(KASQDLSTAVA)、SEQ IDNO:38(SASSSISSNYLH)、SEQ ID NO:46(KASQDVTTAVA)、SEQ ID NO:54(KASQDIKGYLG)、SEQID NO:62(KASQDINSYLS)、SEQ ID NO:70(KASQSVSNEAA)、SEQ ID NO:78(KASQDINSFLS)或SEQ ID NO:86(KASQDINSYLS)的LCDR1或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该LCDR1变体，选自SEQ ID NO:7(YATSLAD)、SEQ ID NO:15(YATDLAD)、SEQ ID NO:23(LASNLKS)、SEQID NO:31(PASFLYT)、SEQ ID NO:39(GTSNLAS)、SEQ ID NO:47(SASHRYT)、SEQ ID NO:55(YTTNLAD)、SEQ ID NO:63(RGNWLVD)、SEQ ID NO:71(YASNRYS)、SEQ ID NO:79(RAKRLVD)或SEQ ID NO:87(RANILID)的LCDR2或包括至多3个(如1、2或3个)氨基酸替换的该LCDR2变体，和选自SEQ ID NO:8(LQYGDTTYT)、SEQ ID NO:16(LQYGENTYT)、SEQ ID NO:24(QHSRELPWT)、SEQ ID NO:32(QQRYSTPYT)、SEQ ID NO:40(QQGYILPFT)、SEQ ID NO:48(QQHSSPPFT)、SEQID NO:56(LQHGESPFT)、SEQ ID NO:64(LQYDEFPNT)、SEQ ID NO:72(QQDYSSPWT)、SEQ IDNO:80(LQYDELYT)或SEQ ID NO:88(LQYDEFPYT)的LCDR3。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段为CD73的抑制剂，并且针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性具有约10-1μg/mL至约10-3μg/mL的IC50值。在一些实施方案中，该抗CD73单克隆抗体针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性的IC50值小于参照抗体MEDI9447针对CD73的IC50值。在一些实施方案中，该抗CD73单克隆抗体结合表达CD73的细胞的EC50值为约1μg/mL至约10-2μg/mL(如通过FASC检测的)。在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段结合表达CD73的细胞的EC50值小于参照抗体MEDI9447结合表达CD73的细胞的EC50值。
在一些实施方案中，所提及的氨基酸替换可以为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代通常可被描述为一种氨基酸残基被类似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有或基本上没有影响。保守氨基酸取代是本领域众所周知的。保守性取代可例如是下列(a)-(e)组中的一个氨基酸被同组内的另一个氨基酸取代：(a)小的脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段(如抗CD73单克隆抗体)，其中1)其VH包括分别为SEQ ID NO:2、3和4的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:6、7和8的LCDR1、LCDR2和LCDR3；2)其VH包括分别为SEQ ID NO:10、11和12的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:14、15和16的LCDR1、LCDR2和LCDR3；3)其VH包括分别为SEQ ID NO:18、19和20的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:22、23和24的LCDR1、LCDR2和LCDR3；4)其VH包括分别为SEQ ID NO:26、27和28的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:30、31和32的LCDR1、LCDR2和LCDR3；5)其VH包括分别为SEQ ID NO:34、35和36的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:38、39和40的LCDR1、LCDR2和LCDR3；6)其VH包括分别为SEQ ID NO:42、43和44的HCDR1、HCDR2和HCDR3或分别为SEQ ID NO:42、43和105的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ IDNO:46、47和48的LCDR1、LCDR2和LCDR3；7)其VH包括分别为SEQ ID NO:50、51和52的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:54、55和56的LCDR1、LCDR2和LCDR3；8)其VH包括分别为SEQ ID NO:58、59和60的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:62、63和64的LCDR1、LCDR2和LCDR3；9)其VH包括分别为SEQ ID NO:66、67和68的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:70、71和72的LCDR1、LCDR2和LCDR3；10)其VH包括分别为SEQ ID NO:74、75和76的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:78、79和80的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或11)其VH包括分别为SEQ ID NO:82、83和84的HCDR1、HCDR2和HCDR3，其VL包括分别为SEQ ID NO:86、87和88的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段(如抗CD73单克隆抗体)，其包括：1)包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的VL(9E12E3)；2)包括SEQ ID NO:9所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:13所示氨基酸序列的VL(22E1E4)；3)包括SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:21所示氨基酸序列的VL(35D8G8)；4)包括SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的VL(52A8B3)；5)包括SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的VH和包括SEQ IDNO:37所示氨基酸序列的VL(52A6B3)；6)包括SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的VH和包括SEQID NO:45所示氨基酸序列的VL(96A5A5)；7)包括SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:53所示氨基酸序列的VL(100C5A3)；8)包括SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:61所示氨基酸序列的VL(134D2H6)；9)包括SEQ ID NO:65所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:69所示氨基酸序列的VL(141G7E9)；10)包括SEQ ID NO:73所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:77所示氨基酸序列的VL(143E5D2)；或11)包括SEQ ID NO:81所示氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:85所示氨基酸序列的VL(143H3C5)。
在一些实施方案中，提供了抗CD73抗体或其抗原结合片段(如抗CD73单克隆抗体)，其包括：1)包括与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；2)包括与SEQ ID NO:9所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:13所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；3)包括与SEQ ID NO:17所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:21所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；4)包括与SEQ ID NO:25所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:29所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；5)包括与SEQ ID NO:33所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:37所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；6)包括与SEQ ID NO:41所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:45所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；7)包括与SEQ ID NO:49所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:53所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；8)包括与SEQ ID NO:57所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:61所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；9)包括与SEQ ID NO:65所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:69所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；10)包括与SEQ ID NO:73所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括与SEQ ID NO:77所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL；或11)包括与SEQ ID NO:81所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VH和包括SEQ ID NO:85所示氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列的VL。
在一些实施方案中，该抗CD73抗体或其抗原结合片段(如抗CD73单克隆抗体)为鼠抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
上文描述的CDR可以以各种成对的组合来产生一些人源化的抗CD73抗体。人源化替换对于本领域的技术人员来说是已知的。例如，可以通过将其他物种来源的VH或VL的FR序列与一个或多个密切相关的人类VH或VL的相应FR序列进行比较来确定潜在有用的人源化替代氨基酸，然后使用本领域已知的方法(也如本文所述)将一个或更多个此类潜在有用的人源化替代氨基酸引入所述VH或VL中。在一些实施方案中，可通过以鼠CDR序列替换人抗体VH或VL的全部CDR序列(即人抗体的四个FR序列之间所有CDR序列)来获得人源化抗体。通常，同时对抗体的重链和轻链进行人源化处理。可以测试所得到的人源化抗体对CD73的结合亲和力、结合稳定性和/或其他需要的特性，如对CD73的活性的抑制能力。本文提供的抗CD73抗体或其抗原结合片段可以部分或完全人源化。优选的是，所得的人源化抗体，如人源化抗体或其抗原结合片段，与CD73结合，具有本文所述的KD、EC50或IC50值。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD73人源化抗体或其抗原结合片段，其VH包括SEQ ID NO:89、91、93、95、97、99和101中任一项的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:89、91、93、95、97、99和101中任一项的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列，其VL包括SEQ ID NO:90、92、94、96、98、100和102中任一项的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:90、92、94、96、98、100和102中任一项的氨基酸序列具有至少80％(例如至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该抗CD73人源化抗体或其抗原结合片段针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性具有约10-1μg/mL至约10-2μg/mL的IC50值。在一些实施方案中，该抗CD73人源化抗体或其抗原结合片段与CD73结合的KD值为约10-8M至约10-11M。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD73人源化抗体或其抗原结合片段，其包括：1)SEQ ID NO:89所示序列的VH和SEQ ID NO:90所示序列的VL(人源化的9E12E3)；2)SEQ IDNO:91所示序列的VH和SEQ ID NO:92所示序列的VL(人源化的35D8G8)；3)SEQ ID NO:93所示序列的VH和SEQ ID NO:94所示序列的VL(人源化的52A6B3)；4)SEQ ID NO:95所示序列的VH和SEQ ID NO:96所示序列的VL(人源化的96A5A5)；5)SEQ ID NO:97所示序列的VH和SEQID NO:98所示序列的VL(人源化的134D2H6)；6)SEQ ID NO:99所示序列的VH和SEQ ID NO:100所示序列的VL(人源化的143E5D2)；或7)SEQ ID NO:101所示序列的VH和SEQ ID NO:102所示序列的VL(人源化的22E1B4VL)。
在一些实施方案中，本文提供的抗CD73人源化抗体或其抗原结合片段，其进一步包括免疫球蛋白恒定区序列。所述免疫球蛋白恒定区可选自IgG1，IgG2或IgG4。在一些具体实施方案中，所述抗CD73人源化抗体或其抗原结合片段包含人IgG1恒定区序列。在一些实施方案中，所述CD73人源化抗体或其抗原结合片段的重链包含人IgG1重链恒定区序列，所述CD73人源化抗体或其抗原结合片段的轻链包含人Kappa链恒定区。所述人IgG1重链恒定区序列可以是SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列，所述人Kappa链恒定区可以是SEQ ID NO:104所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗CD73抗体，其与上文提供的任一抗CD73抗体或其抗原结合片段竞争性结合CD73(即“竞争性抗CD73抗体”)。在一些实施方案中，竞争性抗CD73抗体与上文提供的任一抗CD73抗体或其抗原结合片段竞争性结合CD73上的同一表位。这种竞争性结合可例如通过ELISA测定来进行检测。
本文所述的抗CD73抗体(如抗CD73单克隆抗体)可以使用本领域已知的任何方法或如本文所述的方法制备。
啮齿类单克隆抗体可以用本领域已知的方法获得，如通过免疫啮齿类动物(如小鼠或大鼠)并从中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆Fab片段或单链Fc(scFv)库，随后通过ELISA筛选或使用噬菌体展示进行选择。对于单克隆抗体的重组生产，编码单克隆抗体的核酸被分离或合成，并插入到可复制的载体中以进一步克隆(DNA的扩增)或表达。编码单克隆抗体的DNA很容易被分离出来，并使用常规程序进行测序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。许多载体是可用的。载体的选择部分取决于要使用的宿主细胞。一般来说，宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞(例如哺乳动物细胞)。
抗CD73抗体构建体
本申请另一方面提供编码上述抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸。本申请的核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。根据本领域技术人员公知的，改变(如，替换、删除等)编码蛋白的核苷酸序列不会改变蛋白的氨基酸，如密码子优化等方法。
本申请再一方面提供包含上述多核苷酸的表达载体。本领域技术人员公知的载体，如质粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些具体实施方案中，所述载体是重组表达载体，如质粒。这些载体包括任意元件以支撑其常规表达载体的功能，如，包括启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择性标记以及复制起点。其中启动子可以是常规启动子、诱导启动子或可抑制启动子。本领域公知许多表达载体能够将核酸传递至细胞内，并且能用于在细胞内产生抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施例中的方法，常规的克隆技术或人工基因合成均可用于产生重组表达载体。
本申请又一方面提供包含上述表达载体的宿主细胞或无细胞表达系统。在本发明从任何本领域常规的宿主细胞均可用于抗体或其抗原结合片段的表达。在一些实施方案中，所述宿主细胞是E.coli TG1或BL21(用于表达如scFv或Fab抗体)，CHO-DG44、CHO-3E7、CHO-K1或者HEK293。按照特定实施例，通过常规方法(如化学转染、热转染或电转染等方法)将重组表达载体转染入宿主细胞，稳定整合到宿主细胞基因组，因此能有效表达重组的核酸。本申请所述无细胞表达系统是一种区别于传统蛋白表达系统的新型蛋白制备系统，以DNA或mRNA为模板，利用细胞抽提物中的细胞器，蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、核苷酸、聚合酶和能量物质来实现蛋白表达的体外体统。
融合蛋白
在一些实施方案中，抗CD73抗体的抗原结合片段可以与Fc片段连接形成融合蛋白。Fc片段可位于抗CD73抗体的抗原结合片段的C末端和N末端。优选地，Fc片段可位于抗CD73抗体的抗原结合片段的C末端。抗CD73抗体的抗原结合片段与Fc片段形成的融合蛋白具有特异性结合CD73的能力，同时具有Fc片段的效应功能，例如介导补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、介导吞噬作用等。另外，与Fc片段的融合可增加抗CD73抗体的抗原结合片段在体内的半衰期，以便在将抗CD73抗体的抗原结合片段用作治疗药物时增加其给药间隔时间。在一些实施方案中，所述Fc片段可来源于免疫球蛋白的恒定区，如IgG1，IgG2或IgG4。
在一些实施方案中，抗CD73抗体的抗原结合片段可以与蛋白标签连接形成融合蛋白。蛋白标签可包括纯化标签和可检测标签。纯化标签包括但不限于His6标签、Flag标签、MBP标签、GST标签、SUMO)标签等。可检测标签可用于指示样品中抗CD73抗体或其抗原结合片段的存在或含量，或者用于抗CD73抗体或其抗原结合片段在受试者体内或细胞内的位置信息。可检测标签的实例包括免疫检测中可使用的各种酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等；荧光蛋白，例如GFP。由于抗CD73抗体或其抗原结合片段与CD73的特异性结合能力，可通过与抗CD73抗体或其抗原结合片段连接的可检测标签的量来确定抗CD73抗体或其抗原结合片段量，并进而确定样品中CD73的含量。
在另一些实施方案中，抗CD73抗体或其抗原结合片段可以与细胞因子或治疗性蛋白连接形成融合蛋白。这种情况下，可以借助抗CD73抗体或其抗原结合片段与CD73的特异性结合能力，将细胞因子或治疗性蛋白有目的地输送至特定的组织或细胞，实现细胞因子或治疗性蛋白的治疗作用。
多特异性抗体
在一些实施方案中，本文提供了多特异性的结合肽，其至少包括一个结合CD73的结构域(或功能单元)和一个或更多个额外的结合结构域。该一个或更多个额外的结合结构域可结合至除CD73外的第二抗原或蛋白质。
在一些实施方案中，该多特异性抗体为双特异性抗体。
在一些实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域包括本文提供的抗CD73抗体或其抗原结合片段，能够特异性结合CD73；第二抗原结合结构域能够特异性结合抑制性免疫检查点分子，例如特异性结合CTLA-4、PD-L1、TIM-3或LAG-3。
因此，在一个实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域能够结合CD73，第二抗原结合结构域能够结合CTLA-4。优选地，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域为scFv形式，第二抗原结合结构域为scFv形式或sdAb形式。
在一个实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域能够结合CD73，第二抗原结合结构域能够结合PD-L1或PD-1。优选地，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域为scFv形式，第二抗原结合结构域为scFv形式或sdAb形式。
在一个实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域能够结合CD73，第二抗原结合结构域能够结合TIM-3。优选地，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域为scFv形式，第二抗原结合结构域为scFv形式或sdAb形式。
在一个实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域能够结合CD73，第二抗原结合结构域能够结合LAG-3。优选地，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域为scFv形式，第二抗原结合结构域为scFv形式或sdAb形式。
在一些实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域包括本文提供的抗CD73抗体或其抗原结合片段，能够特异性结合CD73；第二抗原结合结构域能够特异性结合CD39-CD73-腺苷通路上的蛋白(酶或受体)。
在一个实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域能够结合CD73，第二抗原结合结构域能够结合CD39。优选地，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域为scFv形式，第二抗原结合结构域为scFv形式或sdAb形式。
在一个实施方案中，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域能够结合CD73，第二抗原结合结构域能够结合腺苷2A受体(A2AR)。优选地，该双特异性抗体的第一抗原结合结构域为scFv形式，第二抗原结合结构域为scFv形式或sdAb形式。
在一些实施方案中，双特异性抗体还包括Fc片段。Fc片段的存在可方便地形成结合结构域的多聚化，并且可提供相关的效应功能。
药物组合物和治疗方法
本文公开的抗CD73抗体或其抗原结合片段与CD73的特异性结合能力与对照抗体MEDI9447类似，部分CD73抗体或其抗原结合片段的结合能力优于对照抗体MEDI9447。本文公开的抗CD73抗体或其抗原结合片段对CD73抑制能力与对照抗体MEDI9447类似，部分抗CD73抗体或其抗原结合片段的抑制能力优于对照抗体MEDI9447。
本文公开的抗CD73抗体或其抗原结合片段以及包括该抗CD73抗体或其抗原结合片段的融合蛋白或多特异性抗体分子可以与药学上可接受的载体一起配制为药物组合物，对受试者给药以进行肿瘤预防或治疗。
在一些实施方式中，本文公开的抗CD73抗体或其抗原结合片段以及包括该抗CD73抗体或其抗原结合片段的融合蛋白或多特异性抗体分子可以与一种或更多种其他药物(例如抗肿瘤剂)联合给药。在一些实施方案中，抗肿瘤剂可以为小分子化合物，例如CD39抑制剂、CD73抑制剂或A2AR抑制剂。
在一些实施方案中，所治疗的疾病或病症为肿瘤，优选实体瘤。所述实体瘤可以是转移性结直肠癌、激素难治性前列腺癌、黑色素瘤、转移性头颈癌、转移性卵巢癌、鳞状细胞癌等，尤其是非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)和胰腺癌等。可以使用任何合适的方法或途径以本文公开的抗CD73抗体或其抗原结合片段(以及包括抗CD73抗体或其抗原结合片段的融合蛋白或多特异性抗体分子)给药，并任选地联用其他抗肿瘤剂。给药途径包括，例如，口服、静脉内、腹膜内、皮下或者肌内给药。
编码抗CD73抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包括该核酸分子的表达载体以及经所述核酸分子或表达载体转染的宿主细胞也可通过各种方式用于上述治疗目的。例如，对于表达载体，可通过本领域已知的基因治疗手段引入受试者体内，表达目的蛋白或多肽(抗CD73抗体或其抗原结合片段以及包括抗CD73抗体或其抗原结合片段的融合蛋白或多特异性抗体分子)，从而达到治疗目的。
该用途的有效用量可取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的总体状态。给药方案将也随疾病状态和受试者状态而变动，并且一般范围将从单次大量(bolus)给药或连续输注至每天多次给药(例如每隔4-6小时)。本领域熟练的临床医生可以例如通过利用临床试验、身体检查和受试者家族史，容易地确定某受试者是否为这种治疗的候选者。
包括抗CD73抗体或其抗原结合片段检测或治疗试剂盒
本文提供的抗CD73抗体或其抗原结合片段以及包括抗CD73抗体或其抗原结合片段的其他形式分子(例如融合蛋白或双特异性抗体分子)可与样品中的CD73特异性结合。通过检测所形成的抗CD73抗体或其抗原结合片段-CD73复合物的量，或者所形成的抗CD73抗体或其抗原结合片段-CD73复合物中抗CD73抗体或其抗原结合片段的量，可方便的确定样品中的CD73的含量(或是否存在)。
如上文所描述的，用于该目的，本文提供的抗CD73抗体或其抗原结合片段可与各种检测标签连接，方便通过各种手段进行检测，这包括但不限于生物发光、荧光、放射性标记、酶促反应的产物生产量等。检测样品中CD73含量后，与正常人群中正常CD73含量进行比较，可用于确定提供该样品的受试者的疾病状况或严重程度。通过在受试者治疗过程随时间反复检测CD73含量变化，还可用于确定治疗手段是否有效，从而为治疗方案的改动提供依据。
本文提供的抗CD73抗体或其抗原结合片段以及包括该抗CD73抗体或其抗原结合片段的其他形式分子(例如融合蛋白或双特异性抗体分子)可被置于容器中，以形成检测断或治疗试剂盒。这些容器可以是盒、安瓿瓶、小瓶、管子、袋子或本领域已知的合适容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适用于保存药物的其他材料制成。如果需要，与该容器一起提供的还包括使用说明书。说明书通常可包括关于如何使用抗CD73抗体或其抗原结合片段结合肽或包括抗CD73抗体或其抗原结合片段的组合物用于治疗或预防肿瘤(例如实体瘤)的信息，例如可包括对治疗剂(如抗CD73抗体或其抗原结合片段)的描述；用于治疗或预防瘤形成(例如多发性骨髓瘤)的剂量方案；注意事项；警告；适应症；禁忌症；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考资料。说明书可直接打印在容器(如果存在的话)上，或作为贴于容器的标签，或者作为提供于容器中或与容器在一起的单独的纸、册、卡或折叠印刷品。
实施例1:抗CD73单克隆抗体的制备
免疫接种
根据现行动物福利法规，用人类CD73-HIS蛋白(R&D SYSTEMS,Cat#5795-EN)免疫3只Balb/c和3只A/J小鼠。将抗原溶在PBS溶液中，或与CFA(弗氏完全佐剂；初次免疫)或IFA(弗氏不完全佐剂；增强免疫)形成乳剂进行免疫。在一系列免疫方法中，抗原通过腹腔注射或背部皮下注射免疫。每只动物接受4剂(第一针免疫为每只鼠50μg，然后在接下来的三针是每只鼠25μg)。在免疫过程中，在每个免疫时间点后7天，从动物身上采集20μL血样，通过包被hCD73蛋白(R&D SYSTEMS，Cat#5795-EN)的ELISA方法检测血清中抗血清滴度，直到满足融合标准。在本发明中，5只小鼠(2只Balb/c小鼠和3只A-J小鼠)血清效价高，用于融合。
分泌抗hCD73抗体杂交瘤的筛选
最后一次免疫后三天，按照标准杂交瘤生成方案，在无菌环境中提取选定小鼠的脾细胞并与sp2/0细胞融合。融合细胞在含有1×HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)以及10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养6天。在本发明中，总共筛选了160个96孔板杂交瘤。通过ELISA分析所有杂交瘤上清液与人CD73的结合能力。根据ELISA信号(OD450)筛选抗人CD73的阳性克隆。在本发明中，通过ELISA选择了408株从A-J小鼠产生的抗hCD73杂交瘤(ELISA OD>2.0)和62株从Balb/c小鼠产生的抗hCD73杂交瘤(ELISA OD>0.3)，之后用流式细胞仪检测它们与过表达人CD73的CHO-K1稳定细胞系的结合能力，共有159株杂交瘤与细胞表面hCD73结合，这些亲代杂交瘤通过有限稀释进行亚克隆。将100μl细胞悬液梯度稀释至1-3个细胞/孔，在含有1×HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷)以及10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞培养1周后，使用ELISA和FACS进行新一轮筛选，直到获得阳性单克隆。选定的每个独特的克隆用于生产0.5mg杂交瘤纯化抗体，该抗体用于进一步鉴定。总共选择了124个阳性单克隆进行抗体生产和纯化，并通过ELISA进行抗体亲和力测定(表1)。检测抗体同种型(Clonotyping System-HRP,SouthernBiotech；Birmingham,AL)，用Protein-A磁珠(GenScript，Cat#L00695)纯化抗体，用0.5M柠檬酸钠溶液(pH3.5)洗脱，并用0.5M Tris-HCl(pH9.0)中和。将储存缓冲液改为PBS，用nanodrops(Thermofisher,Cat#ND-ONE-W)测定浓度。
表1:ELISA测定的124个单克隆上清液中抗体与CD73的结合信号
实施例2:抗hCD73小鼠抗体的特性
抗CD73小鼠抗体体外功能测定
抗CD73小鼠抗体的功能测定基于Calu-6细胞表面CD73酶的活性，该酶的活性可以反应在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中真正的翻译后修饰。使用Promega试剂盒(CellTiter试剂盒，目录号#：G7571)进行抗CD73小鼠抗体功能测定，以抑制Calu-6细胞表面CD73酶活性。已知过量的AMP可阻断ATP依赖的荧光素酶活性，Calu-6细胞上的CD73能将AMP分解为腺苷和无机磷酸盐，可以增强荧光素酶活性并发光。因此，阻断CD73酶活性的抗体将减少光发射。共检测了124种1μg/ml的抗体对CD73蛋白活性的拮抗能力。选择单剂量抑制率大于50％的抗体进行多剂量抑制试验和IC50测定。简而言之，Calu-6细胞(ATCC，分类号：HTB-56TM)接种到96孔培养皿中，37℃培养过夜。然后，用含有不同浓度的抗CD73抗体的新鲜培养基替换原培养基，加至相应的培养板孔。在室温下培养分析板30分钟。为了检测CD73活性，将AMP溶液添加到细胞中，然后在37℃下培养2小时。为了将AMP(SIGMA)定量，将培养上清液转移到另一个96孔分析板上，并向相应的孔中添加100μM ATP(SIGMA)。在室温下培养5～10分钟后，将CellTiter Glo溶液添加到96孔分析板中，与Phrastar(BMG LABTECH，GR18010766)温和混合并读取分析板数据。抗体的抑制作用取决于AMP的量。ATP+AMP表示最大荧光素酶抑制(100％)，ATP+AMP+CD73表示无荧光素酶抑制(0％)。剩余CD73活性的公式如下所示：
剩余CD73活性＝((ATP+AMP+CD73+Abs)-(ATP+AMP)/(ATP+AMP+CD73)-(ATP+AMP))*100
抗CD73抗体抑制活性的公式如下：
抑制率％(抗CD73抗体活性)＝(1-((ATP+AMP+CD73+Abs)-(ATP+AMP)/(ATP+AMP+CD73)-(ATP+AMP))*100
通过Calu-6细胞共检测了20种抗CD73抗体对CD73蛋白的IC50(最大抑制浓度的一半)，8种抗体显示出与MEDI9447相当或优于MEDI9447的抑制能力，包括52A6B3、52A8B3、96A5A5、100C5A3、134D2H6、141G7E9、143E5D2以及143H3C5(见图1-3)。为了确定抗体对交叉物种CD73的结合，通过流式细胞术检测20种抗CD73抗体对表达人(Probio，货号：RD00783)、食蟹猴(Probio，货号：RD00783)和小鼠CD73(Probio，货号：RD00783)CHO细胞(ATCC，分类号：CCL-61TM)的结合。三种抗体先导物9E12E3、22E1B4和35D8G8可结合小鼠源和食蟹猴源的CD73(数据未提供)，根据图4和表2列出的Calu-6细胞表面CD73活性的IC50值，三种抗体结合CD73活性的IC50和MEDI-9447相当。将上述11种小鼠抗体(包括9E12E3、22E1E4、35D8G8、52A6B3、52A8B3、96A5A5、100C5A3、134D2H6、141G7E9、143E5D2和143H3C5)进行测序。表3列出了这些抗CD73抗体的VH、VL和CDR氨基酸序列。
FACS检测鼠抗体与人CD73+/CHO-K1过表达细胞的结合
为了验证抗体与细胞表面抗原结合，大约1×105个过表达人的CD73(Probio,CatNo:RD00783)的CHO-K1细胞(ATCC,Cat No:CCL-61TM)进行反应，之后以3倍连续稀释抗CD73单克隆抗体(45至7.6×10-4μg/ml)与细胞孵育，然后用1μg/mL荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗染色。以平均荧光强度表示结合亲和力，如图5所示。抗体52A6B3、52A8B3、96A5A5、100C5A3和134D2H6的EC50低于MEDI9447，显示其结合能力比MEDI9447好。而141G7E9、143E5D2和143H3C5的EC50高于MEDI9447。表4列出了所有抗体的EC50。
表2:抗CD73小鼠抗体对Calu-6细胞表面的人CD73的IC50
克隆 IC50(μg/ml) 克隆 IC50(μg/ml)
9E12E3 0.0444 100C5A3 0.0122
22E1B4 0.0216 134D2H6 0.0041
35D8G8 0.0209 141G7E9 0.0044
52A6B3 0.0097 143E5D2 0.0105
52A8B3 0.0165 143H3C5 0.0145
96A5A5 0.0055 MEDI9447 0.0142～0.0182
表3:11种抗CD73小鼠抗体的VH、VL和CDR氨基酸序列
表4：抗CD73小鼠单克隆抗体FACS结合数据的EC50
克隆 EC50(μg/ml) 克隆 EC50(μg/ml)
52A6B3 0.0960 141G7E9 0.956
52A8B3 0.0459 143E5D2 0.609
96A5A5 0.0503 143H3C5 0.254
100C5A3 0.136 Mouse IgG NA
134D2H6 0.0718 MEDI9447 0.157
实施例3人源化抗体的制备与分析
候选抗体的人源化设计
基于抗体可变结构域序列，分析CDRs、HV环和FRs，并进行同源性建模，以获得小鼠抗体的模型结构。计算了骨架残留物的溶剂可及表面积，根据结果，确定了掩埋的骨架氨基酸残基(速溶剂可及表面积<15％)。选择了一个VH和VL的人类受体，该受体与小鼠对应物具有相同的顶部序列。将小鼠抗体的CDR直接移植到人类受体框架上(Human-IgG1)，以获得移植抗体的序列，而无任何反向突变，其中某些氨基酸被回复成小鼠框架序列。七个克隆包括9E12E3、35D8G8、52A6B3、96A5A5、134D2H6、143E5D2、22E1B4，均已成功人源化。氨基酸序列如表5所示(所采用的恒定区序列如SEQ ID NO：103和104所示)。
合成了编码人源化轻链和重链的DNA序列，导入pcDNA3.4，并转染Expi293F细胞(Genscript Probio，目录号：SC1975)以产生抗体蛋白。
将抗体特性与MEDI-9447进行比较
使用Biacore 8K(Cytiva，Cat#29125379)通过表面等离子体共振(SPR)将人源化抗体与同源小鼠抗体进行比较。简单地说，小鼠和人类抗体通过传感器芯片蛋白A(Cytiva，Cat#：29127555)与蛋白A结合进行亲和捕获。人类CD73 CED蛋白(R&D SYSTEMS，Cat#5795-EN)处于流动相，采用结合和解离用1:1的结合模型。关联接触时间为120秒，分离接触时间为360秒，流速为30μl/min。抗体-抗原结合亲和性结果如表6所示，抗体在人源化后与CD73的结合亲和力与鼠源抗体相当。
共检测了七种人源化抗CD73抗体对Calu-6细胞上CD73蛋白的IC50(最大抑制浓度的一半)，具体方法同实施例2的抗CD73小鼠抗体的体外功能测试方法，测定结果见图6A和6B。表7和表8(两批实验结果)列出了所有的人源化抗CD73抗体的IC50值。在七种人源化抗体中，人源化96A5A5和56A6B3表现出比MEDI-9447更好的抑制CD73活性，人源化134D2H6和143E5D2失去了对CD73的抑制能力，尽管这两种抗体与人CD73 ECD蛋白的结合亲和力没有降低。
表5:七种人源化抗CD73抗体的VH、VL和CDR氨基酸序列
表6:人源化抗体与CD73-ECD结合的亲和力
表7.人源化抗CD73抗体的IC50
克隆 IC50(μg/ml)
MEDI-9447 0.0281
Humanized 9E12E3 0.3610
Humanized 35D8G8 0.0456
Humanized 52A6B3 0.0275
Humanized 134D2H6 0.1245
Humanized 143E5D2 NA
表8.抗CD73人源化抗体的IC50
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
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Claims (21)

1.分离的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，其中，所述VH包括分别具有SEQ ID NO:42、43和44所示序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包括分别具有SEQ ID NO:46、47和48所示序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中所述抗体或其抗原结合片段能够特异性结合CD73。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
3.如权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体、scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2或Fv。
4.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体的VH包括SEQ IDNO:95所示氨基酸序列，所述人源化抗体的VL包括SEQ ID NO:96所示氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体针对细胞表面表达的所述CD73的酶活性具有10-1μg/mL至10-2μg/mL的IC50值。
6.如权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与所述CD73之间结合的KD值为10-8M至10-11M。
7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和/或VL连接至免疫球蛋白的恒定区。
8.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH连接至IgG1恒定区。
9.双特异性抗体，其包括权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和第二抗体部分。
10.如权利要求9所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分能够结合不同于CD73的抗原。
11.如权利要求9或10所述的双特异性抗体，其中所述不同于CD73的抗原为CD39、CTLA-4、PD-L1、TIM-3、LAG-3或A2aR。
12.如权利要求9或10所述的双特异性抗体，其中所述第二抗体部分为Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、scFv或sdAb。
13.编码权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求9-12中任一项所述的双特异性抗体的多核苷酸。
14.包含权利要求13所述多核苷酸的载体。
15.包含权利要求13所述多核苷酸或权利要求14所述载体的细胞。
16.用于癌症治疗的药物组合物，包括：
权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求9-12中任一项所述的双特异性抗体；以及
药学上可接受的载体。
17.如权利要求16所述的药物组合物，还包括一种或更多种其他抗癌剂。
18.如权利要求16或17所述的药物组合物，其中所述癌症为实体癌。
19.权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求9-12中任一项所述的双特异性抗体、权利要求13所述的多核苷酸、权利要求14所述的载体或权利要求15所述的细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为实体癌。
21.如权利要求19或20所述的用途，其中所述癌症选自非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌或胰腺癌。
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