CN116762958A

CN116762958A - 一种桑叶提取物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116762958A
Application number: CN202310717685.0A
Authority: CN
Inventors: 赵甜甜; 陈启荣; 陈章; 何桃萍; 张业辉; 张友胜; 焦文娟; 刘伟峰; 陈帅; 周芳
Original assignee: Guangzhou Kebesi Biotechnology Co ltd; Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Guangzhou Kebesi Biotechnology Co ltd; Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2023-06-16
Filing date: 2023-06-16
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明公开了一种桑叶提取物的制备方法，具体包括以下步骤：以干燥的桑叶为原料，进行水提，即得桑叶提取物。本发明制得的桑叶提取物具有显著的抑制脂肪再生能力(尤其是针对女性)，且具有减少肝脏脂肪的作用。

Description

一种桑叶提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及功能食品技术领域，更具体的说是涉及一种桑叶提取物及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着社会发展和人们对健康需求的日益增长，饮食已逐渐从温饱型向营养、健康和安全型转变。肥胖是全球最常见的公共卫生问题之一，也是代谢性疾病的主要危险因素，源于能量摄入和消耗之间的不平衡，最终表现为体内脂肪细胞的过度积累。

抑制脂肪细胞分化是控制肥胖的关键策略之一。脂肪组织的质量可以通过抑制成纤维前脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化(脂肪生成)和诱导脂肪组织中的凋亡来调节。尽管抗肥胖药物具有短期益处，但负面副作用和反弹性体重增加通常与它们的使用有关。因此，有必要对药物或健康食品进行新的研究，这些药物或食品对预防和治疗肥胖没有不良副作用。据报道，天然草药产品及其衍生物可用于治疗肥胖症，且无明显负面影响，近几十年来越来越受欢迎。许多植物化学物质，包括从桑叶、绿茶、可可茶、蓝莓皮和葡萄皮中提取的多酚、白藜芦醇、姜黄素、小檗碱、原花青素，在体外/体内证明了抗脂肪生成的效力，并且可以帮助治疗肥胖症而无副作用。多酚化合物存在于各种水果、蔬菜和种子中，这些物质的潜在抗癌、抗炎、抗氧化和抗菌特性表明，它们作为人类饮食中重要的营养补充剂具有重要价值。

桑叶为桑科桑属植物桑树的叶片，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，从古至今在中医临床上应用非常广泛。桑叶中生物碱1-DNJ通过抑制二糖分解酶活性，减少代谢过程中二糖在体内分解为单糖，二糖只有转化为单糖人体才能吸收，进而达到降血糖的功效。桑叶中所含黄酮类化合物的种类较多，如芦丁、槲皮素、异槲皮素、槲皮苦素和二氢山奈素等，它们除了具有较强的抗氧化作用外，在降血脂、降血压和抗癌防癌等方面也表现出了一定作用。桑叶多糖类主要由多单糖和二糖构成，通过对α-葡萄糖苷酶的抑制，促进β细胞分泌胰岛素，起到降血糖的作用。此外，桑叶中的多酚类物质是桑叶的重要活性物质之一，也具有很好的抗氧化活性，现代药理研究结果显示，桑叶多酚提取物具有降血脂、降血糖、清除氧自由基、抗动脉粥样硬化、延缓衰老等多种功能活性。

但是，现有的桑叶提取物专利首先未能明确桑叶品种，其次多集中于DNJ(一种桑叶生物碱)含量的提升，着重于降血糖功效，未能明确其在抑制脂肪再生方面的作用。

因此，如何开发一种能够抑制脂肪再生的桑叶提取物是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种桑叶提取物及其制备方法与应用。本发明围绕桑叶中生物活性成分的提取、分离、活性机制等方面进行研究，以期得到一种具有抑制脂肪再生和减脂功效的桑叶提取物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种桑叶提取物的制备方法，具体包括以下步骤：以干燥的桑叶为原料，进行水提，即得桑叶提取物。

进一步，上述桑叶的品种为粤椹大10或白玉王。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，粤椹大10为果用桑树品种，品种来源为大10母树，选育单位为广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，符合广东省农作物品种审定标准并审定通过，审定编号为粤审桑2006001。粤椹大10适宜广东省各地种植，产量较高，果粒大而多，糖度9％～14％，出汁率70％～84％，无籽，品质好，风味佳，经济性状好，适宜作水果鲜食及加工原料。

白玉王，中熟品种，海宁嫁接苗，树形开展，枝条粗壮，长势较慢，叶较大，花芽率高，果长3.5-4.0厘米，果径1.5厘米左右，长筒形，单果重4-10克，果色乳白色，有籽，汁多，甜味浓，含糖量高达20％，黄淮流域5月中下旬成熟，成熟期30天左右，亩产桑果1500斤左右，产桑叶2500斤左右。适应性强，抗旱耐寒，是一个大果型叶果兼用品种，桑果适合鲜食，也可加工，我国南北方均可露天种植。

进一步，上述桑干燥的方式为热风干燥。

采用上述进一步技术方案的有益效果在于，热风干燥又称“瞬间干燥”，是在烘箱或烘干室内吹入热风使空气流动加快的干燥方法。与一般的热风干燥具有以下优点：气固两相传热传质的表面积大；热效率高，干燥时间长，处理量大；气流干燥器结构简单，生产能力大，操作方便。

进一步，上述桑水提的温度为75℃。

进一步，上述桑水提的时间为6h。

一种上述制备方法制得的桑叶提取物。

一种上述桑叶提取物在制备抑制脂肪再生的食品或药物中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明制得的桑叶提取物具有显著的抑制脂肪再生能力(尤其是针对女性)，且具有减少肝脏脂肪的作用。

2、本发明明确发现了桑叶提取物的抑制脂肪再生能力与传统认知的DNJ含量不成正比，而且，本发明提取的最优方法仅为水提，对比传统工艺的有机试剂提取具有成本低廉和绿色环保等优势。

附图说明

图1为粤椹大10、菜桑、白玉王和塘10的实物图；

图2为不同样品的提取率；

图3为不同样品的总酚含量；

图4为不同样品的总糖含量；

图5为不同样品的DNJ含量；

图6为不同样品ABTS自由基清除能力；

图7为不同样品对脂肪细胞TG含量的影响；

图8为不同样品对脂肪细胞NFEA含量的影响；

图9为不同样品对脂肪细胞T-C含量的影响；

图10为不同样品油红O染色脂肪细胞(100X)；

图11为不同样品苏木素染色脂肪细胞细胞核(100X)；

图12为不同组别大鼠体型差异；

图13为不同组别对雌性大鼠体重增长率的影响；

图14为不同样品对肥胖雌鼠各部位脂肪含量的影响；

图15为不同样品对肥胖雌鼠脂肪比例的影响；

图16为不同样品对肥胖雌鼠脂肪比例的影响；

图17为不同处理组别肝脏HE染色图；

图18为不同处理组别对肥胖雌鼠血脂水平的影响；

图19为不同处理组别对肥胖雌鼠血脂水平的影响；

图20为不同处理组别对肥胖雌鼠脂肪组织的影响，其中，子宫周围脂肪的H&E染色(A)，棕色脂肪UCP1的免疫组化分析(B)和UCP1表达的强度和面积分析(C)；△：与NC组比较，P<0.05；△△：与NC组比较，P<0.01；**：与模型组比较，P<0.01；放大倍数为200倍；

图21为不同处理组别白色脂肪组织的转录组学分析，其中，(A)差异表达基因分析，(B)不同处理组的相关性分析，(C-E)分别描述Control vs Model、Model vs HB-W和Model vs HY-W的基因分布的火山图，(F)KEGG富集分析，(G)聚类分析；

图22为不同处理组别棕色脂肪组织的转录组学分析，其中，(A)差异表达基因分析，(B)不同处理组的相关性分析，(C-E)分别描述Control vs Model、Model vs HB-W和Model vs HY-W的基因分布的火山图，(F)KEGG富集分析，(G)聚类分析；

图23为不同处理组别的肠道菌群分析，其中，(A)α-指数分析，包括Chao1、Goods覆盖度、Simpson和Shannon，(B)PCA分析，(C)门级别的分类组成分析，(D)Firmicutes、Bacteroidetes以及Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)分析；△：与NC组比较，P<0.05；△△：与NC组比较，P<0.01；**：与模型组比较，P<0.01；放大倍数为200倍；

图24为不同处理组别的短链脂肪酸(SCFA)分析，包括总SCFA、丁酸、乙酸、丙酸、己酸、戊酸、异丁酸和异戊酸；△△：与NC组比较，P<0.01；*：与模型组比较，P<0.05；**：与模型组比较，P<0.01。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

桑叶提取物的制备方法，具体包括以下步骤：以热风干燥的粤椹大10桑叶为原料，以75℃水浸提6h，即得桑叶提取物。

实施例2

桑叶提取物的制备方法，具体包括以下步骤：以热风干燥的白玉王桑叶为原料，以75℃水浸提6h，即得桑叶提取物。

性能测试

一、原料处理

以粤椹大10(热风烘干、低温干燥)、菜桑、白玉王和塘10四种桑叶原料为研究对象，分别利用水提法、水+植物水解酶法和水+果胶酶法制备提取物并进行相关研究。

具体的，样品、干燥方式、提取方式和编号如表1所示。

表1样品、干燥方式、提取方式和编号

二、物质组成测定

(1)提取率测定

提取率(％)＝(提取物的质量/原始植物材料的质量)×100；其中，提取物的质量是指从植物材料中提取出来的目标物质的质量，原始植物材料的质量是指进行提取的起始材料的质量。

(2)总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu法测定总酚含量。根据样品的吸光度值和标准曲线，计算样品中总酚的含量。结果以没食子酸当量计算。

(3)总糖含量测定

采用苯酚硫酸法测定总糖含量。根据样品的吸光度值和标准曲线，计算样品中总糖的含量。结果以葡萄糖当量计算。

(4)DNJ含量测定

采用常规液相法测定提取物中DNJ含量。使用标准曲线校正峰面积，计算样品中DNJ的含量。

三、ABTS自由基清除能力

利用75mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)将空白对照组在734nm处的吸光值调整0.70±0.02。然后将所有样品由pH 7.4的75mM磷酸盐缓冲液稀释至合适浓度；取50μL样品溶液加入到150μL合适浓度的ABTS自由基溶液中，测定其在734nm处的吸光值，时间为30min，每隔5min采集一次数据。最终结果采用由Trolox当量μM TE/g抗氧化物表示。

四、抑制脂肪细胞实验

(1)细胞培养

小鼠前脂肪细胞3T3-L1细胞以5×10⁵个细胞/mL的速度接种在六孔板中，保存在含有10％(v/v)胎牛血清和1％抗生素的DMEM中，并在37℃下5％CO₂的增湿空气中培养。3T3-L1细胞的脂肪细胞分化是通过在含有胰岛素(10μg/mL)、0.5μM地塞米松(Dex)和0.5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)(分化诱导剂I)的DMEM培养基中培养3天，同时加入或不加入不同浓度的MLP(0-50μg/mL)来启动的。每隔一天用含有胰岛素(10μg/mL)(分化诱导因子II)的DMEM替换培养基，直到呈现成熟脂肪细胞表型，并且环形脂滴在细胞中生长。每次更换培养基时都添加MLP。该过程一直维持到第10天。

(2)脂肪细胞中甘油三酯、游离脂肪酸及胆固醇的含量测定

在有无样品的情况下，诱导3T3-L1细胞分化为脂肪细胞10天。细胞内总甘油三酯(TG)、细胞外游离脂肪酸(NFFA)和胆固醇(TC)水平通过实验室检测试剂盒进行测定。

(3)脂肪形态观察-油红O染色、苏木素染色

油红O染色是一种常用的方法，用于观察和鉴定细胞中的脂肪滴(脂肪颗粒)或中性脂肪。具体方法为：3T3-L1成熟脂肪细胞用10％甲醛固定1h。固定后，细胞在室温下用1mL油红O溶液(5mg/mL异丙醇)染色2h。接下来，用70％乙醇再次清洗两次，然后用纯水再清洗两次，去除所有未结合的污渍。在光学显微镜下(DMI 4000B/DFC 450C，德国莱卡)检查染色细胞，油红O染色细胞中的液滴被认为是脂质积聚的迹象。

苏木素染色可以染色细胞核成蓝色或紫色，帮助确定脂肪细胞中细胞核的形态和位置。具体方法为：3T3-L1细胞被固定在合适的培养容器中，然后用苏木素进行染色。通常在0.1％到0.5％的范围内的苏木素溶液被应用于完全覆盖固定的细胞。在室温下，让苏木素溶液在细胞上孵化5-15min后，轻轻地丢弃溶液。然后用蒸馏水或缓冲液多次冲洗细胞，以去除任何残留的苏木素。在显微镜下，细胞核呈紫色到蓝色，而细胞质呈红色到粉色，表明苏木素染色成功。

五、样品抑制肥胖雌鼠脂肪再生动物实验

(1)实验大鼠

SPF级4月龄健康雌性SD大鼠32只，正常组8只喂以普通饲料、造模组24只喂以高脂饲料。

(2)饲养条件

饲养环境：温度(23±2)℃，湿度(50±5)％。

高脂饲料按质量分数配方：基础饲料(78.8％)、猪油(10％)、蛋黄粉(10％)、胆固醇(1％)、胆盐(0.2％)，混合均匀后，加入蒸馏水搅拌均匀，使用烘烤箱烘干，在干燥、通风处保存。

(3)实验方法

16只雌性SD大鼠，按体重随机分为正常组4只喂以普通饲料、造模组12只喂以高脂饲料，动态检测大鼠体重和Lee.s指数，造模4周后，检测大鼠生化指标。根据大鼠体重、Lee.s指数和TG含量，建立营养性肥胖大鼠模型。造模成功后，将造模组随机平均分为模型组、HB-W(50mg/Kg bw)和HY-W(50mg/Kg bw)组，每组4只。用移液枪将样品均匀加入每次灌胃剂量药汁中摇晃均匀，加热至37℃进行灌胃。正常组、模型组每天给生理盐水，给药8周后结束。

(4)检测指标

测量体重信息，血清其脂质水平总胆固醇(TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及血清氧化应激状态(超氧化物歧化酶SOD和丙二醛MDA)，采用南京建成生物工程试剂盒和自动生化分析仪检测。

测量小鼠各部位脂肪组织重量、脂体比、Lee's指数、肝组织HE染色。

综合以上指标评价样品对肥胖雌鼠模型的抑制脂肪再生功效。

(5)补充检测

①免疫组化

棕色脂肪细胞UCP1免疫组化的一般步骤首先涉及将组织样本固定(例如，使用4％的甲醛)，然后用石蜡包埋，并将其切成5-10μm厚的切片。然后，切片需要去蜡和水化，这是通过二甲苯和醇等溶剂和一系列浓度递减的醇溶液完成的。接下来，通过在热水浴中处理切片(例如，在柠檬酸缓冲液中，pH 6.0，95-100℃，20-30min)，进行抗原修复，以使抗体可以更容易地接触和结合到其靶标抗原。然后使用适当的阻断液(如5％的牛血清白蛋白溶液)处理切片，以防止非特异性的抗体结合。切片随后与特异性针对UCP1的初级抗体孵育(如兔抗UCP1抗体)，通常在冷藏(4℃)条件下过夜，然后与相应的二抗孵育，这通常与荧光染料或酶(如辣根过氧化物酶)标记。如果使用酶标记的二抗，需要进行染色步骤，以便可视化抗体的结合。最后，使用显微镜观察和图像采集。

②脂肪组织的转录组分析

我们根据Lu等人的方法进行了不同处理组中的白色和棕色脂肪组织的RNA-Seq分析(Lu,J.；Yang,Y.；Varga,E.；Marko,D.；Yu,Q.；Xie,J.；Li,C.；Chen,Y.MolecularMechanisms Associated with Protecting IEC-6Cells from Acrylamide-InducedTight Junction Damage by Ganoderma Atrum Polysaccharide.2023,2200774,1–11.)。变异表达基因(DEGsq)被鉴定为Fold Change(FC)>2且P值<0.05的转录本。皮尔逊相关系数被用来衡量样本间基因表达水平的相关性。相关系数越接近1，样本间的表达模式相似性就越高。利用R语言(ggplots2)实现了火山图，FC>2且P值<0.05。X轴代表log2FC，而Y轴代表基于10的负对数显著性水平。利用R编程语言和热图包进行了双向聚类分析。该分析涉及所有比较组和样本的差异基因。聚类是基于样本间的基因表达水平和每个样本内的表达模式。用欧氏方法计算距离，并应用完全链接进行层次聚类。使用clusterProfiler进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。在分析过程中，用带有KEGG路径注释的差异表达基因来计算每个路径的基因列表和基因计数。使用超几何分布方法计算P值，P值<0.05的路径被认为显著富集。以上所有的步骤都是基于genecloud平台(https://www.genescloud.cn)进行的。

③不同组别雌性大鼠的肠道微生物群分析

肠道微生物DNA的提取和测序是根据张等人的方法进行的(Zhang,Y.；Islam,M.；Gao,C.；Cheng,Y.Ozone Reduces the Fruit Decay of Postharvest Winter Jujube byAltering the Microbial Community Structure on FruitSurface.Microbiol.Res.2022,262(January),127110.)。使用R语言(QIIME2(2019.4))计算α指数，包括Chao 1、Goods覆盖率、Simpson和Shannon。箱线图用于直观地显示不同样本组之间的α多样性差异。差异的显著性可以使用Kruskal-Wallis秩和检验和Dunn's检验作为事后检验来验证。PCA分析和分类组成分析是基于genecloud平台(https://www.genescloud.cn)进行的。PCR产物在中国上海Personal Biotechnology的IlluminaMiSeq/NovaSeq平台上进行测序。

④不同组别雌性大鼠的短链脂肪酸(SCFA)分析

SCFA分析是使用气相色谱-质谱法进行的。样品在冰上解冻，取出30mg的样品放入2mL的玻璃离心管中。加入900μL的0.5％磷酸进行重组，然后剧烈摇晃2min。随后，以14,000g离心10min，收集800μL的上清液。加入等体积的乙酸乙酯进行提取，然后剧烈摇晃2min。在14,000g离心10min后，取上层有机相600μL。加入最终浓度为500μM的4-甲基戊酸作为内标。将溶液混合均匀，转移到自动取样瓶中，供后续GC-MS分析。样品导入时，使用10:1的分流比将混合物1μL注入仪器。标准样品包括醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸。分别以乙酸乙酯制备这些酸的0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL的溶液，制备一系列八个混合标准浓度梯度。

气相色谱条件：样品使用安捷伦DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mmID×0.25μm)在气相色谱系统中分析。温度程序设置如下：初始温度90℃，以10℃/min的速度升至120℃，再以5℃/min的速度升至150℃，最后以25℃/min的速度升至250℃，保持2min。作为载气的氦气流速为1.0mL/min。在样品队列中，定期放置QC(质量控制)样品，监测和评估系统的稳定性和重复性。

质谱条件：采用Agilent 7890A/5975C气-质联用仪进行质谱分析。进样口温度250℃；离子源温度230℃；传输线温度250℃，四极杆温度150℃。电子轰击电离(EI)源，全扫及SIM扫描方式,电子能量70eV。

六、结果与分析

(1)提取率

不同样品的提取率如图2所示。

由图2可知，组间提取率，粤椹大10的提取率>塘10>菜桑>白玉王>大10s。而组内结果来看，粤椹大10，白玉王及塘10品种呈现果胶酶辅助提取的提取率>其他两种提取方法，而菜桑及大10s则是植物酶辅助提取率高于其他两种提取方法。

以上试验说明，酶辅助的提取率效果较好。

(2)总酚含量

不同样品的总酚含量如图3所示。

由图3可知，不同原料及提取方法得到的提取物的总酚含量差异较大。其中，总酚含量最高的为塘10水提物。在所有的提取方式中，低温干燥的粤椹大10样品(FY)的各提取方式均得到较低的总酚含量。菜桑的各提取方式得到的总酚含量相对较高。但是，总酚含量仅反映提取物中酚类物质含量，与其活性之间的相关性需进一步利用活性测定结果进行评估。

(3)总糖含量

不同样品的总糖含量如图4所示。

由图4可知，不同样品的总糖含量也呈现出差异性。由组间差异可以看到，总糖含量最高的样品为菜桑(HC)，其次为塘10样品(HT)，其他样品的总糖含量较为接近，最低的为白玉王样品。而在组内的分析中可以看到，总糖含量的差异与提取方式的相关性较低。

(4)DNJ含量

不同样品的DNJ含量如图5所示。

由图5可知，不同样品的DNJ含量呈现出较大的差异。由组间结果可知，DNJ含量由高到低依次是塘10>菜桑>粤椹大10>白玉王>低温烘干粤椹大10。由组内结果可知，不同提取手段对样品中的DNJ含量有较小的影响，其中酶辅助提取效果优于水提手段。

(5)ABTS自由基清除能力

不同样品ABTS自由基清除能力如图6所示。

由图6可知，不同提取物的抗氧化能力具有显著差异，但与总酚含量呈正相关。其中，抗氧化效果最好的是塘10，其次是菜桑，效果最差的的是低温烘干粤椹大10样品。

综合上述指标，选取HY-W、HC-W、HB-P、HB-W、DY-P及HT-W为细胞实验的研究对象。

(6)样品对脂肪细胞TG含量的影响

不同样品对脂肪细胞TG含量的影响如图7所示。

由图7可知，与正常组相比，模型组细胞中TG含量显著升高，而HY-W(P<0.05)，HC-W(P<0.05)及HB-W(P<0.01)可显著降低细胞中的TG含量。

(7)样品对脂肪细胞NEFA含量的影响

不同样品对脂肪细胞NFEA含量的影响如图8所示。

由图8可知，与正常组相比，模型组细胞中NEFA含量显著升高，除HT-W外，其他样品处理均可显著降低细胞中的NEFA含量(P<0.01)。

(8)样品对脂肪细胞T-C含量的影响

不同样品对脂肪细胞T-C含量的影响如图9所示。

由图9可知，与正常组相比，模型组细胞中T-C含量显著升高，处理组中，HY-W和HB-W能够显著降低脂肪细胞的T-C含量。其中，HB-W的活性优于HY-W。

(9)样品对脂肪滴的影响

1)油红O染色

不同样品油红O染色脂肪细胞(100X)如图10所示。

由图10可知，模型组中油滴明显，不同处理样品可不同程度的降低脂肪细胞中的脂肪含量。其中，HB-P、HT-W、HC-W、HB-W等样品具有较好的抑制脂肪形成的效果。

2)苏木素染色

不同样品苏木素染色脂肪细胞细胞核(100X)如图11所示。

由图11可知，样品对脂肪细胞的抑制作用由高到低依次是HY-W>HB-W>HB-P>HC-W>DY-P>HT-W。

综合上述结果，HY-W和HB-W具有较好的抑制脂肪再生的能力。

(10)样品对肥胖雌鼠体型的影响

不同组别大鼠体型差异如图12所示。

由图12可知，与正常组相比，模型组出现较明显的肥胖现象，尤其在腹部。而不同处理组别可以显著改善肥胖体型。

(11)样品对肥胖雌鼠体重增长率的影响

不同组别对雌性大鼠体重增长率的影响如图13所示。

由图13可知，与正常组相比，模型组的体重增长率显著增加，表明肥胖雌鼠模型造模成功。与模型组相比，HB-W(P<0.01)和HY-W(P<0.05)两个处理组别均可显著降低高脂饲料饲喂雌性大鼠的体重增长率。

以上试验说明，HB-W和HY-W具有显著的减重功效。

(12)样品对肥胖雌鼠各部位脂肪的影响

棕色脂肪是一种特殊类型的脂肪组织，含有丰富的线粒体和血管。它的主要功能是产生热量(热能代谢)以维持体温稳定，这是通过调节线粒体中的特殊蛋白质(UCP1，即褐色脂肪细胞特异性线粒体蛋白1)实现的。白色脂肪是最常见的脂肪组织，它主要负责能量储存和脂肪代谢。白色脂肪细胞内含有一个大的脂肪滴，用于储存脂肪酸和甘油。白色脂肪主要分布在皮下组织、内脏器官周围和腹腔中。

不同样品对肥胖雌鼠各部位脂肪含量的影响如图14所示。不同样品对肥胖雌鼠脂肪比例的影响如图15所示。

由图14结果可知，模型组的腹腔脂肪，子宫附近脂肪和总白色脂肪显著高于对照组。而不同的样品处理组可一定程度上降低白色脂肪含量，其中对总脂肪含量来说，HB-W(P<0.01)和HY-W(P<0.05)处理组别均呈现出显著的下降趋势。

由图15脂肪比例的结果可知，与正常组相比，模型组的棕色/白色脂肪比例显著下降(P<0.01)。

以上试验说明，能够耗能的棕色脂肪比例下降，样品组的处理可以有一定程度的提升，但并无显著性差异。

(13)样品对肥胖雌鼠各部位脂肪的影响

由白色脂肪与体重的比值可知，与正常组相比，模型组的白色脂肪比例显著提升，表明了脂肪的显著堆积(P<0.01)，HB-W处理组白色脂肪再生具有显著的抑制能力。

(14)样品对肥胖雌鼠lee's指数的影响

Lee's指数是指一种用于评估肥胖程度的指数，它是根据腰围(cm)/髋围(cm)×体重(kg)计算得到，Lee's指数值越高，表示腰围相对于髋围和体重更大，可能提示腹部肥胖和内脏脂肪堆积的风险增加。

不同样品对肥胖雌鼠脂肪比例的影响如图16所示。

由图16可知，与正常组相比，模型组的Lee's指数相对较高，而不同的处理组别可以不同程度的降低大鼠的lee's指数。

以上试验说明，样品具有较好的减脂功效。

(15)样品对肥胖雌鼠肝脏的影响

不同处理组别肝脏HE染色图如图17所示。

由图17可知，高脂饲料饲喂后的模型组肝脏组织出现病变，而样品处理组别可显著改善肥胖鼠的肝脏情况。

以上试验说明，样品在减脂的同时能够对肝脏提供一定的保护作用。

(16)样品对肥胖雌鼠血脂水平的影响

不同处理组别对肥胖雌鼠血脂水平的影响如图18所示。

由图18结果可知，与正常组相比，模型组的血脂指标(TG,CHO,HDL-C和LDL-C)均呈现显著的提升，表明高脂饲料导致肥胖雌鼠血脂异常。而不同的处理组别可在一定程度上改善肥胖鼠的血脂水平。HB-W处理组别可显著降低肥胖雌鼠血液TG，HDL-C，和LDL-C水平。而HY-W可显著降低HDL-C和LDL-C水平。对于CHO来说，尽管样品处理组与模型组没有显著差异(P>0.05)，但呈现出下降的趋势。

以上试验说明，样品对肥胖鼠血脂具有积极的调控作用。

(17)样品对肥胖雌鼠血清氧化应激水平的影响

不同处理组别对肥胖雌鼠血脂水平的影响如图19所示。

由图19结果可知，与正常组相比，模型组血清中SOD含量显著下降(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.05)，结果表明高脂饲料饮食会导致肥胖鼠血清氧化应激水平的改变，进而可能导致其他病变。而HB-W处理组别可显著提升血清SOD含量(P<0.01)。HY-W对SOD含量具有显著的提升作用(P<0.01)，而对MDA水平具有显著的抑制作用(P<0.05)。

以上试验说明，样品对血清氧化应激水平具有一定的调控作用。

(18)UCP1表达分析

图20中检查了HB-W和HY-W对高脂饮食诱导的肥胖雌性大鼠脂肪组织的影响。通过使用HE和IHC染色评估组织学变化和巨噬细胞浸润，以评估脂肪组织的变化。

对照组显示了规则排列的脂肪细胞，而高脂饮食诱导的大鼠模型显示脂肪细胞中的细胞肿胀，核浓缩和细胞破裂，这表明可能存在组织炎症。与HY-W相比，HB-W的给药显示出对脂肪组织缺损的优越缓解效果。

在图20B和图20C中，与对照组(强度为39255.45±879.14)相比，模型组棕色脂肪组织中UCP1的表达显著降低(强度为15061.88±1106.02，P<0.01)，而用HB-W(强度为47289.04±2933.93，P<0.01)和HY-W(强度为31100.63±1431.88，P<0.01)处理显著上调了高脂饮食诱导的肥胖雌性大鼠中UCP1的表达。面积％结果表明，与HY-W相比，HB-W表现出更强的增加UCP1含量。UCP1是在棕色脂肪组织中发现的一种蛋白质，它通过解耦线粒体呼吸和ATP合成来产生热量。在棕色脂肪组织中激活UCP1具有增加能量消耗和改善代谢健康的潜力。尽管处理组之间棕色脂肪组织的重量没有显著差异，但是MLEs的给药，特别是HB-W，显著上调了UCP1的表达。

与之前在雄性大鼠中进行的研究一致，大多数研究报告称MLEs通过调节棕色脂肪组织来产生抗肥胖效果。然而，我们在雌性大鼠中的发现呈现出部分相反的结果。当考虑到图20中的结果时，可以明显看出MLEs对白色脂肪组织而不是棕色脂肪组织展现出有利的抑制效应。尽管如此，HB-W的UCP1调节效果表明了其在脂肪组织有益调节方面的增强。这些观察结果与Kim等人的研究相符，他们也报告说牛磺酸通过抑制高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中的白色脂肪组织而不是棕色脂肪组织中的脂肪生成，从而产生抗肥胖效果，这支持了我们的发现。我们将进一步进行调查，以探索HB-W和HY-W中可能负责观察到的脂肪组织效果差异的特定成分。

(19)转录组分析

脂肪组织的转录调控提供了对脂肪细胞生物学、代谢调控、脂肪因子产生、炎症、免疫反应以及表观遗传修饰的理解，从而有助于我们理解脂肪组织的功能和相关疾病。不同处理组的白色和棕色脂肪组织中差异基因的结果分别在图21和图22中展示。

在白色脂肪组织的转录分析中(图21)，与对照组相比，共观察到215个基因下调(图21A)，这一趋势在HY-W和HB-W处理后显著逆转。此外，通过比较对照组和模型组，我们在KEGG途径中鉴定出一些与脂肪组织功能相关的途径(图21F)。这些途径包括脂肪酸降解、甘油磷脂代谢和过氧物酶体增殖活化受体(PPAR)信号通路等。在模型组和HB-W处理组之间的对比中，注意到富集了与脂质/脂肪酸代谢相关的途径以及PPAR通路。相反，模型组和HY-W处理组之间的比较揭示了与胆固醇代谢、甘油磷脂代谢以及某些与炎症相关的通路相关的明显途径。在进行差异基因分析时，在模型组和对照组的比较中鉴定出了几个与脂质代谢相关的关键基因。这些基因，即Pla2g2a、Plac8和Hmgcs2，在模型组中显著下调(|log2FC|>1and Padj<0.05)。此外，在模型与HB-W组的比较中，如Pla2g2a和Plac8等基因被注意到是上调的。此外，与炎症相关的基因Itgb2，也表现出上调的表达模式。相比之下，在模型与HY-W组的比较中鉴定的关键基因是Nr1d1，这是一个与细胞葡萄糖稳态和炎症有关的基因。这些发现总体上表明，HB-W治疗可能对白色脂肪组织中的脂质代谢基因调控产生更明显的影响。这一观察与来自集群分析的结果(图21G)是一致的。

至于棕色脂肪组织的转录分析(图22)，我们注意到基因数量的差异(图22A-C)，这意味着关键基因得到了调控。根据KEGG通路分析，与胆固醇代谢和炎症相关的通路在模型组与对照组的比较中明显，这种趋势也在治疗组(模型组对HB-W/HY-W)中观察到。这一观察结果与组织重量结果相符，表明本研究中棕色脂肪组织的调控不显著。此外，显示高差异表达(|log2FC|>1和Padj<0.05)的关键基因较少被注意到。当我们将|log2FC|>1和P<0.05作为显著性的标准时，我们观察到与葡萄糖代谢相关的基因被HY-W治疗显著调控。这些基因包括Il1b,Slc27a1(参与胰岛素抵抗和PPAR信号通路)、Slc27a3,Srebf1等。相反，在模型组与HB-W组的比较中，只鉴定出少数与脂质代谢相关的关键基因。

这些发现总体上表明两个关键点：(1)HB-W在调控白色脂肪组织方面似乎更有效。(2)HY-W可能在调节血糖水平方面有潜在的影响，为糖尿病管理提供了一个有前景的途径。

(20)HB-W和HY-W对肥胖雌性大鼠肠道菌群调控的影响

本研究的多样性分析使用了Chao1指数来表示丰富度，Shannon指数来表示多样性，并用Good's覆盖率指数来表示覆盖率。如图23A所示，在四种不同类型的α指数中未观察到显著差异，这表明总体多样性相当。然而，通过PCA结果中的不同聚类模式，观察到各个处理组肠道菌群多样性的一些变化(图23B)。模型组的肠道菌群组成与对照组、HB-W组和HY-W治疗组有显著差异。为了探索肠道菌群的相对丰度变化，我们进行了门级别的分类组成分析(图23C)。结果显示，不同处理组在门级别(包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、膜壁菌门、变形菌门、TM7等)的变化各异。尽管厚壁菌的含量没有显著差异(P>0.05)，但与对照组相比，模型组的拟杆菌相对丰度显著降低(P<0.05)，而HB-W的处理则上调了拟杆菌的丰度。此外，模型组的F/B比例与对照组相比显著增加。

肠道菌群失调已被认为与许多代谢性疾病的发病有关，包括肥胖症、糖尿病等。与以往的研究一致，我们的研究发现，肥胖(ob/ob)小鼠的F/B比例显著升高，这是肥胖症的公认标志，强调了肠道菌群组成在肥胖相关研究中的相关性。此外，HB-W的治疗能显著改变这个比例，表明它对肥胖相关的肠道菌群调控有积极的影响。这与Sheng等人的研究相吻合。除此之外，拟杆菌已被报道在调节宿主能量代谢上有效，并且其中一些与肥胖呈负相关。在本研究中，HB-W也能提高拟杆菌的丰度，这可能导致其对肥胖调控有益。

(21)HB-W和HY-W对肥胖雌性大鼠SCFA变化的影响

短链脂肪酸(SCFA)的产生和代谢变化已被认为与肥胖的发展和进展有关，可能影响能量平衡、脂肪度和代谢健康。如图24所示，不同组的总SCFA含量没有显著差异(P>0.05)。然而，与对照组相比，模型组的丁酸、丙酸、己酸含量显著降低(P<0.05)，而戊酸、异丁酸和异戊酸的含量显著增加(P<0.05)。HB-W的投给能显著上调丁酸(从模型组的129.16±44.29μg/g提高到1073.11±419.69μg/g)和己酸(从模型组的43.53±6.72μg/g提高到344.03±4.40μg/g)的含量，并显著下调(P<0.01)戊酸(从模型组的668.28±107.07μg/g降至366.43±78.87μg/g)、异丁酸(从模型组的962.03±70.58μg/g降至65.01±27.82μg/g)和异戊酸的水平。在HY-W处理的大鼠中也观察到了相同的效果。这些表明，HB-W和HY-W在调控SCFA方面表现出积极的效果。微生物群落的变化可以影响短链脂肪酸(SCFAs)的产生，从而影响能量、代谢、炎症、食欲和脂肪储存的调节。丁酸是结肠细胞的主要能源，可以增强肠道屏障的功能和紧密连接蛋白的表达。此外，丙酸和丁酸已被证实能刺激饱腹激素(如GLP-1和PYY)的释放，增加饱腹感和满足感。以前，已发现己酸可以展示对动物菌群失调和病原细菌增殖的保护效果，以及改善人类炎症的效果。模型组这些SCFAs的减少表明高脂肪饮食诱导了雌性大鼠的体重增加和炎症状态。此外，HB-W和HY-W的补充可以显著增加某些SCFAs的含量，显示出对肥胖大鼠的缓解效果。在之前的研究中也观察到了同样的效果，该研究显示了植物乳杆菌Y44对高脂饮食喂养的肥胖小鼠脂质代谢的改善效果。支链短链脂肪酸(BSCFA)主要包括异丁酸和异戊酸。Dabek-Drobny等人的观察提出，异丁酸的浓度升高可能归因于过度体重。此外，他们报告说，异戊酸的水平降低可能是炎性肠病(IBD)患者营养不良的指标。在我们的研究中，我们发现高脂肪饮食的大鼠的异戊酸和异丁酸含量显著增加，这可以通过HB-W和HY-W的治疗显著减少。然而，所有接受高脂肪饮食治疗的大鼠戊酸的增加与Dabek-Drobny在IBD患者中的报告不符。然而，在另一项涉及32个中心性肥胖和17个瘦弱个体的初步研究中，Rahman等人报告，相对于瘦弱的个体，中心性肥胖的个体所有SCFAs(包括醋酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸)的平均浓度显著增加。这些发现强调了肠道微生物群落改变对SCFAs多样性的影响，导致不同组之间的水平显著改变，这与以前的研究一致。

结论：本发明明确了两款原料粤椹大10烘干工艺热水提取以及白玉王烘干工艺热水提取得到的样品具有较好的抑制脂肪再生的功效，但是不限于这两种品种和提取工艺。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种桑叶提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：以干燥的桑叶为原料，进行水提，即得所述桑叶提取物。

2.根据权利要求1所述的一种桑叶提取物的制备方法，其特征在于，所述桑叶的品种为粤椹大10或白玉王。

3.根据权利要求1所述的一种桑叶提取物的制备方法，其特征在于，所述干燥的方式为热风干燥。

4.根据权利要求1所述的一种桑叶提取物的制备方法，其特征在于，所述水提的温度为75℃。

5.根据权利要求1所述的一种桑叶提取物的制备方法，其特征在于，所述水提的时间为6h。

6.一种如权利要求1-5任一项所述制备方法制得的桑叶提取物。

7.一种如权利要求6所述桑叶提取物在制备抑制脂肪再生的食品或药物中的应用。