CN116763793A - 喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化药合成领域，具体涉及喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用。该喹唑酮类化合物结构如式I所示，由2‑氨基‑4‑甲基苯甲酰胺与柠檬醛反应制得。本发明提供了一种喹唑酮类化合物，其针对白血病和胃癌的IC50可分别达到6.0μM和4.0μM，为白血病和胃癌的药物研发提供了一种新的解决方案。本发明还提供了一种以天然柠檬醛作为原料的合成方法，具有无需催化剂，反应选择性高，产率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于化药合成领域，具体涉及喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用。
背景技术
白血病是造血系统恶性疾病，按起病的缓急可分为急性白血病和慢性白血病两大类。其中，按照分类AML是白血病中的急性髓系白血病（acutemyelocytic leukemia，AML），HL60细胞是AML的典型代表细胞，常被用于抗白血病的药物研究。AML是成人多见的血液系统恶性肿瘤之一，临床针对AML的治疗通常采用联合序贯化疗，多数患者在初始诱导阶段可获得完全缓解，但临床耐药发生率较高以及部分患者无法耐受大剂量的化疗药物，最终大多数患者死于疾病的复发和并发症。开发抑制HL60细胞、SGC7901胃癌肿瘤细胞药物，筛选出对人急性白血病细胞株HL60细胞和SGC7901胃癌肿瘤细胞具有抑制作用化合物，可为相关药物研发提供研究基础。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种喹唑酮类化合物，其用于HL60细胞和SGC7901细胞抑制实验中的IC50（μM）可分别达到6.0和4.0，为白血病和胃癌的药物治疗提供了一种新的解决方法，该喹唑酮类化合物的结构如式I所示：
式I。
本发明还提供了上述喹唑酮类化合物的制备方法，由2-氨基-4-甲基苯甲酰胺与柠檬醛反应制得。
本发明的制备方法选择天然柠檬醛作为原料，制备含喹唑啉酮骨架化学衍生物。一方面，柠檬醛分子结构属于长链结构，同时含有不饱和双键结构，合成反应条件温和，不需要加入催化剂，柠檬醛分子结构未被破坏。另一方面，原材料柠檬醛为顺反异构体混合物之和，通过对合成产物的谱图解析，未出现顺反异构体产物。本研究条件下，主要产物为喹唑啉酮，反应选择性高，产率高。
同时，相同反应条件下，当选择饱和长碳链醛类化合物时，反应主要产物是二氢喹唑啉酮化合物，需要进一步通过脱氢制备喹唑啉酮，反应选择性差，产率低。
优选地，2-氨基-4-甲基苯甲酰胺与柠檬醛的摩尔比为（1-1.2）：1。更优选为1.2:1。当摩尔比低于1:1时，反应原料柠檬醛有剩余，在高温条件下，发生大量副反应，使反应产率降低。当摩尔比高于1.2:1时，原材料2-氨基-4-甲基苯甲酰胺大量剩余，高温条件下，产生环化反应，对反应产率有显著影响。
优选地，反应在二甲基亚砜溶剂中进行；反应温度为100 ℃-110℃。当采用乙酸乙酯、乙醇等低沸点溶剂时，反应体系沸腾严重，不利于目标化合物的制备，当采用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺等高沸点溶剂时，反应产率也不佳，因此采用二甲基亚砜作为反应溶剂。同时，反应温度低于100 ℃时，TLC监控反应原材料大量剩余，几乎不发生反应，当反应温度高于110 ℃时，反应发生大量副反应，对反应产率影响较大。
优选地，反应完全后，分三批次，每批次依次加入饱和食盐水和乙酸乙酯，合并有机相，采用体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯组成洗脱液柱层析分离，得到所述喹唑酮类化合物。
上述喹唑酮类化合物应用在制备治疗白血病药物和制备治疗胃癌药物中时，可以采用药物组合物的形式，除了包括上述喹唑酮类化合物，还包括其它药学上可接受的辅剂。所述辅剂可以为溶剂或载体；例如水和油类（花生油、大豆油、矿物油等）。
本发明的有益效果为：本发明提供了一种喹唑酮类化合物，其针对白血病和胃癌的IC50可分别达到6.0 μM和4.0 μM，为白血病和胃癌的药物研发提供了一种新的解决方案。本发明还提供了一种以天然柠檬醛作为原料的合成方法，具有无需催化剂，反应选择性高，产率高等优点。
附图说明
图1所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的流式分析细胞周期结果图；
图2所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的细胞周期统计分析结果图；
图3所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的AnnexinV-EGFP/PI法检测结果图；
图4所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的AnnexinV-EGFP/PI法检测结果的统计分析结果图；
图5所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的TUNEL法检测结果图；
图6所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的TUNEL法检测结果的统计分析结果图；
图7所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达的结果图；
图8所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的免疫印迹检测凋亡相关基因的表达的结果图；
图9所示为针对胃癌细胞SGC7901细胞的免疫印迹检测细胞信号通路关键蛋白表达水平结果图；
图10所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的流式分析细胞周期结果图；
图11所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的细胞周期统计分析结果图；
图12所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的AnnexinV-EGFP/PI法检测结果图；
图13所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的AnnexinV-EGFP/PI法检测结果的统计分析结果图；
图14所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的TUNEL法检测结果图；
图15所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的TUNEL法检测结果的统计分析结果图；
图16所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达的结果图；
图17所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的免疫印迹检测凋亡相关基因的表达的结果图；
图18所示为针对人早幼粒白血病HL60细胞系的免疫印迹检测细胞信号通路关键蛋白表达水平结果图；
图19所示为实施例1合成的喹唑酮类化合物的核磁共振氢谱图；
图20所示为实施例1合成的喹唑酮类化合物的核磁共振碳谱图；
图21所示为对比例1合成的喹唑酮类化合物的核磁共振氢谱图；
图22所示为对比例1合成的喹唑酮类化合物的核磁共振碳谱图；
图23所示为对比例2合成的喹唑酮类化合物的核磁共振氢谱图；
图24所示为对比例2合成的喹唑酮类化合物的核磁共振碳谱图；
图25所示为对比例3合成的喹唑酮类化合物的核磁共振氢谱图；
图26所示为对比例3合成的喹唑酮类化合物的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：
一种喹唑酮类化合物，其结构如式I所示：
式I。
制备方法包括以下步骤：
25 mL单口烧瓶中，依次加入2-氨基-4-甲基苯甲酰胺（1.2 eqiv（当量））和柠檬醛（1.0 eqiv），再加入5 mL 二甲基亚砜溶剂，加热至105 ℃采用HJ-2A型磁力搅拌反应器充分搅拌反应，TLC监测反应至原料无剩余。分三批次，每批次依次加入30 mL饱和食盐水，再加入20 mL乙酸乙酯，合并有机相，采用RE-301型旋转蒸发仪旋干溶剂，20 mm×50mm层析柱过柱。采用（石油醚：乙酸乙酯=5:1）柱层析，分离得到目标化合物。制备路线如下所示：
。
采用Bruker-400Hz核磁共振仪和Thermo-QE 高分辨液质联用仪对化合物进行检测，化合物的氢谱和碳谱分别如图19和图20所示，具体表征结果：白色固体, 收率 54%，分子式为C18H22N2O;1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.07 (s, 1H), 8.15-8.14 (d, J = 8.0Hz, 1H),7.51 (s, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.17 (s, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.29-2.18 (m,8H), 1.71(s, 3H), 1.66 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3) 163.8, 154.4, 151.4,149.8, 145.5, 132.5, 128.0, 127.3, 126.1, 123.4, 118.1., 117.5, 41.4, 26.4,25.8, 22.0, 19.4, 17.8。HRMS (ESI) m/z [M+H]+calcd forC18H23N2O+283.1810, found283.1813。其中，calcd表示的是“计算”，上述数据已经是根据谱图而做出的峰解析数据，在行业内是本领域技术人员所能够清楚认知的。
对比例1：
一种喹唑酮类化合物，其结构如下所示：
。
其制备方法包括以下步骤：
25 mL单口烧瓶中，依次加入2-氨基苯甲酰胺（1.2 eqiv）和柠檬醛（1.0 eqiv），再加入5 mL DMSO溶剂，加热至105 ℃采用HJ-2A型磁力搅拌反应器充分搅拌反应，TLC监测反应至原料无剩余。分三批次，每批次依次加入30 mL饱和食盐水，再加入20 mL乙酸乙酯，合并有机相，采用RE-301型旋转蒸发仪旋干溶剂，20 mm×50mm层析柱过柱。采用（石油醚：乙酸乙酯=5:1）柱层析，分离得到目标化合物。
采用Bruker-400Hz核磁共振仪和Thermo-QE 高分辨液质联用仪对化合物进行检测，化合物的氢谱和碳谱分别如图21和图22所示，具体表征结果：白色固体, 收率 61%，分子式为C17H20N2O;1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 11.56 (s, 1H), 8.30-8.28 (m, 1H),7.77-7.76(m, 2H), 7.50-7.26 (m, 1H), 6.14 (s, 1H), 5.19 (s, 1H), 2.33-2.30(m, 7H), 1.71(s, 3H), 1.67 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.1, 164.0,154.6, 151.5, 149.7, 134.6, 132.5, 127.6, 126.2, 123.3, 120.4, 117.2, 41.4,26.4, 25.7, 19.4, 17.8。HRMS (ESI) m/z [M+H]+calcd forC17H21N2O+269.1654, found269.1648。
对比例2：
一种喹唑酮类化合物，其结构如下所示：
。
其制备方法包括以下步骤：
25 mL单口烧瓶中，依次加入6-氟-2-氨基苯甲酰胺（1.2 eqiv）和柠檬醛（1.0eqiv），再加入5 mL 二甲基亚砜溶剂，加热至105 ℃采用HJ-2A型磁力搅拌反应器充分搅拌反应，TLC监测反应至原料无剩余。分三批次，每批次依次加入30 mL饱和食盐水，再加入20mL乙酸乙酯，合并有机相，采用RE-301型旋转蒸发仪旋干溶剂，20 mm×50mm层析柱过柱。采用（石油醚：乙酸乙酯=5:1）柱层析，分离得到目标化合物。
采用Bruker-400Hz核磁共振仪和Thermo-QE 高分辨液质联用仪对化合物进行检测，化合物的氢谱和碳谱分别如图23和图24所示，具体表征结果：白色固体, 收率 51%，分子式为C17H19FN2O;1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.43 (s, 1H), 7.65 (m, 1H), 7.50 (d,J = 8.4Hz, 1H), 7.08-7.01 (m, 1H), 6.10 (s, 1H), 5.16-5.14 (m, 1H), 2.33 (d,J = 1.2Hz, 3H), 2.29 (s, 4H), 1.70 (s, 3H), 1.65 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3) 162.8,161.7, 160.2, 156.1, 152.6, 152.0, 134.9, 134.8, 132.7, 123.6,123.5, 123.3,116.8, 112.7, 112.5, 110.2, 41.6, 26.4, 25.8, 19.7, 17.8。HRMS(ESI) m/z [M+H]+calcd for C17H20FN2O+287.1560, found 287.1567。
对比例3：
一种喹唑酮类化合物，其结构如下所示：
。
其制备方法包括以下步骤：
25 mL单口烧瓶中，依次加入5-氯-2-氨基苯甲酰胺（1.2 eqiv）和柠檬醛（1.0eqiv），再加入5 mL 二甲基亚砜溶剂，加热至105 ℃采用HJ-2A型磁力搅拌反应器充分搅拌反应，TLC监测反应至原料无剩余。分三批次，每批次依次加入30 mL饱和食盐水，再加入20mL乙酸乙酯，合并有机相，采用RE-301型旋转蒸发仪旋干溶剂，20 mm×50mm层析柱过柱。采用（石油醚：乙酸乙酯=5:1）柱层析，分离得到目标化合物。
采用Bruker-400Hz核磁共振仪和Thermo-QE 高分辨液质联用仪对化合物进行检测，化合物的氢谱和碳谱分别如图25和图26所示，具体表征结果：白色固体, 收率 51%，分子式为C17H19ClN2O;1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ 11.68 (s, 1H), 8.22 (d, J = 1.2 Hz,1H),7.67-7.64 (m, 2H), 6.11 (s, 1H), 5.19 (s, 1H), 2.34-2.30 (m, 7H), 1.71(s, 3H),1.68 (s, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3) 163.3, 155.9, 151.8,148.4,135.1, 132.8, 132.0, 129.4, 125.6, 123.2, 121.4, 117.0, 41.7, 26.5,25.8,19.7, 18.0。HRMS (ESI) m/z [M+H]+calcd forC17H2ClN2O+303.1264, found303.1268。
效果实验：
一、抑制率实验
采用MTT法测试化合物对HL60细胞增殖的抑制作用。将对数生长期的细胞以3.5×103个/孔接种于0.2 mL/孔的96孔培养板中，用不同浓度化合物样品孵育72 h。然后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 g /L），继续培养4 h，小心吸去孔内培养液，加入150 μL/孔二甲基亚砜（DMSO），使结晶充分溶解。测定空白对照组和实验组在波长490nm处的吸光度，计算抑制率。
采用MTT比色法评价化合物对胃癌细胞的抑制作用。取对数生长期人胃癌细胞SGC7901，以质量分数0.25%胰蛋白酶消化，倒置显微镜下计数，用MEM培养基稀释调整细胞密度约5×104个/mL，配制成细胞悬浮液，接种于96孔板，每孔100 μL，边缘孔用磷酸盐缓冲液（PBS）填充，同时设只加培养液不接种细胞的空白对照，37 ℃、5% CO2孵育15 h。弃掉孔内培养基，加入由培养基配制的不同质量浓度样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL），每孔200 μL，并分别设置阴性对照，每种处理设6 个重复，37 ℃、5% CO2培养24、48、72 h。然后吸出培养基，每孔加入200 μL 0.5 mg/mLMTT溶液，37 ℃、5% CO2培养箱继续孵育4 h。取出96孔板，终止培养，弃除孔内培养基，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃水平振荡摇动10 min，用酶标仪测定490 nm波长处的吸光度计算抑制率。
具体结果如表1所示。
表1
| 化合物 | 针对HL60细胞的IC50（μM） | 针对SGC7901细胞的IC50（μM） |
| 实施例1 | 6.0 | 4.0 |
| 对比例1 | 8.9 | 28.9 |
| 对比例2 | 26.2 | 47.7 |
| 对比例3 | 31.8 | 19.1 |
由表1可知，本发明的具有式I结构的化合物对于HL60和SGC7901具有很好的抑制活性，而相似结构的化合物并不是都具备这种抑制活性。
二、机制/机理研究实验
实验包括以下材料：胃癌细胞SGC7901（国家生物医学实验细胞资源库），人早幼粒白血病细胞HL60（国家生物医学实验细胞资源库），DMEM培养基（11965092，Gibco公司），胎牛血清（10100147，Gibco公司），CCK8细胞增殖检测试剂盒（C0038，碧云天生物技术有限公司），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（C1089，碧云天生物技术有限公司），Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测试剂盒（FA111，北京全式金生物技术有限公司），BCA蛋白定量试剂盒（23250，Thermo），Bax抗体（ab32503）、BCL2抗体(ab182858)、Cleaved-caspase3抗体（ab32042）购自美国abcam公司，Erk1/2（4370）、p-Erk1/2（9101）、AKT（4685）、p-AKT（9563）、PI3K（4257）和p-PI3K（17366）购自美国CST公司，ECL免疫印迹发光底物（32109，Thermo）。
细胞培养方法包括以下过程：在37 ℃恒温细胞培养箱中5% CO2条件下使用DMEM培养基（含10%灭活的胎牛血清和1%青霉素/链霉素）培养胃癌细胞SGC7901和人早幼粒白血病细胞HL60。细胞复苏时将细胞冻存液离心后将细胞悬液转移至6cm规格的培养皿中，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。细胞传代时使用0.25%的胰蛋白酶消化贴壁细胞，于显微镜下观察部分细胞脱壁后，用3 mL含有血清的DMEM培养基终止消化并离心后取上层液体接种于新培养皿中，补充培养，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中静置培养。使用EEZ-PCR支原体检测试剂盒（20-700-20，BI公司）检测细胞系支原体污染情况。最后细胞计数，将计数板及盖玻片用75%乙醇消毒液冲洗擦拭干净，晾干，吸取适量细胞悬液，稀释一定倍数，加样到血球计数板上，置于倒置显微镜下观察铺板情况，按细胞悬液的浓度=（计数板四角大方格内细胞的数量/4）×稀释倍数×104个/mL的公式计算细胞悬液的浓度。
药物（即化合物）处理情况为：配制：精确称量5 mg化合物，吸取细胞纯DMSO1.6269 mL充分溶解，配置成10 mM母液，0.22 μm滤膜过滤，-20 ℃保存，临用时吸取适量加入细胞纯DMSO稀释备用；形成3个处理组，即1 μmol/L处理组（1 μmo/L实施例1制得化合物处理细胞24 h）；5 μmol/L处理组（5 μmo/L实施例1制得化合物处理细胞24 h）；10 μmol/L处理组（10 μmo/L实施例1制得化合物处理细胞24 h）。
Annexin V-EGFP/PI细胞凋亡检测的过程如下：将对数生长期的胃癌细胞和人早幼粒白血病细胞接种在六孔板中，5%CO2，37 ℃条件下孵育 24 h。然后用用胰蛋白酶消化接种在6孔板中的细胞，500 g离心5 min收集细胞，用PBS缓冲液清洗两遍。用100 μL预冷的Annexin V结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL Annexin V-EGFP和5 μL PI，轻轻混匀，室温条件下避光反应15 min。加入400 μL预冷的Annexin V结合缓冲液，轻轻混匀，调整流式细胞仪相应参数，收集20000个细胞后结束检测，记录数据并用Modi Fit软件进行分析。
TUNEL法检测细胞凋亡的过程如下：细胞按照不同药物浓度处理24 h后，用PBS洗涤一次，用4%多聚甲醛固定细胞30 min后用PBS洗涤一次。加入含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5 min，用PBS洗涤2次后在样品上加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60min。用PBS洗涤3次后用抗荧光淬灭封片后荧光显微镜下观察。
细胞周期检测的过程如下：细胞按照不同药物浓度处理24 h后，从细胞培养箱中取出，用胰蛋白酶消化接种在6孔板中的细胞，500 g离心5 min收集细胞，用PBS缓冲液清洗两遍。加入1毫升预冷的70 %乙醇，轻轻吹打混匀，4 ℃固定2 h。1000 g离心3 min，沉淀细胞。每管细胞样品中加入2 μL碘化丙啶染色液和2 μL RNase A，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30 min，用流式细胞仪检测细胞周期。
实时荧光定量PCR实验具体如下：收集细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl2、细胞色素c和Caspase3的mRNA的相对表达量，mRNA的相对表达量按照公式2-ΔΔCt计算。
免疫印迹实验过程如下：将对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化后接种在6 cm培养皿中，第二天向培养皿中加入含有不同浓度的化合物，37 ℃孵育培养细胞。48 h后用细胞刮刀将细胞刮下，收集已经通过不同浓度化合物处理后的癌细胞，离心，弃上清，用PBS冲洗3次，离心弃上清，再加入500 μL RIPA细胞裂解液置于冰上进行细胞裂解，充分裂解细胞后，离心后取上清，得到蛋白样品。用BCA法测定其在 562 nm 处的吸光度值，制作标准曲线，计算出蛋白的浓度，根据所计算得蛋白浓度加入适量蛋白上样缓冲液，调节蛋白浓度为1 mg/mL。SDS-PAGE电泳后准备转模，将蛋白条带转印至PVDF膜上，标记后，放入5%脱脂奶粉中封闭1 h，再加入Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2和β-actin的一抗，4 ℃进行孵育过夜，过夜后，用PBST洗膜3次，再加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h后，再用PBST洗膜3次，在PVDF膜上加入适量的显影底物，在免疫印迹显影仪上显影。
统计学分析采用统计软件SPSS20.0进行分析，各实验组数据以平均数±标准差（means±S.E.M）表示，组间用*呈现差异度，以P<0.05表示统计学差异。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。
（1）抑制胃癌细胞凋亡机制研究
采用不同浓度的实施例1制得的化合物（1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）处理胃癌细胞SGC7901细胞系24 h，流式细胞周期分析如图1所示，细胞周期统计分析如图2所示。与未用药处理的细胞系相比，G0/G1和G2期细胞比例随着实施例1制得的化合物浓度增加逐渐减少，S期细胞比例逐渐增加，并且浓度越大趋势越明显，表明细胞阻滞出现在S期。
同样，不同浓度的实施例1制得的化合物（1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）作用于人胃癌细胞SGC7901细胞系24 h后，采用Annexin V-EGFP/PI法检测细胞凋亡率。检测了三次，结果见图3。进一步细胞凋亡统计分析结果如4所示。不同浓度的实施例1制得的化合物（1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）分别诱导了10.43±0.24%、23.54±1.46%和23.25±0.21% 的SGC7901细胞发生早期凋亡，均高于未药给对照组的3.98±0.0082%，差异有统计学意义（***P<0.001）。值得注意的是当实施例1制得的化合物的浓度是5μmol/L和10 μmol/L时，诱导SGC7901细胞发生早期凋亡的程度相差不大。
不同浓度的实施例1制得的化合物（1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）作用于人胃癌细胞SGC7901细胞系24 h后，TUNEL法检测细胞凋亡，如图5和图6显示，与对照组相比，实施例1制得的化合物对SGC7901胃癌细胞具有显著的促凋亡作用，实施例1制得的化合物（1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）处理组细胞凋亡明显，并且呈现明显的剂量依赖性。
不同浓度的实施例1制得的化合物（1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）作用于人胃癌细胞SGC7901细胞系24 h后，实时荧光定量PCR法检测BAX、BCL2、细胞色素c（cytC）mRNA表达水平的变化。如图7所示，与对照组相比，BAX、细胞色素c的mRNA 水平显著升高，BCL2的mRNA 水平显著降低，并且呈现明显的剂量依赖性。通过免疫印迹法检测BAX、BCL2、和Cleaved-Caspase3的蛋白水平变化（图8），处理后的SGC7901细胞，BAX和Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高，BCL2的蛋白表达水平降低，并且呈现明显的剂量依赖性。
免疫印迹分析不同浓度的实施例1制得的化合物 (10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)处理SGC7901细胞24 h后，MAPK和PI3K/AKT信号通路关键蛋白的变化情况。如图9所示，与对照组相比，实施例1制得的化合物处理后的SGC7901细胞，PI3K、ATK、ERK1/2的表达水平无显著性变化，p-PI3K、p-AKT和p-ERK表达水平呈降低的趋势，表明实施例1制得的化合物可能通过ERK、AKT和PI3K信号通路抑制细胞增殖。
（2）抑制人早幼粒白血病细胞凋亡机制研究
以不同浓度的实施例1制得的化合物（1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L）处理人早幼粒白血病HL60细胞系24 h，细胞周期分析如图10和图11所示，与对照细胞相比，随着实施例1制得的化合物浓度增加，G0/G1和G2期细胞比例逐渐减少，S期细胞比例逐渐增加，并且呈现剂量依赖性，表明细胞阻滞出现在S期。
实施例1制得的化合物 (1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L )作用人早幼粒白血病细胞HL60细胞系24 h后，Annexin V-EGFP/PI法检测细胞凋亡率。如图12和图13所示，实施例1制得的化合物(1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L )分别诱导6.63±0.65%、17.06±1.14%和18.57±0.95% HL60细胞发生早期凋亡，均显著高于对照组的3.16±0.21%。
实施例1制得的化合物(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L )作用人早幼粒白血病细胞HL60细胞系24 h 后，TUNEL 法检测细胞凋亡，如图14和图15显示，与对照组相比，实施例1制得的化合物对HL60细胞具有显著的促凋亡作用，实施例1制得的化合物(1 μmol/L、5μmol/L和10 μmol/L ) 处理组细胞凋亡明显，并且呈现明显的剂量依赖性。
以不同浓度的实施例1制得的化合物(1μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L )处理人早幼粒白血病HL60细胞系24 h后，实时荧光定量PCR法检测BAX、BCL2、细胞色素c mRNA表达水平的变化。如图16所示，与对照组相比，BAX、细胞色素c的mRNA水平随着处理浓度的升高显著上升，而BCL2的mRNA表达水平随处理浓度的增加显著降低。通过免疫印迹法检测BAX、BCL2、和Cleaved-Caspase3的蛋白水平变化（图17），处理后的HL60细胞，BAX和Cleavedcaspase-3 蛋白表达水平升高，BCL2的蛋白表达水平降低，并且呈现明显的剂量依赖性。
免疫印迹分析不同浓度的实施例1制得的化合物 (10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L)处理人早幼粒白血病HL60细胞系24 h后，MAPK和PI3K/AKT信号通路关键蛋白的变化情况。如图18所示，与对照组相比，实施例1制得的化合物处理后的HL60细胞，ERK和AKT的表达水平无显著性变化，PI3K、p-ERK、p-AKT和p-PI3K表达水平呈降低的趋势。初步表明实施例1制得的化合物通过ERK、AKT和PI3K信号通路抑制细胞增殖。
总体来说，实施例1制得的化合物处理胃癌细胞SGC7901和人早幼粒白血病细胞HL6024 h 后，可剂量依赖性抑制细胞增殖。Annexin V/PI双染法和TUNEL法显示随着药物浓度增加，SGC7901和HL60细胞凋亡明显增多。细胞周期分析表明细胞阻滞出现在S期。荧光定量和免疫印迹实验表明实施例1制得的化合物促进凋亡蛋白BAX的表达，抑制抗凋亡蛋白BCL2的表达，并且表现出明显的剂量效应，表明SGC7901和HL60细胞经过实施例1制得的化合物处理后激活了凋亡信号通路，促进了舌癌细胞的凋亡。通过免疫印迹实验证实实施例1制得的化合物有效抑制了PI3K、ATK和ERK的磷酸化水平，从而抑制MAPK/ERK和PI3K/ATK信号通路的激活。本研究初步确定了实施例1制得的化合物作为一种具有抗肿瘤活性药物制剂，能够有效抑制胃癌细胞SGC7901和人早幼粒白血病细胞HL60的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (8)
1.喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用，其特征在于，所述喹唑酮类化合物的结构如式I所示：式I。
2.根据权利要求1所述的喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用，其特征在于，所述喹唑酮类化合物由2-氨基-4-甲基苯甲酰胺与柠檬醛反应制得。
3.根据权利要求2所述的喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用，其特征在于，2-氨基-4-甲基苯甲酰胺与柠檬醛的摩尔比为（1-1.2）：1。
4.根据权利要求3所述的喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用，其特征在于，2-氨基-4-甲基苯甲酰胺与柠檬醛的摩尔比为1.2:1。
5.根据权利要求2所述的喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用，其特征在于，反应在二甲基亚砜溶剂中进行；反应温度为100 ℃-110 ℃。
6.根据权利要求2所述的喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用，其特征在于，反应完全后，分三批次，每批次依次加入饱和食盐水和乙酸乙酯，合并有机相，采用体积比为5:1的石油醚和乙酸乙酯组成洗脱液柱层析分离，得到所述喹唑酮类化合物。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的喹唑酮类化合物在制备治疗白血病和胃癌药物中的应用中的所述喹唑酮类化合物，还包括其它药学上可接受的辅剂。
8.根据权利要求7所述的一种药物组合物，其特征在于，所述辅剂为溶剂或载体。
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